عزل mRNAs والمرتبطين مع الميتوكوندريا الخميرة لدراسة آليات المترجمة ترجمة

Summary

وترتبط العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا مع الغشاء الخارجي الميتوكوندريا. نحن تصف الإجراء تجزيء التحت خلوية تهدف إلى عزل الميتوكوندريا الخميرة مع mRNAs والمرتبطة به وريبوسوم. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول إلى الخلايا المزروعة تحت ظروف متنوعة من أجل الكشف عن آليات مرنا التعريب والترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا.

Abstract

يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة وتحتاج إلى استيرادها إلى عضية. قد تحدث الاستيراد في حين يتم تصنيع البروتين بالقرب من الميتوكوندريا. ويستمد الدعم لهذا الاحتمال من الدراسات التي أجريت مؤخرا، والتي عرضت العديد من mRNAs وترميز البروتينات الميتوكوندريا إلى أن تكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا. جنبا إلى جنب مع المظاهرات السابقة من جمعية ريبوسوم 'مع الغشاء الخارجي، وتشير هذه النتائج إلى عملية الترجمة المترجمة. هذه الترجمة المترجمة قد تحسين كفاءة الاستيراد وتوفير مواقع التنظيم فريدة من نوعها وتقليل حالات التعبير خارج الرحم. وقد استخدمت أساليب متنوعة لتوصيف العوامل والعناصر التي تتوسط الترجمة المترجمة. المعيار بين هذه هو تجزيء التحت خلوية بواسطة الطرد المركزي التفاضلي. هذا البروتوكول له ميزة عزل mRNAs و، ريبوسوم والبروتينات في إجراء واحد. ويمكن بعد ذلك تتميز هذه من قبل مختلف الجزيئية وثنائيةطرق ochemical. علاوة على ذلك، transcriptomics والبروتينات أساليب يمكن تطبيقها على المواد الناتجة، وبالتالي تسمح رؤى على نطاق الجينوم. استخدام الخميرة كما كائن نموذج لمثل هذه الدراسات لديها مزايا السرعة والتكاليف والبساطة. وعلاوة على ذلك، فإن الأدوات الجينية المتقدمة وسلالات حذف متاحة تسهيل التحقق من العوامل مرشح.

Introduction

ويتم تنظيم الخلايا حقيقية النواة في مقصورات متميزة ذات وظائف محددة. لإنجاز مهمتها، كل مقصورة تحتوي على مجموعة فريدة من البروتينات الضرورية لنشاطها. آلية يمكن من خلال هذه البروتينات التي تقترب المقصورة الخاصة بهم هي مترجمة ^1،2 الترجمة. في هذه العملية، ويتم تصنيع البروتين في وجهتها من قبل ريبوسوم وmRNAs والتي تقع هناك. من بين المزايا المحتملة للترجمة المترجمة وزيادة كفاءة استهداف البروتين، انخفضت الحاجة الى المحرمين البروتين، وتمكين آليات التنظيم للموقع المحدد. أيضا، mRNAs والمترجمة وريبوسوم يمكن أن يكون خزان منعزل الآلات الترجمة في حالات الإجهاد الخلوية، عندما يتم تثبيط الترجمة العامة.

أصبح الميتوكوندريا في السنوات الأخيرة نموذجا المركزية لدراسة الترجمة المترجمة. يتم ترميز معظم البروتينات الميتوكوندريا في النواة، وترجم في العصارة الخلوية،والمستوردة إلى عضية. خطوط مختلفة من الأدلة تشير إلى أن العديد من هذه البروتينات يتم إنتاجها من خلال عملية الترجمة المحلية. في البداية، الكشف عن المجهر الإلكتروني وتجزئة البيوكيميائية الدراسات ريبوسوم المرتبطة الميتوكوندريا ^3-5. هذه الدراسات حيث ثم تؤكده في الجسم الحي بواسطة العمل على mRNAs ومحددة، التي وجدت لتكون مستوردة فقط بطريقة ^6،7 cotranslational. كشفت دراسات الجينوم على نطاق من mRNAs وبالتعاون مع الميتوكوندريا أن جزءا كبيرا من mRNAs وتكون مترجمة إلى جوار الميتوكوندريا ^8-10. وتميزت بعض هذه mRNAs ومزيدا من التألق في الجسم الحي الأساليب، مثل الأسماك أو mTAG ^9،11. تفسير مستقيم إلى الأمام من هذا الارتباط هو أن هذه mRNAs وتكون بمثابة نماذج لترجمة المترجمة.

