Aislamiento de ARNm asociados a la mitocondria de levadura para estudiar los mecanismos de traducción localizada

Resumen

Muchos ARNm que codifican proteínas mitocondriales se asocian con la membrana externa mitocondrias. Se describe un procedimiento de fraccionamiento subcelular destinada a aislamiento de las mitocondrias de levadura con sus ARNm y ribosomas asociados. Este protocolo se puede aplicar a las células cultivadas bajo diversas condiciones con el fin de revelar los mecanismos de la localización del mRNA y la traducción localizada cerca de las mitocondrias.

Resumen

La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo y deben ser importados en el orgánulo. Import puede ocurrir mientras que la proteína se sintetiza cerca de las mitocondrias. El apoyo a esta posibilidad se deriva de estudios recientes, en los que se muestran muchos mRNAs que codifican proteínas mitocondriales estar localizado en las proximidades mitocondrias. Junto a las manifestaciones anteriores de asociación ribosomas 'con la membrana externa, estos resultados sugieren un proceso de traducción localizada. Dicha traducción adaptada puede mejorar la eficiencia importan, suministran sitios únicos de regulación y reducir al mínimo los casos de expresión ectópica. Diversos métodos han sido utilizados para caracterizar los factores y elementos que median la traducción localizada. Estándar entre ellos es de fraccionamiento subcelular por centrifugación diferencial. Este protocolo tiene la ventaja de aislamiento de ARNm, ribosomas y proteínas en un solo procedimiento. Estos pueden ser caracterizados por diversas molecular y bimétodos ochemical. Además, transcriptómica y proteómica métodos se pueden aplicar al material resultante, por ende facilitaría ideas de todo el genoma. La utilización de la levadura como organismo modelo para tales estudios tiene las ventajas de velocidad, los costos y simplicidad. Además, las herramientas genéticas avanzadas y supresión cepas disponibles facilita la verificación de los factores de candidatos.

Introducción

Las células eucariotas están organizados en compartimentos distintos que tienen funciones específicas. Para cumplir su función, cada compartimiento contiene un conjunto único de las proteínas que son esenciales para su actividad. Un posible mecanismo a través del cual estas proteínas se acercan a su compartimento es por ^1,2 localizada traducción. En este proceso, la proteína se sintetiza en su destino por los ribosomas y mRNAs que se encuentran allí. Entre las ventajas probables de traducción adaptada aumentan la eficiencia de la focalización de proteínas, disminución de la necesidad de chaperones de la proteína, y permitiendo a los mecanismos de regulación específicos del sitio. Además, los ARNm y ribosomas localizados pueden ser un depósito aislado de la maquinaria de traducción en los casos de estrés celular, cuando se inhibe la traducción general.

Las mitocondrias se convirtió en los últimos años un modelo central para estudiar traducción localizada. La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en el núcleo, traducido en el citosol,e importado en el orgánulo. Varias líneas de evidencia indican que muchas de estas proteínas son producidas a través de un proceso de traducción local. Inicialmente, los estudios de microscopía electrónica y de fraccionamiento bioquímico detectan los ribosomas asociados con las mitocondrias ^3-5. Estos estudios en los que luego corroboraron in vivo por el trabajo en los ARNm específicos, que se encontraron se importen solamente de una manera cotraduccional ^6,7. Los estudios del genoma completo de los ARNm asociación con mitocondrias revelaron que una fracción significativa de los ARNm se localiza en las proximidades mitocondrias ^8-10. Algunos de estos ARNm se caracterizaron además por fluorescencia in vivo métodos, como el pescado o MTag ^9,11. Una interpretación sencillo de esta asociación es que estos mRNAs sirven como moldes para la traducción localizada.

Los mecanismos por los que estos ARNm se acercan a las mitocondrias son desconocidos. Dominios no codificantes (más significantly 3 'UTR), se mostró a participar en el ARNm asociación a la mitocondria ^12. Estos dominios son probablemente para servir como un sitio de unión a las proteínas de unión al ARN que median su transporte. Los estudios en levadura revelaron que un miembro de la familia de proteínas PUM (Puf3) apoya asociación ARNm con mitocondrias ^8,13. Un papel plausible para Puf3, que se basa en las funciones de otros miembros de la familia, es para inhibir la traducción mientras que el ARNm está en ruta ^14. Por lo tanto, los ARNm pueden ser transportados en un estado no traducida, por las proteínas de unión de ARN que interactúan con regiones no codificantes. Por otra parte, un gran cuerpo de trabajo sugiere que el transporte se produce mientras se sintetiza la proteína. En particular, los inhibidores de la traducción, se mostró a afectar ARNm asociación ^8,13. Además, características traducidas tales como el AUG, secuencia de direccionamiento mitocondrial (MTS) o regiones ORF se muestran para ayudar en la localización ^8,11,15. Proteína Hsp70 familiar chaperone y receptor de la proteína en la membrana externa de la mitocondria también se muestran para apoyar asociación ARNm, lo que implica que más características codificada en proteínas son importantes para la localización del mRNA ^16. Esto es consistente con un modelo en el que la proteína ribosoma-emergente sirve como elemento de reconocimiento para la orientación complejo proteína ARNm-ribosoma a la mitocondria ^17.

Traducción localizada cerca de la mitocondria fue estudiada por varios métodos, incluyendo la microscopía electrónica (para visualizar los ribosomas) ^3, FISH ^9, ARN verde (para detectar ARNm específicos) ^11, y el fraccionamiento bioquímico (para detectar tanto el ARN y ribosomas) ^10,18. Mientras que los métodos antiguos detectar la localización in vivo y pueden permitir la visualización de la dinámica de transporte, este último permite la detección de muchos ARNm diferentes en un solo experimento. Además, para los dominios de codificación de fraccionamiento bioquímico o no codificantes no necesitan ser colcados, por lo tanto, sus funciones específicas se puede evaluar. Fraccionamiento bioquímico ha sido utilizado con éxito durante muchos años, para el aislamiento de muchos diferentes compartimentos celulares. Sus directores y limitaciones están bien establecidos, y uno puede fácilmente modificar los protocolos existentes para diferentes propósitos. La instrumentación necesaria es estándar en muchos laboratorios, por lo que suele ser el primer método de elección para el estudio de la localización intracelular. Se describe un protocolo que se ha optimizado para el aislamiento de ARNm, mientras que los ribosomas están asociados con las mitocondrias. Por tanto, este protocolo es óptimo para los factores implicados en la traducción localizada cerca de las mitocondrias estudiando.

Protocolo

1. Las mitocondrias Purificación

Pesar el pellet de células. Aproximadamente 0,6 g se obtienen a partir de células 100 ml.

1. Crecer 100-150 ml de células de levadura a OD ₆₀₀ = 1-1,5 a 30 ° C en un medio de crecimiento no fermentable, como medio de crecimiento a base de galactosa, con el fin de enriquecer para las mitocondrias.
2. Centrifugar las células a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente y deseche el sobrenadante.
3. Lavar el precipitado con agua destilada dos veces y centrifugar de nuevo. Eliminar el sobrenadante.
4. Resuspender el precipitado en 1 ml de tampón por TDT 0,5 g de células. Es importante para el tratamiento de las células con un agente reductor con el fin de romper los enlaces disulfuro dentro de la pared celular, mejorando de este modo la hidrólisis.
5. Se incuban las células durante 10 min a 30 ° C con agitación suave. Mientras tanto, sopesar 6 mg zimoliasa por 1 g de células y suspender en tampón de Zymolyase.
6. Centrifugar las células a 3000 × g durante 5 min atemperatura t habitación y descartar el sobrenadante.
7. Resuspender el precipitado en 1 ml de Zymolyase tampón por 0,15 g de células. No vórtice.
8. Mida OD ₆₀₀ de 10 l alícuota de las células en 990 l de agua.
9. Añadir Zymolyase (paso 1,5) a las células para hidrolizar polímeros de glucosa en las β-1 ,3-glucano vínculos y generar esferoplastos. Desde este paso, esferoplastos se deben mantener en una solución isotónica a fin de evitar la lisis.
10. Se incuban las células durante 15 min a 30 ° C (para la actividad óptima de zimoliasa) con agitación suave. Para verificar la hidrólisis de la pared celular y la generación de esferoplastos, mezclar 10 l de las células con 990 l de agua. Se espera Esferoplastos para lisar debido a la diferencia osmótica y el OD ₆₀₀ deben ser por lo menos 10 veces menor que el valor determinado en el paso 1.9. Si no, continuar la incubación con zimoliasa durante otros 15 minutos.
11. Centrifugar las células a 3000 xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Dis cuidadosamentetarjeta el sobrenadante, el pellet como podría ser inestable.
12. Lave esferoplastos con Zymolyase Buffer y descartar el sobrenadante.
13. Resuspender esferoplastos con 100 ml de medio de recuperación. Transferencia de esferoplastos a un matraz Erlenmeyer y se incuba durante 1 hora a 30 ° C con agitación. Esta etapa de recuperación es necesario ya que durante la traducción en el tratamiento Zymolyase está detenido y la localización del mRNA se interrumpe (Figura 1B).
14. Añadir 0,1 mg / ml de CHX y esferoplastos de transferencia a un tubo cónico de 50 ml previamente enfriado. Además CHX es importante para congelar asociación 'con los ribosomas ARNm. Por lo tanto, se mantiene ribosomas dependientes de ARNm asociación con las mitocondrias.
15. Esferoplastos se centrifuga a 3000 × g durante 5 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante.
16. Lavar dos veces con frío Manitol Buffer.
17. Resuspender esferoplastos con 4 ml de frío Manitol Buffer y transferirlos a un homogeneizador Dounce de 15 ml de capacidad equipado con cierre bienmaja. Romper suavemente esferoplastos con 15 golpes y transferir el lisado a un tubo de 13 ml.
18. Centrifugar el lisado a 1.500 xg durante 6 min a 4 º C para sedimentar los núcleos y las células sin romper.
19. Transferir con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo. Ponga a un lado 1 ml (25%) de la muestra como una muestra no fraccionada ("total" de la muestra). Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4X LSB para el análisis de Western blot. El precipitado de ARN del resto de la muestra "Total" (Ver Protocolo 3, RNA precipitación).
20. Centrifugar el sobrenadante a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para sedimentar las mitocondrias.
21. Transferir el sobrenadante (~ 3 ml) a un nuevo tubo y se mantiene en hielo. Esta es la fracción "citosólica". Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4x LSB para el análisis de Western blot. El precipitado de ARN del resto de la muestra "citosólica" (Ver Prot.Ocol 3, ARN precipitación).
22. Lavar el precipitado con 3 ml de manitol tampón y se centrifuga de nuevo a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
23. Resuspender el precipitado con 3 ml Manitol Buffer. Este ejemplo contiene las mitocondrias, y se refiere como fracción "mitocondrias". Transferencia de 50 ml de esta muestra a un tubo nuevo y añadir 15 ml de 4x LSB para el análisis de Western blot.

2. La extracción de RNA

1. Añadir a cada muestra un volumen de M guanidinio-HCl 8 y dos volúmenes de etanol 100%. Agitar e incubar durante al menos 2 horas a -20 ° C.
2. Centrifugar las muestras a 10.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Desechar el sobrenadante. Ten cuidado ya que la pastilla puede ser inestable.
3. Lavar el precipitado con 70% de EtOH.
4. Resuspender el precipitado con 400 ml de agua libre de RNasa y transferir la muestra a un nuevo tubo Eppendorf.
5. Precipitar el ARN de nuevo mediante la adición de 0,1 volumen de 3 M acetato de sodioe pH 5,2 y dos volúmenes de EtOH al 100%. Agitar e incubar durante al menos 2 horas a -20 ° C.
6. Centrifugar las muestras a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y lavar con EtOH al 70%.
7. Secar el pellet y resuspender con RNasa libre de agua. Las muestras de ARN Almacenar a -80 ° C. Las muestras pueden ser utilizados para el análisis de Northern ¹⁹ o el análisis de microarrays ¹⁸ (Véase el Protocolo 3).

3. Preparación del ARN para el análisis de microarrays

1. Resuspender el ARNm de la etapa 2.2 con 650 ml de agua libre de RNasa.
2. Para eliminar cualquier ADN residual o proteínas, añadir el mismo volumen (650 ml) de fenol ácido: cloroformo (5:1, pH 4.7) y agitar vigorosamente. Centrifugar a máxima velocidad durante 2 min.
3. Transferir 500 ml de la fase superior (la fase acuosa) a un nuevo tubo. Evite tomar la interfase, ya que contiene el ADN. También tenga cuidado de tomar fenol, que puede inhibir la reacción de transcripción inversa.
4. La muestra de ARN contiene una cantidad significativa de heparina, que es un potente inhibidor de la transcriptasa inversa. Por lo tanto, para la RT-PCR o microarrays de etiquetado que tiene que ser eliminado. Retire la heparina por precipitación con LiCl: añadir LiCl a una concentración final de 2 M y se incuban las muestras durante la noche a -20 ° C.
5. Descongele las muestras a 4 ° C y se centrifuga a 20.000 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Desechar con cuidado el sobrenadante y lavar el precipitado con etanol al 80%. Centrifugar de nuevo como se describe en el paso 3.5.
7. Desechar el sobrenadante, secar al aire y resuspender el precipitado en 150 ml de agua libre de RNasa.
8. Para eliminar cualquier residuo de LiCl, precipitar de nuevo con 0,1 volumen de acetato sódico 3 M pH 5,3 y 3 volúmenes de etanol 100%. Incubar a -20 ° C durante al menos 2 h.
9. Centrifugar a máxima velocidad durante 20 minutos a 4 ° C. Lave cuidadosamente la bolita transparente con etanol al 80% y secar al aire.
10. Resuspender elpellet con 25 ml de agua libre de ARNasa y mantener las muestras a -80 ° C.
11. Siga los pasos para el etiquetado y la hibridación de ARN descrito en ^18,20.

Resultados

Este protocolo permite la separación de una fracción que contiene mitocondrias-a partir de componentes citosólicos. La mejor manera de probar su éxito es para llevar a cabo análisis de Northern y análisis de Western (Figura 1) a las muestras de las diferentes etapas de aislamiento. Tres parámetros para la calidad de aislamiento se derivan de estos análisis. En primer lugar, si el ARN o proteínas en las muestras están intactos - éstos serán detectados como bandas distintas en los análisis. E...

Discusión

Los avances tecnológicos en las imágenes habían dado las herramientas de alta resolución para estudiar la localización del mRNA. Hoy en día, se puede medir el movimiento de incluso una sola molécula de ARNm en la escala de tiempo mseg ^23-26. Sin embargo, los enfoques bioquímicos tradicionales, como el descrito anteriormente, también son informativos y son preferibles en algunos casos. Aislamiento bioquímica permite la purificación de un gran repertorio de los ARNm y proteínas, y por tanto es prefe...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle