Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Özet

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Özet

Mitokondriyal proteinlerin çoğu çekirdeğine kodlanmış ve organel içine ithal edilecek ihtiyacı vardır. Protein, mitokondri yakın sentezlenir Alma oluşabilir. Bu olasılığı için destek mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri civarı lokalize edilmesi gösterilmiştir edildiği son çalışmalar, türetilmiştir. Birlikte dış zar ile ribozomların 'derneği önceki gösterileri ile, bu sonuçlar yerelleştirilmiş bir çeviri sürecini öneririz. Bu tür lokalize çeviri, ithalat verimliliğini artırmak benzersiz düzenleme siteleri sağlamak ve ektopik ifade vakalarını minimize edebilir. Çeşitli yöntemler lokalize çeviri aracılık faktörler ve unsurları karakterize etmek için kullanılmıştır. Bunlar arasında standart diferansiyel santrifüjle hücre içi fraksiyonlarının. Bu protokol, tek bir prosedür olarak mRNA, ribozomlar ve proteinlerinin izolasyonu gibi bir avantajı vardır. Bunlar daha sonra çeşitli moleküler ve bi karakterize edilebilirochemical yöntemleri. Ayrıca, transkriptomik ve proteomik yöntemleri böylece genom çapında derin bir bakış açısı sağlar, elde edilen malzemeye uygulanabilir. Bu çalışmalar için bir model organizma olarak maya kullanımı hızı, maliyetler ve basitlik avantajları vardır. Ayrıca, gelişmiş bir genetik araçları ve mevcut silme suşları aday faktörlerin incelenmesini kolaylaştırmak.

Giriş

Ökaryotik hücreler, belirli işlevleri olan farklı bölümlerinde düzenlenmektedir. Bu fonksiyonu yerine getirmek için, her bir bölme bu etkinlik için temel olan protein benzersiz bir dizi içerir. Bu proteinler bölmesini hangi yaklaşımı sayesinde mümkün olan bir mekanizma lokalize çeviri ^1,2 gereğidir. Bu işlemde, protein ribozomlar ve orada bulunan mRNA tarafından hedefe sentezlenir. Lokalize çeviri muhtemel avantajları protein hedeflemesi verimliliği artmış arasında protein chaperones ihtiyacının azalması ve site-spesifik düzenleme mekanizmalarını sağlayarak. Ayrıca, lokalize mRNAlarının ve ribozomlar genel çeviri inhibe hücresel stres, durumlarında çeviri makine tenha bir rezervuar olabilir.

Mitokondri son yıllarda lokalize çeviri incelemek için merkezi bir model oldu. En mitokondri proteinleri, sitosol tercüme çekirdeğinde, kodlanmıştırve organel içine ithal. Kanıtlar çeşitli çizgiler, bu proteinler çoğu yerel için bir süreç yoluyla üretilmiş olduğunu göstermektedir. Başlangıçta, elektron mikroskobu ve biyokimyasal bölme çalışmaları mitokondri ^3-5 ile ilişkili ribozomlan algılandı. Sonra sadece bir cotranslational şekilde ^6,7 ithal edilecek bulundu belirli mRNA'lardan çalışmalardan in vivo doğrulanmıştır Bu çalışmalar. Mitokondri ile ilişkili mRNA genom çalışmalar mRNA önemli bir kısmı mitokondri civarı ^8-10 lokalize olduğunu ortaya çıkardı. Bu mRNA bazıları ayrıca, balık veya MTAG ^9,11 olarak in vivo floresan yöntemler ile karakterize edilmiştir. Bu derneğin bir düz ileri yorumlama bu mRNAlarının lokalize çeviri için şablon olarak hizmet olmasıdır.

Bu mRNAları mitokondri yaklaşım hangi mekanizmalar bilinmemektedir. Noncoding etki (en significantly 3 'UTRs) mitokondri ¹² mRNA birlikte dahil olmak gösterilmiştir. Bu etki kendi taşıma aracılık eden RNA bağlayıcı proteinlere bir bağlama alanı olarak hizmet etmek olasıdır. Mayada çalışmalar proteinlerin PUM ailesinin (Puf3) üyesi mitokondri ^8,13 ile mRNA ilişki desteklediğini göstermiştir. Diğer aile üyelerinin fonksiyonları dayanmaktadır Puf3 için mantıklı bir rolü, mRNA rota ¹⁴ tr ise çeviri inhibe etmektir. Bu durumda, mRNA kodlayıcı olmayan bölgeler ile etkileşime RNA bağlayıcı protein tarafından, bir çevrilmemiş durumu nakledilebilir. Seçenek olarak ise, işin büyük bir gövde, protein sentez edilirken taşıma cereyan ettiğini ortaya çıkarmaktadır. Özellikle de, çeviri inhibitörleri mRNA'lar ilişki ^8,13 etkilediği gösterilmiştir. Ayrıca, bu tür Ağustos olarak tercüme özellikleri, mitokondriyal hedefleme sekansı (MTS) ya da ORF bölgeler lokalizasyon ^8,11,15 yardımcı gösterilmiştir. Hsp70-family protein chmitokondri dış zar üzerinde aperone ve protein reseptör daha da kodlanmış protein özellikleri mRNA lokalizasyonu ¹⁶ için önemli olduğunu ima, mRNA ilişki destek gösterilmiştir. Bu, ribozom ortaya çıkan protein mitokondri ¹⁷ mRNA ribozom-protein kompleksi hedefleme için tanıma elemanı olarak hizmet ettiği bir modelle tutarlıdır.

Mitokondri yakın olarak lokalize için elektron mikroskopisi (ribozomlar görselleştirmek için) ^3, FISH ^9, (spesifik mRNA tespit etmek için), yeşil RNA ¹¹ ve biyokimyasal fraksiyonasyon (RNA ve hem ribozomlar tespit etmek için) ^10,18 dahil olmak üzere çeşitli yöntemler ile araştırılmıştır. Eski yöntemler, canlı ortam içinde lokalizasyonu tespit etmek ve taşıma dinamikleri görselleştirme izin verirken, ikinci tek bir deneyde bir çok farklı mRNA tespiti sağlar. Ayrıca, biyokimyasal ayırma kodlayıcı veya kodlayıcı olmayan bir etki için al olması gerekmezolarak girilir, bu nedenle belirli bir rolleri değerlendirilebilir. Biyokimyasal ayırma başarılı bir şekilde bir çok farklı hücre bölmelerinin izole edilmesi için, uzun yıllardır kullanılmaktadır. Onun ilke ve sınırlamaları iyi kurulmuş, ve kolayca farklı bir amaç için mevcut protokolleri değiştirebilirsiniz. Gerekli enstrümantasyon, bu nedenle genellikle hücre içi lokalizasyonu eğitim için tercih edilen ilk yöntemdir, birçok laboratuvar standarttır. Biz, ribozomlar mitokondri ile ilişkili ise mRNA izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol açıklar. Bu protokol, bu nedenle mitokondri yakın lokalize çeviri katılan faktörleri incelemek için en uygunudur.

Protokol

1.. Mitokondri Arıtma

Hücre pelet tartılır. Yaklaşık 0.6 g 100 mi hücrelerden elde edilir.