الآليات التي هذه mRNAs والاقتراب من الميتوكوندريا غير معروفة. المجالات غير المكودة (معظم significantlعرضت ذ 3 'UTRs) أن تشارك في تكوين الجمعيات مرنا إلى الميتوكوندريا ^12. من المرجح أن يكون بمثابة موقع ملزم للبروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي الذي توسط نقلها هذه المجالات. كشفت الدراسات في الخميرة أن عضوا من عائلة PUM من البروتينات (Puf3) تدعم جمعية مرنا مع الميتوكوندريا ^8،13. دور معقول لPuf3، الذي يقوم على أساس وظائف من أفراد الأسرة الآخرين، هو أن تمنع الترجمة بينما هو في طريقه مرنا ^14. وبالتالي، يمكن نقلها من mRNAs في حالة nontranslated، من خلال البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي تتفاعل مع المناطق غير المكودة. بدلا من ذلك، مجموعة كبيرة من العمل تشير إلى أن يحدث النقل في الوقت الذي يجري تصنيعه البروتين. على وجه الخصوص، وقد أظهرت مثبطات ترجمة تؤثر mRNAs وجمعية ^8،13. وعلاوة على ذلك، وميزات ترجمة مثل أغسطس، عرضت الميتوكوندريا تسلسل الاستهداف (MTS) أو المناطق ORF للمساعدة في توطين ^8،11،15. HSP70 الأسرة الفصل البروتينعرضت aperone ومستقبلات البروتين على الغشاء الخارجي الميتوكوندريا أيضا لدعم الجمعيات مرنا، مما يعني أن المزيد من الميزات المشفرة البروتين مهمة لتوطين مرنا ^16. وهذا يتفق مع نموذج الذي البروتين الناشئة الريبوسوم بمثابة عنصر الاعتراف لاستهداف مجمع مرنا-الريبوسوم البروتين إلى ¹⁷ الميتوكوندريا.

وقد درست الترجمة المترجمة بالقرب من الميتوكوندريا عن طريق وسائل مختلفة، بما في ذلك المجهر الإلكتروني (لتصور ريبوسوم) ^3، FISH ^9، RNA الخضراء (للكشف عن mRNAs ومحددة) ^11، وتجزئة البيوكيميائية (للكشف عن كل من الحمض النووي الريبي وريبوسوم) ^10،18. في حين أن وسائل التعريب السابق كشف في الجسم الحي، وربما يسمح التصور من ديناميات النقل، وهذا الأخير يسمح الكشف عن العديد من المختلف في mRNA في تجربة واحدة. علاوة على ذلك، لالبيوكيميائية الترميز تجزئة أو غير المكودة المجالات لا تحتاج إلى أن تكون آلtered، وبالتالي يمكن تقييم الأدوار الخاصة بهم. وقد استخدمت تجزئة البيوكيميائية بنجاح لسنوات عديدة، لعزل العديد من المقصورات الخلوية المختلفة. وراسخة ومبادئها والقيود، ويمكن للمرء بسهولة تعديل البروتوكولات القائمة لأغراض مختلفة. والأجهزة اللازمة هو المعيار في العديد من المختبرات، لذلك فإنه عادة ما يكون الأسلوب الأول من خيار للدراسة توطين داخل الخلايا. نحن تصف البروتوكول الذي تم الأمثل لعزل mRNAs وبينما ترتبط ريبوسوم مع الميتوكوندريا. بالتالي فإن هذا البروتوكول هو الأمثل لدراسة العوامل التي تدخل في الترجمة المترجمة قرب الميتوكوندريا.

Protocol

1. الميتوكوندريا تنقية

تزن بيليه من الخلايا. ويتم الحصول على ما يقرب من 0.6 غرام من 100 مل الخلايا.

1. تنمو 100-150 مل من خلايا الخميرة إلى OD ₆₀₀ = 1-1.5 في 30 ° C على وسيط النمو nonfermentable، مثل القائم على اللبن المتوسطة النمو، من أجل إثراء للالميتوكوندريا.
2. خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتجاهل طاف.
3. غسل بيليه مع الماء المقطر مزدوجة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل طاف.
4. resuspend الكرية في 1 مل العازلة DTT في 0.5 غرام من الخلايا. فمن المهم لعلاج الخلايا مع وكيل الحد من أجل كسر السندات ثاني كبريتيد داخل جدار الخلية، وبالتالي تحسين التحلل.
5. احتضان الخلايا لمدة 10 دقيقة في 30 ° C مع الهز لطيف. وفي الوقت نفسه، تزن 6 ملغ zymolyase في 1 غرام من الخلايا وتعليقه في Zymolyase العازلة.
6. خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق لدرجة حرارة الغرفة طن وتجاهل طاف.
7. resuspend الكرية في 1 مل Zymolyase العازلة في 0.15 غرام من الخلايا. لا الدوامة.
8. قياس OD ₆₀₀ من 10 ميكرولتر قسامة من الخلايا في 990 ميكرولتر من الماء.
9. إضافة Zymolyase (الخطوة 1.5) إلى الخلايا ليتحلل الجلوكوز البوليمرات في β-1 ،3-جلوكان الروابط وتوليد spheroplasts. من هذه الخطوة، يجب أن تبقى spheroplasts في محلول متساوي التوتر من أجل تجنب تحلل.
10. احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة عند 30 درجة مئوية (للنشاط الأمثل للzymolyase) مع الهز لطيف. للتحقق من التحلل من جدار الخلية وتوليد spheroplasts، مزيج 10 ميكرولتر من الخلايا مع 990 ميكرولتر من الماء. ومن المتوقع Spheroplasts إلى ليز نظرا لفارق ناضح، والتطوير التنظيمي ₆₀₀ وينبغي على الأقل 10 أضعاف أقل من القيمة المحددة في الخطوة 1.9. إذا لم يكن كذلك، تستمر الحضانة مع zymolyase لمدة 15 دقيقة أخرى.
11. خلايا الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ديس بعنايةبطاقة طاف، وبيليه قد تكون غير مستقرة.
12. غسل spheroplasts مع Zymolyase العازلة وتجاهل طاف.
13. في resuspend spheroplasts مع 100 مل استعادة المتوسطة. نقل spheroplasts إلى دورق مخروطي واحتضان لمدة 1 ساعة على 30 ° مئوية مع الهز. هذه الخطوة التعافي من الضروري منذ خلال الترجمة العلاج Zymolyase يتم القبض عليهم وتعطل توطين مرنا (الشكل 1B).
14. إضافة 0.1 ملغ / مل فروج وspheroplasts نقل إلى precooled أنبوب 50 مل المخروطية. بالإضافة فروج المهم أن تجمد جمعية ريبوسوم 'مع mRNAs و. وبالتالي، يتم الاحتفاظ الجمعية تعتمد ريبوسوم مرنا مع الميتوكوندريا.
15. spheroplasts أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، وتجاهل طاف.
16. يغسل مرتين مع المانيتول الباردة العازلة.
17. في resuspend spheroplasts مع 4 مل الباردة العازلة المانيتول ونقلها إلى الخالط Dounce من 15 مل قدرة مجهزة ضيقةمدقة. كسر بلطف spheroplasts مع 15 السكتات الدماغية ونقل المحللة إلى أنبوب 13 مل.
18. أجهزة الطرد المركزي لالمحللة في 1،500 x ج لمدة 6 دقائق في 4 درجات مئوية لتكوير نوى الخلايا ودون انقطاع.
19. نقل بعناية طاف لأنبوب جديد. جانبا 1 مل (25٪) من العينة كعينة غير المجزأ ("إجمالي" عينة). نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية "توتال" العينة (انظر البروتوكول 3، هطول RNA).
20. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 ° C لتكوير الميتوكوندريا.
21. نقل طاف (~ 3 مل) إلى أنبوب جديد ويبقيه على الجليد. وهذا هو "عصاري خلوي" الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية. راسب الحمض النووي الريبي من بقية "عصاري خلوي" عينة (انظر بروتocol 3، هطول RNA).
22. غسل بيليه مع 3 مل المانيتول العازلة وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
23. resuspend الكرية مع 3 مل المانيتول العازلة. يحتوي هذا النموذج الميتوكوندريا، ويشار إليها باسم "الميتوكوندريا" الكسر. نقل 50 مل من هذه العينة لأنبوب جديد وإضافة 15 مل من 4X LSB للتحليل لطخة غربية.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

1. إضافة إلى كل عينة مجلد واحد من 8 M guanidinium حمض الهيدروكلوريك ومجلدين من الإيثانول بنسبة 100٪. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C.
2. عينات الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تجاهل طاف. كن حذرا كما بيليه قد تكون غير مستقرة.
3. غسل بيليه مع 70٪ ETOH.
4. resuspend الكرية مع 400 مل من الماء الخالي من ريبونوكلياز ونقل العينة إلى أنبوب إيبندورف جديدة.
5. ترسيب الحمض النووي الريبي مرة أخرى بإضافة 0.1 حجم 3 acetat M الصوديومه الرقم الهيدروجيني 5.2 ومجلدين من 100٪ ETOH. دوامة واحتضان لمدة 2 ساعة على الأقل في -20 ° C.
6. عينات الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف وتغسل مع 70٪ ETOH.
7. الهواء الجاف بيليه و resuspend مع ريبونوكلياز خالية من المياه. عينات الحمض النووي الريبي في مخزن -80 ° C. عينات يمكن استخدامها لتحليل الشمالية ¹⁹ أو تحليل ميكروأري ¹⁸ (انظر البروتوكول 3).

3. إعداد الحمض النووي الريبي لتحليل ميكروأري

1. resuspend ومرنا من الخطوة 2.2 مع 650 مل من الماء ريبونوكلياز خالية.
2. لإزالة أي الحمض النووي أو البروتينات المتبقية، إضافة حجم مساو (650 مل) من الفينول الحمضية: الكلوروفورم (5:1، ودرجة الحموضة 4.7) ودوامة بقوة. أجهزة الطرد المركزي في أقصى سرعة لمدة 2 دقيقة.
3. نقل 500 مل من المرحلة العليا (المرحلة المائية) إلى أنبوب جديد. تجنب اتخاذ البيني، كما أنه يحتوي على الحمض النووي. يكون حذرا أيضا من أخذ الفينول، والتي يمكن أن تمنع رد فعل عكس النسخ.
4. يحتوي على عينة الحمض النووي الريبي كمية كبيرة من الهيبارين، والذي هو المانع من امكانات الناسخ العكسي. وبالتالي، لRT-PCR أو ميكروأري وضع العلامات لا بد من إزالتها. إزالة الهيبارين عن طريق LiCl هطول: LiCl إضافة إلى تركيز النهائي من 2 م واحتضان عينات أكثر من ليلة في -20 ° C.
5. ذوبان الجليد العينات عند 4 درجة مئوية، وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
6. تجاهل بعناية طاف ويغسل بيليه مع الايثانول 80٪. الطرد المركزي مرة أخرى كما هو موضح في الخطوة 3.5.
7. تجاهل طاف، والهواء الجاف و resuspend بيليه في 150 مل من الماء ريبونوكلياز خالية.
8. لإزالة أي LiCl المتبقية، تترسب مرة أخرى مع 0.1 حجم 3 M الصوديوم خلات درجة الحموضة 5.3 و 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100٪. احتضان عند -20 ° مئوية لمدة 2 ساعة على الأقل.
9. أجهزة الطرد المركزي في سرعة قصوى لمدة 20 دقيقة على 4 ° C. تغسل بعناية بيليه شفافة مع 80٪ من الإيثانول والهواء الجاف.
10. resuspend وبيليه مع 25 مل ريبونوكلياز خالية المياه والحفاظ على العينات في -80 ° C.
11. اتبع الخطوات لوضع العلامات والتهجين الحمض النووي الريبي وصفها في ^18،20.

النتائج

هذا البروتوكول يسمح فصل جزء من الميتوكوندريا التي تحتوي على مكونات عصاري خلوي. أفضل طريقة لاختبار نجاحها هو إجراء تحليل الشمالية والتحليل الغربي (الشكل 1) لعينات من الخطوات عزل مختلفة. وتستمد ثلاثة معايير لجودة بمعزل عن هذه التحليلات. أولا، ما إذا كان الحمض ?...

Discussion

وكان التقدم التكنولوجي في مجال التصوير أسفرت أدوات عالية الدقة لدراسة توطين مرنا. اليوم، يمكن للمرء أن قياس حركة حتى جزيء واحد مرنا في النطاق الزمني ميللي ثانية ^23-26. حتى الآن، والنهج البيوكيميائية التقليدية، كما هو موضح أعلاه، هي أيضا غنية بالمعلومات وهي الأفض...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle