Piattaforma microfluidica per la misurazione dei neutrofili Chemiotassi dal Lordo Sangue intero

Riepilogo

Dettagli Questo protocollo un saggio progettato per misurare la chemiotassi dei neutrofili umani da una gocciolina di sangue intero con robusto riproducibilità. Questo approccio elude la necessità di una separazione dei neutrofili e richiede solo pochi minuti di dosaggio tempo di preparazione. Il chip microfluidica consente la misura ripetuta di chemiotassi dei neutrofili nel tempo nei neonati o piccoli mammiferi, dove il volume del campione è limitata.

Abstract

I neutrofili hanno un ruolo essenziale nella protezione contro le infezioni e il loro numero nel sangue sono spesso misurato in clinica. Superiore conta dei neutrofili nel sangue sono di solito un indicatore di infezioni in corso, mentre una bassa conta di neutrofili sono un segnale di avvertimento per i rischi più elevati per le infezioni. Per realizzare le loro funzioni, neutrofili devono anche essere in grado di spostare efficacemente dal sangue dove trascorrono la maggior parte della loro vita, nei tessuti, dove si verificano infezioni. Di conseguenza, eventuali difetti nella capacità dei neutrofili di migrare può aumentare il rischio di infezioni, anche quando sono presenti in numero appropriato nel sangue neutrofili. Tuttavia, la misurazione dei neutrofili capacità di migrazione nella clinica è un compito impegnativo, che richiede tempo, richiede grandi quantità di sangue, e conoscenze specifiche. Per far fronte a queste limitazioni, abbiamo progettato un robusto saggi microfluidica per la migrazione dei neutrofili, che richiede una singola goccia di sangue non trasformati, circumsfiati la necessità di una separazione dei neutrofili, ed è facile da quantificare su un semplice microscopio. In questo saggio, neutrofili migrano direttamente dalla gocciolina di sangue, attraverso piccoli canali, verso la sorgente di chemiotattico. Per impedire il flusso granulare di globuli rossi attraverso gli stessi canali, abbiamo implementato filtri meccanici con virata a gomito che bloccare selettivamente l'anticipo di globuli rossi. Abbiamo convalidato il test confrontando la migrazione dei neutrofili dalle gocce di sangue raccolti da dito cazzo e sangue venoso. Abbiamo anche confrontato questi sangue intero (WB) fonti di migrazione dei neutrofili da campioni di neutrofili purificati e abbiamo trovato la velocità costante e la direzionalità tra le tre fonti. Questa piattaforma microfluidica consentirà lo studio della migrazione dei neutrofili umana in clinica e l'impostazione della ricerca per far progredire la nostra comprensione delle funzioni dei neutrofili nella salute e nella malattia.

Introduzione

Traffico neutrofili svolge un ruolo critico nel determinare l'avanzamento e la risoluzione di molte condizioni infiammatorie, tra aterosclerosi ^1, infezione batterica o sepsi ^2, e ustioni ^3. Per il loro importante contributo alle condizioni di salute e di malattia, conta dei neutrofili è parte dello standard di analisi del sangue spesso considerati nei laboratori clinici e di ricerca. Tuttavia, pur essendo una delle prove più diffusi, il valore di conteggio dei neutrofili nella diagnosi di infezione e sepsi è stato spesso interrogato ^4. Per esempio, uno studio dei neutrofili in pazienti ustionati rivelato che conta dei neutrofili e la funzione di migrazione dei neutrofili non sono correlati; a significare che conta dei neutrofili da solo non è un indicatore accurato dello stato immunitario ^3. Anche se più difficile da misurare, competenza funzionale dei neutrofili è stato proposto come più importante in una vasta gamma di condizioni.

t "> È importante sottolineare che molti dei difetti neutrofili sono transitori e non sono attivati ​​da difetti genetici permanenti, una distinzione che è stato ampiamente trascurato nella clinica fino a poco tempo. Nell'ambito di ustioni, la migrazione dei neutrofili potrebbe essere monitorato nel corso di trattamento di un paziente come indicatore di stato infiammatorio o infezione ^3. saggi di migrazione tradizionali attualmente utilizzati in laboratorio (camera di Boyden, camera Dunn, micropipetta dosaggio) non può essere tradotto in un ambiente clinico perché richiedono grandi volumi di sangue ed ingombrante in termini di tempo tecniche di isolamento dei neutrofili (Tabella 1). Questi test inoltre non possono essere utilizzati per monitorare i cambiamenti transitori chemiotassi dei neutrofili nei piccoli animali da laboratorio, come topi, in quanto il volume di sangue necessario per l'isolamento dei neutrofili consente solo un campione e spesso richiede anche messa in comune di sangue da più animali per un singolo test. Per esempio, uno studio condotto mcondizioni ultiple e trattamenti in più punti temporali potrebbero potenzialmente richiedere migliaia di topi utilizzando saggi di chemiotassi correnti. Questo limita la ricerca biologica di base che può essere fatto di comprendere le complesse dinamiche della funzione immunitaria nel contesto di lesioni, infezioni o bruciare spesso studiato in modelli murini ^5.

Per rispondere all'esigenza di un saggio funzionale neutrofili che è rapido, robusto, pur richiedendo il minimo volume di sangue, abbiamo sviluppato un dispositivo microfluidico che misura la chemiotassi dei neutrofili direttamente da una piccola goccia di sangue intero. E 'noto che molti fattori di sangue intero, compreso il siero ⁶ e ⁷ piastrine, influenzano la funzione dei neutrofili. È quindi utile che l'intero saggio microfluidico sangue minimizza trattamento del campione per mantenere il microambiente in vivo del neutrofilo quando si misurano variazioni di chemiotassi con una prova in vitro ^8. Questo approccioriduce il tempo di raccolta del sangue a neutrofili test di migrazione da ore utilizzando tecniche tradizionali, a pochi minuti (Tabella 1). Dell'intera piattaforma microfluidica sangue produce un gradiente chemiotattico lineare stabile per la durata dell'esperimento, non ha parti in movimento, e non richiede una sorgente di pressione esterna (cioè pompa a siringa). La caratteristica fondamentale nella progettazione dell'intero dispositivo microfluidica sangue è l'incorporazione di un globulo rosso (RBC) pettine filtrazione che filtra meccanicamente eritrociti di entrare nel canale migrazione del dispositivo. Il diritto giri di questo pettine filtrazione evitano la necessità di filtrazione esclusione dimensioni, che sarebbe probabilmente essere intasato da globuli rossi e quindi bloccano il gradiente chemiotattico di raggiungere i neutrofili migrano attivamente nel WB. L'incorporazione dell'intero dispositivo microfluidica sangue in una piastra 12 o 24 pozzetti facilita la proiezione di diversi mediatori di Si chemiotassi neutrofila umana o murinamultaneamente.

Protocollo

1. Fabbricazione di dispositivi Microfluidic

1. Utilizzando tecniche fotolitografiche standard fabbricare il maestro stampo wafer in una camera pulita di classe 1000. Reticolo i primi 3 micron-sottile strato di fotoresist negativo a base epossidica per definire i canali di migrazione secondo le istruzioni del produttore. Reticolo secondo strato 50 micron di spessore per definire le camere cellulare carico e chemochine.
2. Utilizzare il wafer fantasia di lanciare dispositivi (PDMS) polidimetilsilossano. Agitare vigorosamente PDMS (20 g) con iniziatore (2 g) per 5 minuti usando forchetta di plastica in grande vassoio pesatura plastica.
3. Versare cautamente PDMS sulla muffa.
4. Degassarla PDMS mettendo stampo con PDMS riversato in un essiccatore a vuoto per 1 ora.
5. Cuocere e curare dispositivi microfluidici PDMS per almeno 3 ore in forno a 65 ° C.
6. Punch i WBLCs centrali con un perforatore con un diametro della punta di 1,5 mm.
7. Punch out interi dispositivi a forma di ciambella con un punclei con un diametro della punta di 5,0 mm.
8. Rimuovere le particelle da dispositivi a ciambella con del nastro adesivo.
9. Risciacquare una piastra 12 pozzetti con acqua deionizzata e poi asciugare con azoto. Posizionare la piastra in 60 ° C forno per 5 min.
10. Ossigeno plasma trattare la piastra 12 pozzetti due volte; una volta sola per 35 secondi e poi di nuovo con i dispositivi ciambella per un altro 35 sec.
11. Posizionare con cura i dispositivi nei pozzetti della piastra con una pinzetta.
12. Piatto Cuocere con i dispositivi aderenti, su una piastra calda impostato a 80 ° C per 10 min.

2. Microfluidic saggio Preparazione

1. Dispositivi microfluidici Prime immediatamente dopo il trattamento al plasma di ossigeno, quando il dispositivo è idrofilo ed effetti capillari può favorire l'innesco dei piccoli canali nel dispositivo.
2. Crea soluzione chemoattractant mescolando 5 ml fMLP [soluzione stock 10 mM] con 5 microlitri fibronectina [soluzione stock 1 mg / ml] e 490 microlitri HBSS.
3. Lentamente pipetta & #160; soluzione chemoattractant in WBLC, con una punta di gel di carico (Figura 1A). Pipettare altri 20 ml di fattore chemiotattico intorno alla parte esterna del dispositivo.
4. Posizionare la piastra in un essiccatore per 15 minuti. Applicando un vuoto al dispositivo, la soluzione viene instillata laterali canali del dispositivo e l'aria spostata diffusa attraverso il PDMS.
5. Rimuovere la piastra di essiccatore e confermare la bagnatura del canale dispositivo sotto il microscopio. Guarda come la bolla diventa più piccolo come soluzione chemoattractant entra nella camera. Nessuna bolla dovrebbe essere presente all'interno del dispositivo dopo trattamento sottovuoto.
6. Lavare la WBLC e al di fuori del dispositivo a fondo per rimuovere la soluzione in eccesso chemoattractant. Questo passaggio genera un gradiente di chemiotattico da ciascuna delle camere chemiotattici focali (FCC) al centro del dispositivo.
   1. Riempire una siringa da 1 ml con PBS, aggiungere una punta di ago smussato 30 G per siringa. Delicatamente, inserire la punta dell'ago della siringa inal centro del foro ciambella. Spingere delicatamente 100 ml di PBS nel foro in modo che una goccia di forme PBS sulla parte superiore del dispositivo.
   2. Piastra Tilt e Pipettare 1 ml di PBS intorno dispositivo in modo che il liquido si raccoglie sul fondo del pozzo. Aspirare il liquido di processo e ripetere per un totale di 3x con soluzione tampone fresco (uso dei media al posto del tampone se verranno caricati i neutrofili separate in media) ^9.
7. Riempire ogni pozzetto con i media fino alle cime dei dispositivi sono sommerse sotto liquido. Lasciare che i dispositivi riposare per 15 min per permettere gradiente di stabilizzarsi. Risultati sperimentali e dati teorici di simulazioni agli elementi finiti mostrano che i gradienti di questi dispositivi sono stabili fino a 24 ore per le piccole molecole (ad esempio, fMLP) e fino a diversi giorni per peso molecolare più grande (ad esempio, IL8).
8. Usando le punte gel di carico, lentamente pipetta 2 ml di sangue (o neutrofili isolati) in ciascun tutta loa sangueding camera (WBLC) (Figura 1A).

3. Preparazione del campione

I neutrofili umani Da capillare sanguigno

1. Raccogliere il sangue capillare dal dito cazzo di volontari sani, che è in alcun immunosoppressori. Tutti i campioni sono stati ottenuti con il consenso informato scritto, e attraverso procedure approvate dal MGH e Shriners Review Boards istituzionali.
   1. Per dito cazzo di raccolta del sangue, lavarsi le mani con acqua e sapone e asciugare la pelle. Preparare anti-coagulant/stain soluzione stock con l'aggiunta di 1 ml HBSS + 0,2% HSA e 10 microlitri Hoechst macchia (32,4 micron) di eparina tubo di raccolta del sangue (1,65 USP/50 microlitri di sangue). Pungere il dito con una lancetta di sicurezza SurgiLance (profondità 2,2 mm, 22 G), rimuovere la prima goccia di sangue e raccogliere 50 ml di sangue in provetta Eppendorf contenente lo stock anti-coagulante e la soluzione colorante fluorescente Hoechst (10 ml) e delicatamente mescolare.
2. Incubare il sangue e macchia Hoechst per 10 min per permettere colorazione fluorescente nucleo. Eseguire campione entro 1 ora di raccolta del sangue.

I neutrofili umani Da sangue venoso

3. Disegna 10 ml di sangue venoso periferico in provette contenenti 33 USP eparina.
4. Aggiungere 50 ml di sangue venoso a media e macchia Hoechst come precedentemente descritto. Incubare il sangue e macchia Hoechst per 10 min per permettere colorazione fluorescente nucleo. Eseguire campione entro 1 ora di raccolta del sangue.

Neutrofili Separazione Dal sangue intero - controllo positivo

5. Per separare neutrofili, utilizzare tecniche sterili per isolare neutrofili dal 10 ml venoso campione di sangue intero utilizzando Hetastarch (6% w / v) gradiente di densità seguita da una selezione perlina magnetica Kit di isolamento negativo seguendo il protocollo produttori.
6. Risospese parte aliquota finale di neutrofili a Concentrazionezione di 4.000 cellule / mL in 1X HBSS + 0,2% di albumina sierica umana. Conservare le cellule a 37 ° C fino al momento di eseguire l'esperimento.

4. Microscopy and Image Analysis per misure chemiotassi dei neutrofili

1. Impostare la temperatura biochamber a 37 ° C, umidità al 80%, e CO ₂ al 5%.
2. Inizia l'imaging immediatamente con time-lapse imaging su un microscopio (10X o di ingrandimento superiore).

5. Analisi statistica

1. Traccia manualmente almeno 50 neutrofili in ciascun campione.
2. Contare le cellule che entrano nel FCC nel tempo (Figura 2).
3. Calcolo velocità neutrofili nel canale tra WBLC e FCC utilizzando ImageJ (NIH) (Figura 2).
4. Quantificare direzionalità dei neutrofili contando il numero di cellule che passano la biforcazione e calcolando il rapporto tra il numero di cellule che trasformano verso la FCC e cellule che uscita esimoe dispositivo. Le cellule che non sono direzionali non seguono il gradiente chemiotattico e quindi migrano in numero uguale verso la FCC e il canale di uscita (figura 2).

Risultati

Il sangue intero (WB) saggio chemiotassi dei neutrofili è stata convalidata misurando l'accumulo di neutrofili verso un gradiente fMLP (Film S1). I risultati confermano che i globuli rossi sono intrappolati dal pettine filtrazione mentre neutrofili (blu) sono in grado di migrare attivamente di sangue intero (figura 3A e Movie S1). Il gradiente lineare stabile chemiotattico (verde) formato dal sangue intero dispositivo microfluidica è stata confermata usando destra...

Discussione

In questo lavoro, abbiamo sviluppato una piattaforma microfluidica per misurare neutrofili chemiotassi da una goccia di sangue (2 microlitri). La filtrazione on-chip meccanica dei globuli rossi da migrare attivamente neutrofili elude la necessità di metodi ingombranti separazione cellulare come la densità gradienti ^10, selezione positiva ¹¹ o selezione negativa ^12, che sono inclini a introdurre artefatti attivando neutrofili. La filtrazione meccanica dei globuli rossi distingue la nost...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C