1. 30 ° C'de ₆₀₀ = 1-1,5 OD maya hücrelerinin 100-150 ml büyümek Mitokondri için zenginleştirmek için, bu tür galaktoz bazlı bir büyüme ortamı olarak bir nonfermentable büyüme ortamı, üzerinde C °.
2. Santrifüj hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın.
3. Yine iki kere damıtılmış su ve santrifüj ile pelet yıkayın. Süpernatant atın.
4. Hücrelerin 0.5 gramı başına 1 ml DTT tampon içinde pelletini. Böylece, hidroliz geliştirilmesi, hücre duvarı içinde disülfid bağları kırmak amacıyla bir indirgeme maddesi ile hücreleri tedavi etmek için önemlidir.
5. 30 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe hücreleri Nazik sallayarak C °. Öte yandan, hücreler 1 gramı başına 6 mg ağırlığında ve askiyle sonuçlanır ki askiyle sonuçlanır ki Tamponu içinde askıya.
6. 5 dk a boyunca 3.000 xg'de Santrifüj hücrelerit oda sıcaklığı ve süpernatant atın.
7. Hücrelerin 0.15 g başına 1 mi askiyle sonuçlanır ki Tampon pelet tekrar. Vorteks.
8. 990 ul su içindeki hücrelerin 10 ul alikotunun OD ₆₀₀ ölçün.
9. Β-1 ,3-glukan bağları glikoz polimerler, hidrolize ve sferoplastlar oluşturmak için, hücrelere askiyle sonuçlanır ki (adım 1.5) ilave edin. Bu aşama, sferoplastlar lizis önlemek amacıyla bir izotonik çözelti içinde tutulmalıdır.
10. Hafif sallama ile 30 ° C (askiyle sonuçlanır ki optimal aktivitesi için) 15 dakika boyunca inkübe hücreleri. Hücre duvarı ve sferoplastlar nesil hidroliz doğrulamak için, 990 ul su ile hücrelerin 10 ul karıştırın. Spheroplastlar nedeniyle osmotik farkı lize beklenmektedir ve OD ₆₀₀ aşamasında, en azından 1.9 belirlenen değerden daha düşük 10 misli olmalıdır. Aksi takdirde, başka bir 15 dakika boyunca inkübasyon askiyle sonuçlanır ki bu devam eder.
11. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3000 x g'de santrifüjleyin hücreleri. Dikkatle diskart süpernatan, pelet olarak kararsız olabilir.
12. Askiyle sonuçlanır ki Tampon ile spheroplastlar yıkayın ve süpernatant atın.
13. 100 ml Kurtarma ortamı ile spheroplastlar süspanse edin. Bir Erlenmeyer şişeye spheroplastlar aktarın ve 30 ° C'de 1 saat boyunca inkübe Çalkalanarak C °. Askiyle sonuçlanır ki tedavi çeviri sırasında tutuklandı ve mRNA lokalizasyon (Şekil 1B) bozulur çünkü bu kurtarma adım gereklidir.
14. Bir soğutulmuş 50 ml konik tüp, 0.1 mg / ml cHx ve transfer spheroplastlar ekleyin. CHX ilave mRNA'larla ribozomlarla 'dernek dondurmak için önemlidir. Böylece, mitokondri ile ribozomlar-bağımlı mRNA ilişki korunur.
15. Santrifüj sferoplastlar 'ı içerir, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 3000 x g ve supernatant atın.
16. Soğuk Mannitol Tampon ile iki kez yıkayın.
17. 4 ml soğuk tampon ile Mannitol spheroplastlar yeniden süspanse edin ve sıkı geçme ile donatılmış 15 ml kapasiteli bir Dounce homojenizatör aktarınpestle. Yavaşça 15 darbelerle spheroplastlar kırmak ve bir 13 ml tüp lizat aktarın.
18. Çekirdek ve kesintisiz hücrelerini pellet haline getirmek üzere, 4 ° C'de 6 dakika boyunca 1500 x g'de lizat santrifüj.
19. Dikkatle yeni bir tüp süpernatant aktarın. Bölünmemiş bir örnek ("Toplam" örneği) olarak bir yana numunenin 1 ml (% 25) olarak ayarlayın. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için 4X LSB 15 ml ekleyin. "Toplam" numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protokol 3, RNA çökeltme bakınız).
20. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüje süpernatan Mitokondri pelet için C °.
21. Yeni bir tüp süpernatant (~ 3 ml) aktarın ve buz üzerinde tutmak. Bu "Sitosolik" bölümüdür. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin. "Sitosolik" numunenin geri kalanından Çökelti RNA (Protocol 3, RNA yağış).
22. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 10,000 x g'de tekrar 3 ml Tampon Mannitol ve santrifüj ile pelet yıkayın
23. 3 ml mannitol Tampon ile pelletini. Bu örnek, mitokondri içerir ve "Mitokondri" fraksiyonu olarak adlandırılır. Yeni bir tüpe aktarın Bu örneğin 50 ml ve western blot analizi için LSB 4x 15 ml ekleyin.

2. RNA Ekstraksiyon

1. Her bir örnek 8 M guanidinyum-HCl, bir hacim ve% 100 etanolden iki hacmin ekle. Vorteks ve -20 ° C'de en az 2 saat boyunca inkübe ° C.
2. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri ° C. Süpernatant atın. Pelet kararsız olabilir dikkatli olun.
3. % 70 EtOH ile pelet yıkayın.
4. RNase-içermeyen su içinde 400 ml pelet yeniden süspanse edin ve yeni bir Eppendorf tüpüne örnek aktarın.
5. 3 M sodyum Etilasetat 0.1 hacim ilave edilerek RNA Çökeltie pH 5.2 ve% 100 EtOH iki hacimleri. Vorteks ve -20 ° C'de en az 2 saat boyunca inkübe ° C.
6. 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 x g'de santrifüjleyin örnekleri Süpernatantı atın ve% 70 EtOH ile yıkayın.
7. Hava pelet kuru ve RNase-barındırmayan su ile yeniden süspanse edin. -80 ° C'de saklayın RNA numuneleri ° C. Örnekler Northern analizinde ¹⁹ ya da mikro-dizi analizi ¹⁸ (Protokol 3 bak) için kullanılabilir.

3. Mikrodizi Analizi RNA hazırlanması

1. RNase-içermeyen su içinde 650 ml aşama 2.2 'den mRNA yeniden süspanse edin.
2. Kuvvetli bir şekilde kloroform (5:1, pH 4.7) ve vorteks: herhangi bir kalıntı DNA ya da proteinleri çıkarmak için, eşit asidik fenol hacmi (650 mi) ilave edin. 2 dakika boyunca maksimum hızda santrifüj.
3. Yeni bir tüpe, üst faz (sulu faz) 500 ml aktarın. DNA'yı içerdiği gibi, interfazda almaktan kaçının. Ayrıca, ters transkripsiyon reaksiyonu inhibe fenol, alma dikkat edin.
4. RNA örnek ters transkriptazın bir inhibitörü olan heparin önemli bir miktarda içerir. Böylece, RT-PCR veya mikroarray etiketleme için kaldırılması gerekmektedir. LiCI çökeltme yoluyla heparin çıkarmak: 2 M bir son konsantrasyona kadar LiCI ekleyin ve -20 ° C'de gece boyunca inkübe örnekleri ° C.
5. 4 ° C'de örnekleri Çözülme ° C ve 4 ° C'de 20 dakika boyunca 20,000 xg'de santrifüj
6. Dikkatlice süpernatant atın ve% 80 etanol ile pelet yıkayın. Aşama 3.5 de tarif edildiği gibi tekrar santrifüj.
7. Süpernatantı, kuru hava atın ve RNase-içermeyen su içinde 150 ml pelet tekrar süspansiyon.
8. Herhangi bir artık LiCI kaldırmak için, 3 M sodyum asetat pH 5.3 ve 0.1 hacim% 100 etanol içinde 3 hacim ile tekrar çökeltilmesi. -20 ° C de inkübe En az 2 saat boyunca ° C.
9. 4 ° C'de 20 dakika boyunca en yüksek hızda santrifüje ° C. % 80 etanol ve kuru hava ile dikkatlice şeffaf pelet yıkayın.
10. Süspanse25 ml RNase içermeyen su ile pelet ve -80 ° C'de örnekleri tutmak ° C.
11. ^18,20 açıklanan RNA etiketleme ve melezleme için adımları izleyin.

Sonuçlar

Bu protokol, sitosolik bileşenlerden bir mitokondri içeren fraksiyonu ayrılmasını sağlar. Başarısını test etmek için en iyi yolu, farklı izolasyon adımlardan örnekler kuzey analizi ve batı analizi (Şekil 1) yapmaktır. Izolasyon kalitesi için üç parametre, bu analizlerden elde edilir. İlk olarak, örneklerde, RNA ya da protein bozulmamış olsun - bu analizlerde ayrı bantlar olarak tespit edilecektir. Parçalanma olaylar ilave, kısa bantlar veya smear görünümünü neden olacakt?...

Tartışmalar

Görüntülemede Teknolojik gelişmeler mRNA yerelleştirme incelemek için yüksek çözünürlüklü araçları vermiştir. Bugün, bir msn zaman ölçeği ^23-26 hatta tek bir mRNA molekülünün hareketini ölçebilirsiniz. Bununla birlikte, geleneksel biyokimyasal yaklaşımlar, yukarıda tarif edilen gibi, aynı zamanda bilgi ve bazı durumlarda tercih edilir. Biyokimyasal izolasyon mRNA ve proteinlerin büyük bir repertuar saflaştırılmasını sağlar ve genom çalışmaları için bu nedenle tercih ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle