Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Zusammenfassung

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Zusammenfassung

Neutrophile Granulozyten spielen eine wesentliche Rolle beim Schutz gegen Infektionen und ihre Zahl im Blut sind häufig in der Klinik gemessen. Höhere Anzahl von neutrophilen Granulozyten im Blut sind in der Regel ein Indikator für die laufende Infektionen, während niedrige neutrophilen Granulozyten sind ein Warnzeichen für höhere Risiken für Infektionen. Um ihre Aufgaben zu erfüllen, haben Neutrophilen auch in der Lage, effektiv aus dem Blut, wo sie die meisten ihr Leben damit verbringen zu bewegen, in die Gewebe, in denen Infektionen auftreten. Folglich können Mängel in der Fähigkeit von Neutrophilen zu migrieren, die Risiken für Infektionen erhöhen, auch wenn Neutrophilen im entsprechenden Zahlen im Blut vorhanden sind. , Mess-Migration von Neutrophilen Fähigkeit in der Klinik ist jedoch eine anspruchsvolle Aufgabe, die zeitaufwendig ist, erfordert große Mengen an Blut, und Fachwissen. Um diese Einschränkungen zu adressieren, haben wir eine robuste mikrofluidischen Assays für die Migration von Neutrophilen, die einen einzigen Tropfen Blut benötigt unverarbeitete, Umständeentlüftet die Notwendigkeit Neutrophilen Trennung und ist leicht auf einem einfachen Mikroskop quantifiziert. In diesem Assay wandern Neutrophile direkt von den Blutstropfen durch kleine Kanäle in Richtung der Quelle des chemoattraktiven. Um die körnige Strömung der roten Blutkörperchen durch die gleichen Kanäle zu verhindern, setzten wir mechanische Filter mit Winkelstellt, dass selektiv den Vormarsch der roten Blutzellen zu blockieren. Wir validiert den Assay durch den Vergleich die Migration von Neutrophilen aus Bluttropfen aus dem Finger stechen und venösen Blut gesammelt. Wir verglichen auch diese Vollblut (WB) Quellen mit Migration von Neutrophilen aus Proben von gereinigten Neutrophilen und gefunden konstante Geschwindigkeit und Richtungs zwischen den drei Quellen. Das mikrofluidische Plattform wird die Untersuchung der menschlichen Migration von Neutrophilen in der Klinik und der Forschung Einstellung aktivieren, um unser Verständnis der Neutrophilen-Funktionen in Gesundheit und Krankheit.

Einleitung

Neutrophile Handel spielt eine entscheidende Rolle bei der Bestimmung des Fortschritts und der Auflösung von vielen entzündlichen Erkrankungen, einschließlich Atherosklerose ^1, bakterielle Infektion oder Sepsis ^{2, 3} und Verletzungen zu verbrennen. Für ihren wichtigen Beitrag zur Gesundheit und Krankheit Bedingungen ist Neutrophilenzahl Teil der Standard-Blutanalyse oft in der klinischen und Forschungslabors berücksichtigt. Doch obwohl sie eine der am weitesten verbreiteten Tests, der Wert der Neutrophilen in der Diagnostik von Infektionen und Sepsis ist häufig in Frage ⁴ wurde. Zum Beispiel, eine Studie von Neutrophilen bei Verbrennungspatienten ergab, dass Neutrophilen und die Migration von Neutrophilen-Funktion nicht korrelieren; was bedeutet, dass allein der neutrophilen Granulozyten ist nicht eine genaue Anzeige des Immunstatus ^3. Obwohl schwieriger zu messen, hat Neutrophilen funktionale Kompetenz als wertvoller in einem breiten Bereich von Bedingungen vorgeschlagen worden.

t "> Wichtig ist, dass viele der Neutrophilen-Defekte sind flüchtig und werden durch permanente genetische Defekte, eine Unterscheidung, die weitgehend in der Klinik übersehen wurde bis vor kurzem ausgelöst. Im Rahmen der Brandverletzungen, könnte die Migration von Neutrophilen im Verlauf überwacht werden Behandlung eines Patienten als Indikator der Entzündungszustand oder Infektions ^3. Die Migrationsassays gegenwärtig im Labor (Boyden-Kammer, Dunn Kammer Mikroassay) verwendet wird, kann nicht in einer klinischen Umgebung umgesetzt werden, da sie große Mengen an Blut und umständlich zeitraub Neutrophilen-Isolationstechniken (Tabelle 1). Diese Tests können auch nicht verwendet werden, um vorübergehende Veränderungen in Neutrophilen-Chemotaxis in kleinen Labortieren wie Mäusen zu überwachen, da die Lautstärke von Blut für neutrophile Isolierung erforderlich ermöglicht nur eine Probe und oft sogar erfordert die Bündelung von Blut von verschiedenen Tieren für einen einzelnen Assays. Zum Beispiel eine Studie mit mehrere Bedingungen und Behandlungen über mehrere Zeitpunkte erfordern möglicherweise Tausende von Mäusen mit aktuellen Chemotaxis-Assays. Dies schränkt die biologische Grundlagenforschung, die getan werden, um die komplexe Dynamik der Immunfunktion im Zusammenhang mit Verletzungen, Infektionen oder verstehen oft brennen in den Mausmodellen ⁵ untersucht werden.

Um die Notwendigkeit für einen Neutrophilen-Funktionsassay, das eine schnelle, robust ist, während bei minimaler Blutvolumen zu lösen, haben wir eine Mikrofluidvorrichtung, die Neutrophilen-Chemotaxis von einer kleinen Tröpfchen von Blut misst direkt entwickelt. Es ist bekannt, daß viele Faktoren in Vollblut, Serum, einschließlich Plättchen ⁶ und ⁷ betreffen Neutrophilen-Funktion. Es ist daher vorteilhaft, dass das Vollblut mikrofluidischen Tests minimiert Probenverarbeitung, um die in vivo-Mikroumgebung der Neutrophilen zu halten, wenn die Messung Unterschiede in Chemotaxis mit einem in ^{vitro-Assay-8.} Dieser Ansatzreduziert die Zeit von der Blutentnahme bis die Migration von Neutrophilen-Assays von Stunden mit traditionellen Techniken, um nur Minuten (Tabelle 1). Das Vollblut mikrofluidischen Plattform eine stabile lineare chemoattractant Gradienten für die Dauer des Experiments, hat keine beweglichen Teile und keine externe Druckquelle (z. B. eine Spritzenpumpe) erforderlich. Das Schlüsselmerkmal bei der Gestaltung des Gesamtblut mikrofluidischen Vorrichtung ist der Einbau von roten Blutkörperchen (RBC), die mechanisch Filtration Kammfilter von RBCs in die Migration Kanal des Gerätes. Die Rechtskurven dieser Filterkamm verhindern, dass die Notwendigkeit für Größenausschluss-Filtration, die wahrscheinlich von RBC verstopft sein würde und deshalb blockieren die chemoattractant Gradienten vom Erreichen der Migration von Neutrophilen aktiv in der WB. Der Einbau des Vollbluts in einer Mikrofluidik-Vorrichtung 12 oder 24-Well-Platte erleichtert das Screening mehrerer Mediatoren der humanen oder murinen Neutrophilenchemotaxis sizeitig.

Protokoll

1. Mikrofluidikvorrichtung Fabrication

1. Mit Standard-Photolithographietechniken, fabrizieren die Master-Form-Wafer in einer Klasse 1000 Reinraum. Muster der ersten 3-um-dünnen Epoxid-Basis negativen Photoresist-Schicht, um die Migrationskanäle nach den Anweisungen des Herstellers zu definieren. Muster der zweite 50 um dicke Schicht, um die Zell-Be-und Chemokin-Kammern zu definieren.
2. Verwenden Sie die strukturierten Wafer zu Polydimethylsiloxan (PDMS)-Geräte werfen. Kräftig mischen PDMS (20 g) mit Initiator (2 g) für 5 min mit Plastikgabel in großen Plastik Waagschale.
3. Vorsichtig gießen PDMS auf die Form.
4. Entgasen Sie die PDMS, indem Form gegossen mit PDMS im Vakuumtrockenschrank für 1 Stunde.
5. Backen und PDMS mikrofluidischen Systemen für mindestens 3 Stunden zu heilen in einem Ofen auf 65 ° C eingestellt
6. Stanzen Sie die zentralen WBLCs mit einem Puncher mit einem Spitzendurchmesser von 1,5 mm.
7. Punch-Out ganze Donut-förmigen Geräte mit einem puncsie mit einem Spitzendurchmesser von 5,0 mm.
8. Entfernen von Teilchen Donut Geräte mit Klebeband.
9. Spülen Sie ein 12-Well-Platte mit VE-Wasser und dann mit Stickstoff trocken. Zeigen Platte in 60 ° C-Ofen für 5 min.
10. Sauerstoff-Plasma-Behandlung der 12-Well-Platte zweimal; einmal allein für 35 sec und dann wieder mit den Donut-Geräte für weitere 35 Sekunden.
11. Geräte vorsichtig in die Vertiefungen der Platte mit einer Pinzette.
12. Bake-Platte mit gebundenen Geräte auf einer Heizplatte auf 80 ° C für 10 min eingestellt.

2. Mikrofluidik-Assay Vorbereitung

1. Prime mikrofluidischen Vorrichtungen unmittelbar nach der Sauerstoffplasmabehandlung, wenn die Vorrichtung ist hydrophil und Kapillarwirkung die Grundierung der kleinen Kanäle in der Vorrichtung zu fördern.
2. Neues chemoattractant Lösung durch Mischen von 5 ul fMLP [Stammlösung 10 uM] mit 5 ul Fibronektin [Stammlösung 1 mg / ml] und 490 ul HBSS.
3. Langsam Pipette & #160; chemoattraktive Lösung in WBLC, mit einer Spitze für Gel (Abbildung 1A). Pipette weitere 20 ul des chemoattraktiven um die Außenseite der Vorrichtung.
4. Zeigen Platte in einem Exsikkator für 15 min. Durch Anlegen eines Vakuums an die Vorrichtung wird die Lösung in die Seitenkanäle des Geräts und der verdrängten Luft durch die PDMS diffundiert tropft.
5. Entfernen Platte aus und bestätigen Exsikkator Benetzung der Gerätekanal unter dem Mikroskop. Beobachten Sie, wie Blase wird kleiner, chemoattraktive Lösung in die Kammer eintritt. Keine Blase sollte innerhalb des Gerätes nach der Vakuumbehandlung vorhanden sein.
6. Waschen Sie die WBLC und außerhalb des Gerätes gründlich, um überschüssige chemoattraktive Lösung zu entfernen. Dieser Schritt erzeugt einen Gradienten von chemoattraktiven von jedem der Brennchemotaktische Kammern (FCC) an die Vorrichtung entfernt.
   1. Füllen Sie eine 1-ml-Spritze mit PBS, fügen Sie eine 30 G stumpfen Nadelspitze zu Spritze. Vorsichtig die Nadel Spitze der Spritze inzum Zentrum des torusförmigen Lochs. Drücken Sie vorsichtig 100 ul PBS in das Loch, so dass ein Tropfen PBS bildet sich auf der Oberseite des Gerätes.
   2. Neigungsplatte und Pipette 1 ml PBS, um Vorrichtung, so daß die Flüssigkeit am Boden der Mulde sammelt. Saugen Sie die Flüssigkeit und wiederholen Sie den Vorgang für insgesamt 3x mit frischen Pufferlösung (Mediennutzung statt Puffer, wenn die getrennten Neutrophilen in Medien geladen werden) ^9.
7. Füllen Sie jeweils gut mit Medien, bis die Oberseiten der Geräte sind unter Flüssigkeit eingetaucht. Lassen Sie die Geräte für 15 Minuten sitzen, damit Gefälle zu stabilisieren. Experimentelle Ergebnisse und theoretischen Daten von Finite-Elemente-Simulationen zeigen, dass die Steigungen in diesen Geräten sind stabil bis zu 24 h für kleine Moleküle (z. B. fMLP) und bis zu mehreren Tagen bei höherem Molekulargewicht (z. B. IL-8).
8. Mit Gel-Beladungstipps, langsam pipettieren 2 ul Blut (oder isolierten Neutrophilen) in jedes Vollblut loading Kammer (WBLC) (Abbildung 1A).

3. Probenvorbereitung

Human-Neutrophilen aus Kapillarblut

1. Sammle Blut aus der Stich in den Finger von gesunden Freiwilligen, die auf keine Immunsuppressiva ist. Alle Patientenproben wurden mit schriftlicher Einwilligung durch Verfahren, die von der MGH und Shriners Institutional Review Boards genehmigt erhalten und.
   1. Für Stich in den Finger Blutentnahme, waschen die Hände mit Wasser und Seife und trocknen Sie die Haut. Bereiten anti-coagulant/stain Stammlösung durch Zugabe von 1 ml HBSS + 0,2% HSA und 10 ul Hoechst-Färbung (32,4 uM), um den Blutsammelröhrchen (1,65 USP/50 ul Blut) Heparin. Stechen Sie den Finger mit einem SurgiLance Sicherheitslanzetten (2,2-mm Tiefe, 22 G), abwischen ersten Tropfen Blut und sammeln Sie 50 ul Blut in Eppendorf-Röhrchen, die das Lager Antikoagulans und Hoechst Fluoreszenzfarbstoff-Lösung (10 ul) und sanft mischen.
2. Inkubieren Sie die Blut-und Hoechst-Färbung für 10 min bis zum Kern Fluoreszenzfärbung zu ermöglichen. Führen Probe innerhalb 1 h nach der Blutentnahme.

Human-Neutrophilen aus venösem Blut

3. Draw 10 ml peripheres, venöses Blut in Röhrchen mit 33 USP Heparin.
4. Dann werden 50 ul Venenblut auf Medien und Hoechst-Färbung wie oben beschrieben. Inkubieren Sie die Blut-und Hoechst-Färbung für 10 min bis zum Kern Fluoreszenzfärbung zu ermöglichen. Führen Probe innerhalb 1 h nach der Blutentnahme.

Neutrophile Trennung von Vollblut - Positive Control

5. Um Neutrophilen zu trennen, sterile Techniken an Neutrophile aus dem 10 ml venöses Vollblutprobe mit Hetastarch isolieren (6% w / v) Dichtegradienten gefolgt von einer negativen Selektion Magnetic-Bead-Isolations-Kit nach dem Protokoll des Herstellers.
6. Resuspendierte die endgültige Aliquot von Neutrophilen bei einer konzation von 4000 Zellen / ul in 1X HBSS + 0,2% Humanserumalbumin. Halten Zellen bei 37 ° C bis bereit, das Experiment laufen.

4. Mikroskopie und Bildanalyse für die Neutrophilen-Chemotaxis-Messungen

1. Einrichtung Biokammer Temperatur auf 37 ° C, Luftfeuchtigkeit 80% und CO ₂ bei 5%.
2. Start sofort Bildgebung mit Zeitraffer-Bildgebung an einem Mikroskop (10X oder höher Vergrößerung).

5. Statistische Analyse

1. Manuell verfolgen mindestens 50 Neutrophilen in jeder Probe.
2. Zählen der Zellen in die FCC im Laufe der Zeit (Fig. 2).
3. Berechnen Neutrophilen Geschwindigkeiten im Kanal zwischen WBLC und FCC mit ImageJ (NIH) (Abbildung 2).
4. Quantifizierung Direktionalität von Neutrophilen durch Zählen der Anzahl von Zellen, die die Verzweigung passieren und Berechnen des Verhältnisses zwischen der Anzahl der Zellen, die zu dem FCC und Zellen, die Austritts th drehenE-Gerät. Zellen, die nicht gerichtet sind, folgen nicht dem chemotaktischen Gradienten und daher in gleicher Anzahl zu der FCC-und der Austrittskanal (2) zu migrieren.

Ergebnisse

Das Vollblut (WB), Neutrophilen-Chemotaxis-Assay wurde durch Messen der Akkumulation von Neutrophilen zu einer fMLP Gradienten (Movie S1) validiert. Die Ergebnisse bestätigen, dass Erythrozyten werden durch die Filtration Kamm gefangen, während Neutrophilen (blau) sind in der Lage, sich aktiv aus Vollblut (3A-und Film-S1) zu migrieren. Die stabile lineare chemoattractant Gradienten (grün) von dem Vollblut mikrofluidischen Vorrichtung gebildet wurde mit FITC-markiertem Dextran

Diskussion

In dieser Arbeit entwickelten wir eine mikrofluidische Plattform Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Blut (2 ul) zu messen. Der On-Chip-mechanische Filtration von Erythrozyten aus aktiv Migration Neutrophilen umgeht die Notwendigkeit umständlicher Zelltrennverfahren, wie Dichte-Gradienten ^{10, 11} positive Selektion, negative Selektion oder ^12, die anfällig für Artefakte, die durch Neutrophile aktivierenden einzuführen. Die mechanische Filtration von Erythrozyten unterscheidet unsere Techno...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Device Fabrication
SU-8	Microchem	Y131273
Polydimethylsiloxane (PDMS)	Ellsworth Adhesives	Sylgard 184 1.1 lb. Kit
Standard glass slides	Fisher Scientific	125495	1 X 3 inches
Glass-bottom plate	MatTek	P12G-1.5-14-F
Harris Uni-Core, Tip Diameter 5.0 mm	Ted Pella, Inc.	15081
Harris Uni-Core, Tip Diameter 1.5 mm	Ted Pella, Inc.	15072
Microfluidic Assay Preparation and Analysis
Gel-loading pipet tip	Fisher Scientific	02-707-139
Syringe	Fisher Scientfic	309602
Blunt tip needle, 30 G ½ in.	Brico Medical Supply	BN3005
Vacutainer, Heparin	Becton Dickinson
HBSS	Sigma-Aldrich
Human serum albumin	Sigma-Aldrich	A5843-5G	0.2% final concentration in HBSS
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F0895-1MG
fMLP	Sigma-Aldrich	F3506-10MG
SurgiLance safety lancet, 2.2-mm depth, 22 G		SLN240
Hoescht stain	Life Technologies	H3570
Positive Control
HetaSep	STEMCELL Technologies Inc.	7906
EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit	STEMCELL Technologies Inc.	19257
Plasma Asher	March Instruments	P-250
Lindberg/Blue M Oven	Thermo Scientific	13-258-30C
Stainless Steel Precision Tweezers	Techni Tool	758TW458
Bel-Art Scienceware Chemical-Resistant Vacuum Desiccator	Fisher Scientific	08-594-15A
Dataplate Digital Hot Plate	Alpha Multiservices	PMC 720
Nikon TiE inverted microscope	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MEA53100
CFI Plan Fluor DL 10X NA 15.2 wd Objective	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	MRH20101
Lumen 200 with 2 Meter Light Guide for Nikon	Nikon - Micro Video Instruments Inc.	500-L200NI2
DAPI/Hoechst/AMCA Narrow Band 32-mm Exciters - 25-mm Emitters	Chroma - Micro Video Instruments Inc.	31013v2
Retiga R 2000 cooled CCD Camera 1,600 x 1,200 pixels	Qimaging - Micro Video Instruments Inc.	RET-2000R-F-M-12-C