Isolamento di mRNA associati con mitocondri di lievito per studiare i meccanismi di traduzione localizzata

Riepilogo

Molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali sono associate alla membrana esterna mitocondriale. Descriviamo una procedura di frazionamento subcellulare volta a isolamento dei mitocondri di lievito con i suoi mRNA e ribosomi associati. Questo protocollo può essere applicato a cellule cresciute in condizioni diverse per rivelare meccanismi di localizzazione mRNA e traduzione localizzata vicino ai mitocondri.

Abstract

La maggior parte delle proteine ​​mitocondriali sono codificati nel nucleo e devono essere importati nel organello. Import può verificarsi durante la proteina è sintetizzata nei pressi dei mitocondri. Il supporto per questa possibilità deriva da studi recenti, in cui molti mRNA codificanti proteine ​​mitocondriali hanno dimostrato di essere localizzato nei pressi mitocondri. Insieme con dimostrazioni precedenti di associazione ribosomi 'con la membrana esterna, questi risultati suggeriscono un processo di traduzione localizzata. Tale traduzione localizzata può migliorare l'efficienza di importazione, di fornire siti di regolazione unici e ridurre al minimo i casi di espressione ectopica. Diversi metodi sono stati utilizzati per caratterizzare i fattori ed elementi che mediano traduzione localizzata. Standard tra questi è frazionamento subcellulare mediante centrifugazione differenziale. Questo protocollo ha il vantaggio di isolamento di mRNA, ribosomi e proteine ​​in una singola procedura. Questi possono poi essere caratterizzata da diverse molecolare e biMetodi ochemical. Inoltre, trascrittomica e proteomica metodi possono essere applicati al materiale risultante, permettendo quindi intuizioni genoma di ampiezza. L'utilizzo di lievito come organismo modello per tali studi ha i vantaggi di velocità, costi e semplicità. Inoltre, gli strumenti genetici avanzati e ceppi di delezione disponibili agevolare la verifica dei fattori candidati.

Introduzione

Le cellule eucariotiche sono organizzate in compartimenti distinti aventi funzioni specifiche. Per realizzare la sua funzione, ciascun compartimento contiene un insieme unico di proteine ​​che sono essenziali per la sua attività. Un possibile meccanismo attraverso il quale queste proteine ​​si avvicinano loro scompartimento è di ^1,2 traduzione localizzata. In questo processo, la proteina è sintetizzata a destinazione ribosomi e mRNA che si trovano lì. Tra i probabili vantaggi di una versione localizzata sono aumentati efficienza della proteina targeting, ridotto bisogno di accompagnatori di proteine, e consentendo meccanismi di regolazione site-specific. Inoltre, mRNA e ribosomi in lingua possono essere un serbatoio appartata di macchinari traduzione in casi di stress cellulare, quando la traduzione generale è inibita.

I mitocondri è diventato negli ultimi anni un modello centrale per lo studio di traduzione localizzata. La maggior parte delle proteine ​​mitocondri sono codificate nel nucleo, tradotto nel citosol,e importati nel organello. Varie evidenze indicano che molte di queste proteine ​​sono prodotte attraverso un processo di traduzione locale. Inizialmente, gli studi di microscopia elettronica e di frazionamento biochimico rilevati ribosomi associati con i mitocondri ^3-5. Questi studi dove poi corroborati in vivo dal lavoro su specifici mRNA, che sono stati trovati ad essere importati solo in modo ^6,7 cotranslational. Studi genoma di ampiezza di mRNA associazione con mitocondri rivelato che una frazione significativa di mRNA sono localizzate ai mitocondri vicinanze ^8-10. Alcuni di questi mRNA sono stati ulteriormente caratterizzati dal vivo fluorescenza metodi, come il pesce o MTAG ^9,11. Un'interpretazione straight-forward di questa associazione è che questi mRNA servono come modelli per la traduzione localizzata.

I meccanismi con cui questi mRNA avvicinano i mitocondri sono sconosciute. Domini non codificanti (più significantly 3 'UTR) hanno dimostrato di essere coinvolti in mRNA associazione ai mitocondri ^12. Questi domini sono suscettibili di servire come un sito di legame di RNA-binding proteins che mediano il loro trasporto. Gli studi in lievito hanno rivelato che un membro della famiglia PUM delle proteine ​​(Puf3) supporta mRNA associazione con mitocondri ^8,13. Un ruolo plausibile per Puf3, che si basa su funzioni di altri membri della famiglia, è quello di inibire traduzione mentre il mRNA è rotta ^14. Così, mRNA possono essere trasportati in uno stato nontranslated, da RNA proteine ​​leganti che interagiscono con le regioni non codificanti. In alternativa, un grande corpo di lavoro suggerisce che il trasporto avviene mentre la proteina viene sintetizzata. In particolare, gli inibitori di traduzione sono stati mostrati ad incidere mRNA associazione ^8,13. Inoltre, caratteristiche tradotte come l'AUG, sequenza di targeting mitocondriale (MTS) o regioni ORF sono stati indicati come ausilio nella localizzazione ^8,11,15. Hsp70-famiglia di proteine ​​chaperone e proteina recettore sulla membrana esterna mitocondriale anche stati mostrati per sostenere associazione mRNA, ulteriormente implicando che funzioni codificate proteine ​​sono importanti per la localizzazione mRNA ^16. Questo è coerente con un modello in cui la proteina-ribosoma emergente serve come elemento di riconoscimento per il targeting complesso mRNA-ribosoma-proteina ai mitocondri ^17.

Traduzione localizzata vicino mitocondri è stato studiato con vari metodi, tra cui la microscopia elettronica (per visualizzare ribosomi) ^3, FISH ^9, RNA verde (per rilevare specifici mRNA) ^11, e frazionamento biochimico (a rilevare sia RNA e ribosomi) ^10,18. Mentre i metodi precedenti rilevano localizzazione in vivo e può permettere la visualizzazione delle dinamiche di trasporto, quest'ultimo permette la rilevazione di molti mRNA differenti in un singolo esperimento. Inoltre, per i domini biochimica codifica frazionamento o non codificanti non hanno bisogno di essere alfiltranti quindi i loro ruoli specifici può essere valutato. Frazionamento biochimico è stato utilizzato con successo per molti anni, per l'isolamento di molti compartimenti cellulari diversi. I suoi principi e le limitazioni sono ben stabiliti, e si può facilmente modificare i protocolli esistenti per scopi diversi. La strumentazione necessaria è standard in molti laboratori, quindi di solito è il primo metodo di scelta per studiare la localizzazione intracellulare. Descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per l'isolamento di mRNA mentre ribosomi sono associati con i mitocondri. Questo protocollo è quindi ottimale per studiare fattori coinvolti in una versione localizzata vicino mitocondri.

Protocollo

1. I mitocondri Purificazione

Pesare il pellet di cellule. Circa 0,6 g si ottengono da cellule di 100 ml.

1. Crescere 100-150 ml di cellule di lievito di OD ₆₀₀ = 1-1.5 al 30 ° C su un terreno di crescita non fermentabili, come mezzo di crescita a base-galattosio, per arricchire di mitocondri.
2. Centrifugare le cellule a 3.000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e scartare il surnatante.
3. Lavare il pellet con acqua bidistillata e centrifugare di nuovo. Scartare il surnatante.
4. Risospendere il pellet in 1 ml DTT tampone in 0,5 g di cellule. È importante trattare le cellule con un agente riducente per rompere i legami disolfuro all'interno della parete cellulare, migliorando così idrolisi.
5. Incubare le cellule per 10 min a 30 ° C con un leggero scuotimento. Nel frattempo, pesare 6 mg zymolyase per 1 g di cellule e di sospendere in Zymolyase Buffer.
6. Centrifugare le cellule a 3.000 xg per 5 min atemperatura t camera e scartare il surnatante.
7. Risospendere il pellet in 1 ml di tampone per Zymolyase 0,15 g di cellule. Non vortex.
8. Misurare OD ₆₀₀ di 10 microlitri aliquota di cellule in 990 ml di acqua.
9. Aggiungere Zymolyase (passo 1.5) alle cellule di idrolizzare polimeri del glucosio a β-1 ,3-glucano collegamenti e generare sferoplasti. Da questo punto, sferoplasti devono essere conservati in una soluzione isotonica per evitare lisi.
10. Incubare le cellule per 15 min a 30 ° C (per attività ottimale di zymolyase) agitando delicatamente. Per verificare idrolisi della parete cellulare e sferoplasti generazione, mescolare 10 ml di cellule con 990 ml di acqua. Sferoplasti sono attesi per lisare dovuto la differenza osmotica, e la OD ₆₀₀ devono essere almeno 10 volte inferiore al valore determinato nella fase 1.9. In caso contrario, continuare l'incubazione con zymolyase per altri 15 min.
11. Cellule centrifugare a 3000 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Dis cautelacarta il surnatante, il pellet come potrebbe essere instabile.
12. Lavare sferoplasti con Zymolyase Buffer e scartare il surnatante.
13. Risospendere sferoplasti con 100 ml di media Recovery. Trasferire sferoplasti ad una beuta e incubare per 1 ora a 30 ° C con agitazione. Questo passaggio di recupero è necessario in quanto durante la definizione Zymolyase trattamento viene arrestato e localizzazione mRNA viene interrotto (Figura 1B).
14. Aggiungere 0,1 mg / ml CHX e trasferimento sferoplasti preraffreddato ad un tubo da 50 ml. CHX aggiunta è importante per congelare l'associazione ribosomi 'con mRNA. Così, ribosomi-dipendenti mRNA associazione con i mitocondri è mantenuta.
15. Sferoplasti centrifugare a 3000 xg per 5 minuti a 4 ° C e scartare il surnatante.
16. Lavare due volte con il freddo mannitolo Buffer.
17. Risospendere sferoplasti con 4 ml di freddo mannitolo buffer e trasferirli in un omogeneizzatore Dounce di 15 ml, dotato di chiusura ermeticapestello. Rompere delicatamente sferoplasti con 15 colpi e trasferire il lisato in una provetta da 13 ml.
18. Centrifugare il lisato a 1.500 xg per 6 minuti a 4 ° C a pellet nuclei e cellule intatte.
19. Trasferire con attenzione il surnatante in una nuova provetta. Mettere da parte 1 ml (25%) del campione come un campione non frazionata (campione "Totale"). Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4X LSB per l'analisi western blot. RNA precipitato dal resto del campione "Totale" (Vedi protocollo 3, RNA precipitazione).
20. Centrifugare il surnatante a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per far sedimentare i mitocondri.
21. Trasferire il surnatante (~ 3 ml) in una nuova provetta e mantenere in ghiaccio. Questa è la frazione "citosolico". Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4x LSB per l'analisi western blot. RNA precipitato dal resto del campione "citosolico" (Vedi Protocol 3, RNA precipitazione).
22. Lavare il pellet con 3 ml Mannitolo Buffer e centrifugare nuovamente a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C.
23. Risospendere il pellet con 3 ml di mannitolo Buffer. Questo esempio contiene i mitocondri, e indicato come frazione "mitocondri". Trasferimento 50 ml di questo campione a un nuovo tubo e aggiungere 15 ml di 4x LSB per l'analisi western blot.

2. RNA Estrazione

1. Aggiungere a ciascun campione un volume di 8 M guanidina-HCl e due volumi di etanolo al 100%. Vortex e incubare per almeno 2 ore a -20 ° C.
2. Centrifugare i campioni a 10.000 xg per 20 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Fare attenzione a come il pellet potrebbe essere instabile.
3. Lavare il pellet con il 70% EtOH.
4. Risospendere il pellet con 400 ml di acqua priva di RNasi e trasferire il campione in una nuova provetta Eppendorf.
5. Precipitare nuovamente l'RNA aggiungendo 0,1 volume di 3 M acetato di sodioe pH 5.2 e due volumi di 100% EtOH. Vortex e incubare per almeno 2 ore a -20 ° C.
6. Centrifugare i campioni a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C. Eliminare il surnatante e lavare con il 70% EtOH.
7. Far asciugare il pellet e risospendere con acqua RNase-free. Conservare i campioni di RNA a -80 ° C. I campioni possono essere usate per analisi Northern ¹⁹ o analisi microarray ¹⁸ (Vedi protocollo 3).

3. Preparazione del RNA per l'analisi Microarray

1. Risospendere il mRNA dal punto 2.2 con 650 ml di acqua RNase-free.
2. Per rimuovere eventuali residui di DNA o di proteine, aggiungere un volume uguale (650 ml) di acido fenolo: cloroformio (5:1, pH 4.7) e agitare vigorosamente. Centrifugare alla massima velocità per 2 min.
3. Trasferire 500 ml della fase superiore (fase acquosa) in una nuova provetta. Evitare di prendere l'interfase, in quanto contiene il DNA. Fate anche attenzione di prendere fenolo, che può inibire la reazione di trascrizione inversa.
4. Il campione di RNA contiene una notevole quantità di eparina, che è un potente inibitore della trascrittasi inversa. Così, per RT-PCR o etichettatura microarray deve essere rimosso. Rimuovere eparina da LiCl precipitazioni: aggiungere LiCl ad una concentrazione finale di 2 M e incubare i campioni per tutta la notte a -20 ° C.
5. Scongelare i campioni a 4 ° C e centrifugare a 20.000 xg per 20 min a 4 ° C.
6. Scartare con cura il surnatante e lavare il pellet con l'80% di etanolo. Centrifuga di nuovo come descritto nel passaggio 3.5.
7. Eliminare il surnatante, aria secca e risospendere il pellet in 150 ml di acqua RNase-free.
8. Per rimuovere qualsiasi residuo LiCl, precipitare di nuovo con 0,1 volumi di acetato di sodio 3 M pH 5,3 e 3 volumi di etanolo al 100%. Incubare a -20 ° C per almeno 2 ore.
9. Centrifugare alla massima velocità per 20 min a 4 ° C. Lavare accuratamente il pellet trasparente con 80% etanolo e asciugare all'aria.
10. Risospendere ilpellet con acqua RNase-free 25 ml e conservare i campioni a -80 ° C.
11. Seguire la procedura per l'etichettatura RNA e ibridazione descritto in ^18,20.

Risultati

Questo protocollo permette la separazione di una frazione-mitocondri contenente da componenti citosolici. Il modo migliore per testare il suo successo è quello di eseguire l'analisi del nord e l'analisi occidentale (Figura 1) per i campioni delle diverse fasi di isolamento. Tre parametri per la qualità di isolamento sono derivati ​​da queste analisi. In primo luogo, se l'RNA o proteine ​​nei campioni sono intatti - questi saranno rilevati come bande distinte nelle analisi. Eventi d...

Discussione

I progressi tecnologici nella diagnostica per immagini hanno dato strumenti ad alta risoluzione per studiare la localizzazione mRNA. Oggi, si può misurare il movimento di una singola molecola di mRNA a scala msec ^23-26. Tuttavia, gli approcci tradizionali biochimici, come quello sopra descritto, sono anche informativo e sono preferibili in alcuni casi. Isolamento Biochemical permette la purificazione di un grande repertorio di mRNA e proteine, ed è quindi preferibile per studi genoma di ampiezza. In un sing...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle