처리되지 않은 전체 혈액에서 호중구 주 화성을 측정하기위한 미세 유체 플랫폼

요약

이 프로토콜은 강력한 재현성 전체 혈액 한 방울에서 인간 호중구의 화학 주성을 측정하기위한 분석을 자세히 설명합니다. 이 접근법은 호중구의 분리의 필요성을 우회하고 분석 준비 시간의 몇 분을 필요로한다. 마이크로 유체 칩은 유아 또는 샘플의 양이 제한되어 작은 포유 동물에 시간이 지남에 따라 호중구의 화학 주성의 반복 측정을 가능하게합니다.

초록

호중구가 혈액 감염과 그들의 숫자에 대한 보호에 필수적인 역할을 자주 병원에서 측정됩니다. 낮은 호중구 카운트 감염에 대한 높은 위험에 대한 경고 표시하는 동안 혈액에있는 높은 호중구의 수는 일반적으로 지속적인 감염의 지표입니다. 자신의 기능을 수행하기 위해, 호중구는 감염이 발생 조직으로, 그들의 생활의 대부분을 보내는 혈액에서 효율적으로 움직일 수있다. 따라서, 마이그레이션하는 호중구의 기능에 결함이 호중구가 혈액에 해당 번호에 존재하는 경우에도, 감염에 대한 위험을 증가시킬 수있다. 그러나, 병원에서 호중구의 이동 능력을 측정하는 것은, 시간이 소요되는 어려운 작업이며 많은 혈액의 양 및 전문 지식이 필요합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 circum, 처리되지 않은 혈액 한 방울을 요구하는 호중구의 이동에 대한 강력한 마이크로 유체 분석 설계호중구의 분리의 필요성을 통풍구 및 간단한 현미경 정량화하기 쉽다. 이 분석에서, 호중구 화학 주성의 소스를 향해 작은 경로를 통하여 혈액 방울에서 직접 이동한다. 같은 채널을 통해 적혈구의 세부적인 흐름을 방지하기 위해, 우리는 선택적으로 적혈구의 진행을 차단하는 것이집니다 직각으로 기계적인 필터를 구현했습니다. 우리는 손가락 찌르기와 정맥 혈액에서 수집 된 혈액 방울에서 호중구의 이동을 비교하여 분석을 확인. 우리는 또한 정제 된 호중구의 샘플에서 호중구의 마이그레이션이 전혈 (WB) 소스를 비교 세 가지 소스에 일관된 속도와 방향성을 발견했다. 이 미세 유체 플랫폼은 건강과 질병에서 호중구의 기능에 대한 우리의 이해를 발전에 도움이되는 병원과 연구 환경에서 인간의 호중구 이주의 연구를 가능하게 할 것이다.

서문

호중구의 인신 매매는 죽상 경화증 ^1, 세균 감염이나 패혈증 ^2을 (를) 포함하여 많은 염증성 질환의 진행과 해상도를 결정하는 중요한 역할을하고, 부상 ^3을 구울 수 있습니다. 건강과 질병 상태에 대한 그들의 큰 기여를 들어, 호중구는 종종 임상과 연구 실험실에서 고려 된 표준 혈액 분석의 일부입니다. 그러나, 대부분의 유비쿼터스 테스트 중 하나, 감염과 패혈증의 진단에 호중구의 가치에도 불구하고 자주 ^{4 의문을} 제기하고있다. 예를 들어, 화상 환자의 호중구의 한 연구는 호중구 수와 호중구 마이그레이션 기능은 상관 관계가없는 것으로 나타났습니다; 그 호중구 혼자 계산 의미하는 것은 면역 상태 ^3의 정확한 표시되지 않습니다. 측정하기 더 어렵게되지만, 호중구 기능적 능력 조건의 넓은 범위에서보다 가치로서 제안되었다.

t는 "> 중요한 것은, 호중구 결함의 대부분은 일시적이며 영구적 인 유전 적 결함, 대부분 최근까지 병원에서 간과 된 차이에 의해 실행되지 않습니다. 화상 부상의 맥락에서, 호중구 이주의 과정을 모니터링 할 수 염증 상태 또는 감염 ^3의 지표로서 환자의 치료는 혈액의 대용량을 필요로하기 때문이다. 현재 실험실 (보이 덴 챔버 던 챔버, 마이크로 피펫 분석)에 사용 된 전통적인 이동 분석법은 임상로 변환 할 수없는 번거로운 시간 소모적 호중구의 분리에 필요한 혈액의 양이 하나의 샘플 수 및 종종 심지어 풀링 필요하기 때문에 호중구의 분리 기법 (표 1). 이러한 분석법은 또한, 예컨대 생쥐 같은 작은 실험실 동물의 호중구 화학 주성에서 일시적인 변화를 모니터링하기 위해 사용될 수 없다 하나의 분석에 대해 여러 동물의 피. 예를 들어, 관련된 연구는 M여러 시간 지점에 ultiple 조건과 치료는 잠재적으로 현재 화성 분석을 사용하여 마우스의 수천을 필요로 할 수 있습니다. 이 부상, 감염의 맥락에서 면역 기능의 복잡한 역학을 이해하거나 자주 쥐 모델 ^5에서 공부를 레코딩 할 수있는 기본적인 생물학 연구를 제한합니다.

최소한의 혈액량을 요구하면서, 급속한 견고 호중구 기능적 분석을위한 필요성을 해결하기 위해, 우리는 전체 혈액의 작은 방울로부터 직접 호중구 주 화성을 측정 미세 유동 장치를 개발했다. 그것은 혈청 ⁶ 혈소판 ^7을 포함하여 전체 혈액에있는 많은 요인이, 호중구의 기능에 영향을 미치는 것으로 알려져있다. 그것은 전혈 미세 분석은 시험 관내 분석으로 ⁸ 주 화성의 변동을 측정 할 때 호중구의 생체 내 미세 환경을 유지하는 시료 처리를 최소화하는 것이되므로 유리하다. 이 방법혈액 컬렉션에서 기존의 기술을 사용하여 시간에서 호중구 마이그레이션 분석에 시간이 줄어 듭니다 단지 분 (표 1)에. 전체 혈액의 미세 유체 플랫폼은 실험의 길이 안정적인 선형 화학 유인 물질 구배를 생성 움직이는 부분이 없으며, 외부 압력 소스 (즉, 주사기 펌프)를 필요로하지 않습니다. 전혈 마이크로 유체 장치의 디자인에서 중요한 특징은 기계적 장치의 이주 채널 입력에서 적혈구를 필터링 적혈구 (RBC) 여과 빗의 혼입이다. 이 여과 빗 우회전 가능성 적혈구 의해 막히는 것 크기 배제 여과의 필요성을 방지하고, 따라서 WB에서 적극적 마이그레이션 호중구 도달 화학 유인 물질 그라데이션 블록. 12 또는 24 - 웰 플레이트의 전체 혈액의 미세 유체 장치의 결합은 인간이나 쥐의 호중구의 화학 주성시의 여러 매개 물질의 검사를 용이하게로 섞고.

프로토콜

1. 미세 유체 디바이스 제조

1. 표준 포토 리소그래피 기술을 이용하여, 클래스 1000 청정실 마스터 몰드 웨이퍼를 제조. 본 제조자의 지시에 따른 이동 채널을 정의하는 제 3 μm의 얇은 에폭시 계 네거티브 포토 레지스트 층. 패턴 셀 로딩 및 케모카인 챔버를 정의하는 두 번째 50 μm의 두꺼운 층.
2. 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 장치를 캐스팅 패턴 웨이퍼를 사용합니다. 적극적 큰 플라스틱 무게 트레이에 플라스틱 포크를 사용하여 5 분 동안 개시 (2g)와 PDMS (19 g)을 혼합.
3. 조심스럽게 금형에 PDMS를 붓는다.
4. 1 시간 동안 진공 데시 케이 부어 PDMS와 금형을 배치하여 PDMS를 탈기.
5. 빵을 65 ° C로 설정 오븐에서 적어도 3 시간 동안 PDMS 마이크로 유체 장치 치료
6. 1.5 mm의 선단 직경 펀칭기를 사용하여 중앙 WBLCs 펀치 아웃.
7. punc를 사용하여 전체 도넛 모양의 장치를 펀치5.0 mm의 팁 직경을 가진 그녀.
8. 접착 테이프를 사용하여 도넛 장치에서 입자를 제거합니다.
9. 탈 물과 질소로 다음 건조로 12 - 웰 플레이트를 씻어. 5 분 60 ° C 오븐에서 접시를 놓습니다.
10. 산소 플라즈마는 두 번 12 - 웰 플레이트를 치료; 한 번 단독으로 35 초 후 다시 다른 35 초 동안 도넛 장치.
11. 조심스럽게 핀셋을 사용하여 판의 우물에 장치를 배치합니다.
12. 10 분 동안 80 ° C로 설정 핫 플레이트에 결합 장치와 빵 접시.

2. 미세 유체 분석 준비

1. 즉, 산소 플라즈마 처리 후 프라임 미세 유동 장치 장치가 친수성 ​​모세관 효과 장치에서 작은 채널 프라이밍을 촉진 할 수있을 때.
2. 5 ㎕의 피브로넥틴 [원액을 1 ㎎ / ㎖] 490 ㎕의 HBSS에 5 μL fMLP [원액 10 μM]을 혼합하여 화학 유인 물질 솔루션을 만듭니다.
3. 천천히 피펫 & #160; WBLC에 화학 유인 물질 용액, 젤 로딩 팁 (그림 1A)를 사용하여. 장치의 외부 주변 화학 유인 물질의 피펫은 추가적인 20 μL.
4. 15 분 동안 건조기에서 접시를 놓습니다. 장치에 진공을 적용하여, 용액 장치와 PDMS 통해 확산 된 공기의 사이드 채널로 주입된다.
5. 데시 케이 터에서 접시를 제거하고 현미경 장치 채널의 습윤을 확인합니다. 화학 유인 물질 용액 챔버를 입력으로 거품이 작아짐 손목 시계. 아무 거품은 진공 처리 후 장치 내에서 본 제품을 장착 할 수 없습니다.
6. WBLC 세척 장치의 외부에 철저를 초과하는 화학 유인 물질 솔루션을 제거 할 수 있습니다. 이 단계는 디바이스 중심 초점 화학 주성 챔버 (FCCS) 각각으로부터 화학 유인 물질의 구배를 생성한다.
   1. 주사기에 30 G 무딘 바늘 팁을 추가, PBS로 1 ML의 주사기를 채우십시오. 온화있는 주사기의 바늘 끝을 삽입도넛 구멍의 중심에. 조심스럽게 구멍에 PBS 100 μl를 밀어 있도록 장치의 상단에 PBS 형태의 물방울.
   2. 장치 주변의 PBS의 경사판 피펫 1 ㎖ 액체 웰의 바닥에 수집되도록. 대기음 (분리 된 호중구가 미디어에로드 할 경우 대신 버퍼의 사용 미디어) 신선한 완충 용액을 사용하여 3 배의 총 액체 반복 과정 ^9.
7. 장치의 정상 액체에서 침수 될 때까지 미디어와 잘 각을 입력합니다. 장치가 그라데이션이 안정 될 수 있도록 15 분 동안 앉아 보자. 실험 결과와 유한 요소 시뮬레이션 이론적 데이터는 이러한 장치의 그라데이션이 작은 분자 (예를 들면, fMLP)과 큰 분자량 (예를 들어, IL8)에 대한 몇 가지 일 최대 24 시간까지 안정되어 있음을 보여줍니다.
8. 젤 로딩 팁을 사용하여, 천천히 각 전혈 LOA에 2 ㎕의 혈액 (또는 고립 된 호중구를) 피펫딩 챔버 (WBLC) (그림 1A).

3. 샘플 준비

모세관 혈액에서 인간의 호중구

1. 아니 면역 억제제에 건강한 자원 봉사의 손가락 찌르기에서 모세관 혈액을 수집합니다. 모든 환자의 샘플을 작성 동의서를 얻을, 그리고 MGH와 라이너스 기관 검토 보드의 승인 절차를 통해되었습니다.
   1. 손가락 찌르기 혈액 수집을 위해, 물과 비누로 손을 씻어 피부를 건조. 혈액 수집 관 (1.65 USP/50 ㎕의 혈액을) 헤파린에 1 ㎖의 HBSS + 0.2 % HSA 10 μL 훽스트 얼룩 (32.4 μM)를 추가하여 anti-coagulant/stain 주식 솔루션을 준비합니다. 혈액의 첫 번째 드롭을 닦아 부드럽게 주식 항응고제 및 훽스트 형광 염색 용액 (10 μL) 등을 포함하는 에펜 도르프 튜브에 혈액의 50 μl를 수집, SurgiLance 안전 바소 (2.2-mm의 깊이, 22 G)를 사용하여 손가락을 찔러 혼합.
2. 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다.

정맥 혈액에서 인간의 호중구

3. 33 USP 헤파린을 포함하는 튜브에 말초 정맥 혈액 10 ㎖를 그립니다.
4. 전술 한 바와 같이 미디어와 헥스 얼룩에 정맥 혈액의 50 μl를 추가합니다. 핵 형광 염색 수 있도록 10 분 동안 혈액과 훽스트 얼룩을 품어. 혈액 수집의 1 시간 이내에 샘플을 실행합니다.

전체 혈액에서 호중구의 분리 - 긍정적 인 제어

5. , 호중구를 분리 헤 타스 타치를 사용하여 10 ㎖ 정맥 전체 혈액 샘플에서 호중구를 분리하기 위해 무균 기술을 사용하려면 (6 % W / V) 제조 업체의 프로토콜을 다음과 같은 음의 선택 자기 비드 분리 키트 다음에 밀도 구배.
6. concentr에서 호중구의 최종 나누어지는 재현 탁1X HBSS + 0.2 % 인간 혈청 알부민 / μL 4,000 세포의 ATION. 실험을 실행할 준비가 될 때까지 37 ° C에서 세포를 유지합니다.

호중구 화성 측정을위한 4. 현미경 및 이미지 분석

1. 5 %에서 37 ° C, 80 %의 습도 및 CO ₂ biochamber 온도를 설정합니다.
2. 현미경 (10 배 이상 확대)에 시간 경과 이미징을 사용하여 즉시 이미징 시작합니다.

5. 통계 분석

1. 수동으로 각 샘플의 적어도 50 호중구를 추적 할 수 있습니다.
2. 시간이 지남에 따라 FCC들이 세포 (도 2)를 카운트.
3. ImageJ에 (NIH) (그림 2)를 사용하여 WBLC 및 FCC 사이의 채널에서 호중구의 속도를 계산합니다.
4. 분기점을 전달 세포의 수를 카운트하고 종료 번째 FCC와 세포를 향해 회전하는 셀의 수 사이의 비율을 계산하여 호중구의 방향성을 정량화전자 장치. 방향없는 세포는 화성의 기울기를 따라 때문에 FCC 및 출구 채널 (그림 2)을 향해 동일한 개수의 마이그레이션되지 않습니다.

결과

전혈 (WB) 호중구 주 화성 분석은 fMLP 구배 (동영상 S1)쪽으로 호중구의 축적을 측정함으로써 입증 하였다. 결과는 호중구 (파란색)이 적극적으로 전혈 (그림 3a 및 영화 S1) 중 마이그레이션 할 수있는 동안 적혈구가 여과 빗에 의해 갇혀 있는지 확인합니다. 전혈 미세 유동 장치에 의해 형성된 안정 화학 유인 물질 선형 구배 (그린)를 FITC-표지 된 덱스 트란

토론

이 작품에서 우리는 혈액의 액체 방울 (2 μL)에서 호중구의 화학 주성을 측정 할 수있는 미세 유체 플랫폼을 개발했다. 적극적으로 호중구를 마이그레이션에서 적혈구의 온 - 칩 기계적 여과는 호중구를 활성화하여 유물을 소개하는 경향이 이러한 밀도가 ^{10 그라디언트} 등의 번거로운 세포 분리 방법, 긍정적 인 선택 ^(11), 또는 음의 선택 ^(12)에 대한 필요성을 우회. 적혈구?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C