현지화 번역의 메커니즘을 연구하는 효모 미토콘드리아와의 mRNA 관련의 분리

요약

미토콘드리아 단백질을 코딩하는 대부분의 mRNA는 미토콘드리아 외부 막과 연결되어 있습니다. 우리는 관련의 mRNA와 리보솜과 효모 미토콘드리아의 고립을 목표로 세포 내 분획 절차를 설명합니다. 이 프로토콜은 mRNA의 지방화의 메커니즘과 미토콘드리아 근처 현지화 번역을 표시하기 위해 다양한 조건에서 자란 세포에 적용 할 수 있습니다.

초록

미토콘드리아 단백질의 대부분은 핵으로 인코딩 및 세포 기관으로 수입 할 필요가있다. 단백질이 미토콘드리아 근처에 합성하는 동안 수입이 발생할 수 있습니다. 이 가능성에 대한 지원은 미토콘드리아 단백질을 코딩하는 많은의 mRNA가 미토콘드리아 부근에 지역화하는 것으로 된 최근 연구에서 파생됩니다. 함께 외부 막과 리보솜 협회 이전 시위, 이러한 결과는 현​​지화 번역 과정을 제안한다. 현지화 번역, 수입 효율을 향상 독특한 규제 사이트를 제공하고 자궁외 표현의 경우를 최소화 할 수 있습니다. 다양한 방법이 지역화 된 번역을 중재 요인과 요소를 특성화하기 위해 사용되어왔다. 이 가운데 표준 차동 원심 분리하여 세포 내 분획이다. 이 프로토콜은 하나의 절차에서 mRNA가 리보솜 단백질의 분리의 장점이 있습니다. 이들은 다음 다양한 분자량 및 BI에 의해 특성화 될 수있다ochemical 방법. 또한, transcriptomics 및 프로테오믹스 방법하여 게놈 넓은 통찰력에게 수, 생성 된 물질에 적용 할 수 있습니다. 이러한 연구의 모델 생물로 효모의 활용 속도, 비용과 단순성의 이점이있다. 또한, 진보 된 유전 도구와 사용 가능한 삭제 균주 후보 요인의 검증을 용이하게한다.

서문

진핵 세포는 특정 기능을 가지는 별개의 구획으로 구성되어 있습니다. 그 기능을 수행하기 위해, 각 구획의 활동에 필수적인 단백질의 고유 한 집합이 포함되어 있습니다. 이 단백질은 자신의 구획에 접근 통해 가능한 메커니즘은 로컬 라이즈 ^{1,2입니다.} 이 과정에서, 단백질은 리보솜 군데 위치에서 mRNA를 대상으로 합성된다. 현지화 번역의 가능성 장점이 단백질의 타겟팅의 효율성을 증가하는 가운데, 단백질 보호자에 필요한 감소하고, 사이트 별 규제 메커니즘을 가능하게한다. 또한, 지역화의 mRNA와 리보솜은 일반 번역이 억제되어 세포 스트레스의 경우 번역 기계의 외딴 저장 될 수 있습니다.

미토콘드리아는 최근 몇 년 동안 현지화 번역을 연구 중심 모델이되었다. 대부분의 미토콘드리아 단백질은 세포질로 번역 핵, 인코딩 된와 세포 기관으로 수입. 증거의 다양한 라인이 단백질의 많은 지역의 번역 과정을 통해 생산되는 것을 나타냅니다. 처음에는 전자 현미경 및 생화학 적 분류 연구는 미토콘드리아 ^3-5과 관련된 변이를 발견했습니다. 다음 만 cotranslational 방식으로 ^6,7 가져온 것으로 나타났다 특정의 mRNA에 일에 의해 생체 내에서 뒷받침 이러한 연구. 미토콘드리아와의 mRNA 협회의 게놈 넓은 연구의 mRNA의 상당 부분이 미토콘드리아 부근 ^8-10로 지역화 된 것으로 나타났다. 이들의 mRNA 중 일부는 또한 생선이나 MTAG ^{9, 11} 등의 생체 내 형광 방법을 특징으로했다. 이 협회의 직선적 해석은 이들의 mRNA가 현지화 번역에 대한 템플릿 역할을한다는 것입니다.

이들의 mRNA가 미토콘드리아에 접근하는 메커니즘은 알려져 있지 않다. 비 암호화 도메인 (대부분의 significantlY 3 '의 UTRs)은 미토콘드리아 ¹² mRNA의 연관에 관여하는 것으로 나타났다. 이 도메인은 자신의 전송을 중재 RNA 결합 단백질에 결합 부위의 역할을 할 가능성이있다. 효모의 연구는 단백질의 PUM 가족 (Puf3)의 회원이 미토콘드리아 ^8,13와 mRNA의 연결을 지원하는 것으로 나타났다. 다른 가족 구성원의 기능을 기반으로 Puf3에 대한 그럴듯한 역할은 mRNA의 라우팅 ¹⁴ 엉 동안 번역을 억제하는 것입니다. 따라서,의 mRNA는 비 암호화 영역과 상호 작용하는 RNA 결합 단백질에 의해, 비 번역 상태로 운송 할 수있다. 또한, 작품의 큰 몸은 단백질이 합성되는 동안 전송이 발생하는 것이 좋습니다. 특히, 번역 억제제의 mRNA에게 연결 ^{8,13에 영향을} 표시했다. 또한, 같은 8월로 번역 기능은, 미토콘드리아 타겟팅 순서 (MTS) 또는 ORF 영역은 현지화 ^8,11,15에 도움을 나타내었다. HSP70 세대 단백질 채널미토콘드리아 외부 막에 aperone 단백질 수용체는 또한 추가로 인코딩 된 단백질의 기능은 mRNA의 현지화 ¹⁶ 중요하다는 것을 의미한다, mRNA의 연결을 지원하기 위해 표시했다. 이는 리보솜 대두 단백질이 미토콘드리아에 ^17의 mRNA-리보솜 단백질 복합체를 표적 인식을위한 요소로서 기능하는 모델과 일치한다.

미토콘드리아 부근의 현지화 된 번역은 전자 현미경 (리보솜을 시각화하기 위해) ³ FISH ^9, (특정의 mRNA를 검출하는) 녹색 RNA ^11, 생화학 적 분류 (RNA와 리보솜을 모두 감지하는) ^10,18 등 다양한 방법으로 연구 하였다. 전자의 방법은 생체 내에서 현지화를 감지하고 전송 역학의 시각화를 허용 할 수 있지만, 후자는 하나의 실험에서 여러 가지의 mRNA를 검출 할 수 있습니다. 또한, 생화학 분류 코딩 또는 비 암호화 도메인에 대해 알 수 필요가 없습니다까지 입력 그러므로 특정 역할이 평가 될 수있다. 생화학 분별 성공적 많은 다른 세포 구획 분리를 위해 수년 동안 사용되어왔다. 그 원칙과 한계는 잘 설립하고, 하나는 쉽게 다른 목적을 위해 기존의 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 필요한 장비, 따라서 그것은 일반적으로 세포 내 현지화를 공부에 대한 선택의 첫 번째 방법이다, 많은 실험실에서 표준입니다. 우리는 리보솜이 미토콘드리아와 관련된 동안의 mRNA의 분리에 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜은 따라서 미토콘드리아 부근의 현지화 번역에 관련된 요인을 공부에 최적입니다.

프로토콜

1. 미토콘드리아 정화

세포의 펠렛을 단다. 약 0.6 g을 100 ㎖의 세포에서 얻을 수있다.

1. 30에서 ₆₀₀ = 1.5 과다 복용 효모 세포의 100 ~ 150 ㎖의 성장 미토콘드리아에 대한 풍부하기 위해, 이러한 갈락토스 기반 성장 매체로서 nonfermentable 성장 배지에 C를 °.
2. 원심 분리기 세포 실온에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
3. 다시 증류수와 원심 분리기와 펠렛을 씻으십시오. 상층 액을 버린다.
4. 세포의 0.5 g 당 1 ㎖ DTT 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 그것에 의해 가수 분해를 향상 세포벽 내 이황화 결합을 파괴하기 위해 환원제로 세포를 치료하는 데 중요하다.
5. 30에서 10 분 동안 세포를 배양한다 부드러운 흔들림와 C를 °. 한편, 세포 1g 당 6 밀리그램 zymolyase의 무게를 Zymolyase 버퍼에 일시 중지합니다.
6. 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포T 실내 온도와 상층 액을 버린다.
7. 세포의 0.15 g 당 1 ㎖ Zymolyase 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 없는 소용돌이를 수행합니다.
8. 물 990 μL에있는 세포의 10 μL 나누어지는의 OD _600을 측정합니다.
9. β-1, 3 - 글루칸 결합에 포도당 중합체를 가수 분해 spheroplasts를 생성하는 세포에 Zymolyase (단계 1.5)를 추가합니다. 이 단계에서, spheroplasts 용균을 피하기 위하여 등장액에 보관한다.
10. 부드러운 흔들림으로 30 ° C (zymolyase 최적의 활동에 대한)에서 15 분 동안 세포를 품어. 세포벽과 spheroplasts 세대의 가수 분해를 확인하기 위해, 물 990 μL와 세포의 10 μl를 섞는다. Spheroplasts 인해 삼투압 차이에 용해 할 것으로 예상되고, OD _(600)은 적어도 1.9 단계에서 결정된 값 미만을 10 배량한다. 그렇지 않을 경우, 또 다른 15 분 동안 zymolyase과 배양을 계속합니다.
11. 상온에서 5 분 3,000 XG에 원심 분리기 세포. 조심스럽게 병에 감염카드 상층 액, 펠릿으로 불안정 할 수 있습니다.
12. Zymolyase 버퍼 spheroplasts을 세척하고 상층 액을 버린다.
13. 100 ㎖의 복구 매체와 spheroplasts을 재현 탁. 삼각 플라스크에 spheroplasts를 전송하고 30에서 1 시간 동안 배양 동요와 C를 °. Zymolyase 처리 번역 중에 체포되고, mRNA의 현지화 (그림 1B) 중단되기 때문에이 복구 단계가 필요합니다.
14. 예비 냉각 50 ML 원뿔 튜브에 0.1 ㎎ / ㎖의 CHX 및 전송 spheroplasts를 추가합니다. CHX의 추가의 mRNA와 리보솜 협회를 동결하는 것이 중요합니다. 따라서, 미토콘드리아와 리보솜에 의존하는 mRNA의 관계가 유지됩니다.
15. 원심 분리기 spheroplasts 4 ° C에서 5 분 3,000 XG에 상층 액을 버린다.
16. 차가운 만니톨 버퍼로 두 번 씻으십시오.
17. 4 ML 차가운 만니톨 버퍼 spheroplasts을 재현 탁하고 꽉 끼는을 갖춘 15 ㎖의 용량의 다운스 균질로 전송유. 조심스럽게 15 선을 spheroplasts을 중단하고 13 ML 튜브에 해물을 전송합니다.
18. 핵 및 손상되지 않은 세포를 펠렛 4 ° C에서 10 분 동안 1,500 XG에서 해물을 원심 분리기.
19. 조심스럽게 새로운 튜브에 뜨는을 전송합니다. 미분 획 샘플 ( "전체"샘플)로 옆으로 시료 1 ㎖ (25 %)을 설정합니다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. "총"샘플의 나머지 침전물 RNA는 (프로토콜 3, RNA 침전 참조).
20. 4시 10 분 10,000 XG에 뜨는을 원심 분리기 미토콘드리아 펠렛 C를 °.
21. 새로운 튜브에 뜨는 (~ 3 ㎖)를 전송하고 얼음에 보관. 이것은 "세포질"조각이다. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다. "세포질"샘플의 나머지 침전물 RNA는 (보호 해주는에게보기ocol 3, RNA 침전).
22. 4 ℃에서 10 분 동안 10,000 XG에 다시 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 원심 분리기와 펠렛을 씻으
23. 3 ㎖ 만니톨 버퍼와 펠렛을 Resuspend. 이 샘플은 미토콘드리아를 포함하고 "미토콘드리아"분수로 함. 새로운 튜브로 전송이 샘플 50 ㎖ 및 웨스턴 블롯 분석을위한 4 배 LSB 15 ㎖를 추가합니다.

2. RNA 추출

1. 각 샘플에 8 M 구 아니 디늄-HCl을 하나의 볼륨 및 100 % 에탄올 두 개의 볼륨에 추가합니다. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C.
2. 4 20 분 10,000 XG에 원심 분리기 샘플 ° C. 상층 액을 버린다. 펠릿이 불안정 할 수 있습니다로주의해야합니다.
3. 70 % EtOH로 펠렛을 씻으십시오.
4. RNase가없는 물 400 ㎖로 펠렛을 재현 탁하고 새로운 에펜 도르프 튜브에 샘플을 전송합니다.
5. 3 M 나트륨 acetat 0.1 볼륨을 추가하여 다시 RNA를 침전전자의 pH 5.2와 100 %의 EtOH 두 권. 소용돌이 -20 적어도 2 시간 동안 배양 ° C.
6. 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기 샘플 뜨는을 취소하고 70 % EtOH로 세척한다.
7. 공기는 펠렛을 건조 및 RNase가없는 물에 재현 탁. -80에서 보관 RNA 샘플 ° C. 샘플 북부 분석 ¹⁹ 또는 마이크로 어레이 분석 ¹⁸ (프로토콜 3 참조)를 사용할 수 있습니다.

3. 마이크로 어레이 분석을위한 RNA 준비

1. RNase가없는 물 650 mL를 2.2 단계에서의 mRNA를 재현 탁.
2. 적극적으로 클로로포름 (5:1의 pH 4.7)와 소용돌이 : 잔여 DNA 또는 단백질을 제거하려면, 같은 산성 페놀의 양 (650 ㎖)에 추가합니다. 2 분 동안 최대 속도로 원심 분리기.
3. 새로운 튜브로 위 상 (수상) 500 ㎖를 전송합니다. 그것은 DNA가 들어 있으므로, 계면을 복용하지 마십시오. 또한, 역전사 반응을 억제 할 수있는 페놀을 복용에주의.
4. RNA 샘플은 역전사 효소의 강력한 억제제이다 헤파린의 상당한 양이 포함되어 있습니다. 따라서, RT-PCR 또는 마이크로 어레이 라벨링을 위해 제거 될 필요가있다. LiCl을 침전에 의해 헤파린을 제거 2 M의 최종 농도로하여 LiCl을 추가하고 -20에서 밤새 샘플을 품어 ° C.
5. 4에서 샘플을 해동 ° C와 11 ° C에서 20 분 동안 20,000 XG에 원심 분리기
6. 조심스럽게 뜨는을 취소하고 80 % 에탄올로 펠렛을 씻으십시오. 단계 3.5에 설명 된대로 다시 원심 분리기.
7. 상층 액, 공기 건조를 취소하고 RNase가없는 물 150 ㎖에 펠렛을 재현 탁.
8. 잔류하여 LiCl을 제거하려면, 3 M 아세트산 나트륨의 pH 5.3의 0.1 볼륨 및 100 % 에탄올의 전 3 권으로 다시 침전. -20 품다 최소 2 시간 동안 C를 °.
9. 4에서 20 분 동안 최고 속도로 원심 분리기 ° C. 80 %의 에탄올과 건조한 공기로 조심스럽게 투명 펠렛을 씻으십시오.
10. 재현 탁25 ㎖의 RNase가없는 물과 펠렛 -80에서 샘플을 유지 ° C.
11. ^{(18, 20)에} 설명 된 RNA의 라벨 및 하이브리드의 단계를 따릅니다.

결과

이 프로토콜은 세포질 구성 요소에서 미토콘드리아 함유 부분을 분리 할 수​​ 있습니다. 성공을 테스트하는 가장 좋은 방법은 다른 분리 단계에서 샘플을 분석 북부와 서부 분석 (그림 1) 수행하는 것입니다. 격리 품질에 대한 세 가지 매개 변수는이 분석에서 파생됩니다. 첫째, 샘플에서 RNA 나 단백질은 손상 여부 - 이러한 분석에서 뚜렷한 밴드로 감지됩니다. 분해 이벤트를 추가, ...

토론

이미징 기술의 발전은 mRNA의 현지화를 연구하는 높은 해상도 도구를 산출했다. 오늘날, 하나는 msec의 시간 스케일 ^{23-26이라도} 단일의 mRNA 분자의 움직임을 측정 할 수있다. 그러나, 전통적인 생화학 적 접근법은, 상술 한대로, 또한 유익한 일부 경우에 바람직하다. 생화학 격리의 mRNA 및 단백질의 큰 레퍼토리의 정화를 허용하고, 게놈 넓은 연구에 대한 것이 바람직하다. 하나의 분리, 하나?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle