בידוד של mRNAs הקשורים למיטוכונדריה שמרים לחקר מנגנונים מקומי תרגום

Summary

mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה משויך הקרום החיצוני מיטוכונדריה. אנו מתארים הליך חלוקה subcellular שמטרתה בידוד של שמרי המיטוכונדריה עם mRNAs הקשורים אליו והריבוזומים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על תאים שגודל בתנאים מגוונים במטרה לחשוף את המנגנונים של לוקליזציה mRNA ותרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

Abstract

רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין וצריך להיות מיובא לתוך אברון. יבוא עלול להתרחש בזמן שהחלבון מסונתז ליד המיטוכונדריה. תמיכה באפשרות זו נגזר ממחקרים שנעשה לאחרונה, שבו mRNAs רבים קידוד חלבוני המיטוכונדריה הוצגו להיות מקומי כדי קרבת מיטוכונדריה. יחד עם הפגנות קודמות של העמותה 'הריבוזומים עם הקרום החיצוני, תוצאות אלו מצביעות על תהליך תרגום מקומי. תרגום מקומי כזו עשויה לשפר את יעילות יבוא, לספק אתרי רגולציה ייחודיים ולמזער מקרים של ביטוי מחוץ לרחם. מגוון שיטות שימשו כדי לאפיין את הגורמים ומרכיבים אשר מתווכים תרגום מקומי. תקן בין אלה הוא חלוקה subcellular על ידי צנטריפוגה ההפרש. פרוטוקול זה יש את היתרון של בידוד של mRNAs, ריבוזומים וחלבונים בהליך אחד. אלה אז יכולים להיות מאופיינים על ידי מולקולריים ודו שוניםשיטות ochemical. יתר על כן, ניתן ליישם שיטות transcriptomics ופרוטאומיקה לחומר וכתוצאה מכך, ובכך לאפשר לתובנה הגנום כולו. הניצול של שמרי כאורגניזם מודל למחקרים מסוג זה יש את היתרונות של מהירות, עלויות ופשטות. יתר על כן, הכלים הגנטיים המתקדמים וזני מחיקה זמינים להקל על אימות של גורמי מועמד.

Introduction

תאי אוקריוטים מאורגנים בתאים נפרדים, בעלי פונקציות ספציפיות. כדי להשיג את תפקידה, כל תא מכיל מערך ייחודי של חלבונים שחיוניים לפעילותו. מנגנון אפשרי שבאמצעותו חלבונים אלה מתקרבים התא שלהם הוא על ידי ^1,2 תרגום לשפה מקומי. בתהליך זה, החלבון מסונתז ביעד שלה על ידי הריבוזומים וmRNAs שנמצאים שם. בין היתרונות האפשריים של תרגום מקומי גדלו יעילות של מיקוד חלבון, ירידה בצורך במלווי חלבון, ומאפשר למנגנוני רגולציה ספציפי לאתר. כמו כן, mRNAs והריבוזומים מקומיים יכולים להיות מאגר מבודד של מכונות תרגום במקרים של מתח הסלולר, כאשר תרגום כללי הוא עצור.

מיטוכונדריה הפכה בשנים האחרונות מודל מרכזי ללמוד תרגום מקומי. רוב חלבוני המיטוכונדריה מקודדים בגרעין, המתורגם בcytosol,ומיובא לאברון. קווים שונים של ראיות מצביעים על כך שרבים מחלבונים אלו מיוצרים בתהליך תרגום מקומי. בתחילה, לימודים במיקרוסקופ אלקטרונים וחלוקה ביוכימיים זוהו הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה ^3-5. מחקרים אלה שבו ולאחר מכן אומתו in vivo על ידי עבודה על mRNAs הספציפי, שנמצאו להיות מיובאים רק ^ב6,7 אופן cotranslational. מחקרי הגנום של mRNAs שיתוף עם המיטוכונדריה חשפו כי חלק משמעותי של mRNAs הם מקומיים לסביבת מיטוכונדריה ^8-10. חלקם של mRNAs אלה התאפיינו נוספים על ידי in vivo הקרינה שיטות, כגון דגים או mTAG ^9,11. פרשנות ישר קדימה של עמותה זו היא שmRNAs אלה משמש כתבניות לתרגום לשפה מקומית.

המנגנונים שבאמצעותם mRNAs אלה מתקרבים למיטוכונדריה אינם ידועים. תחומים noncoding (רוב significantl3 UTRs 'y) הוצג להיות מעורב בmRNA העמותה למיטוכונדריה ^12. תחומים אלה עשויים לשמש כאתר קישור לחלבוני קושרי RNA אשר מתווכים התחבורה שלהם. מחקרים בשמרים גילו כי חבר של משפחת PUM של חלבונים (Puf3) תומך בעמותת mRNA עם מיטוכונדריה ^8,13. תפקיד מתקבל על הדעת לPuf3, המבוסס על פונקציות של בני משפחה אחרים, הוא לעכב תרגום ואילו את ה-mRNA הוא הדרך ^14. לפיכך, mRNAs עשוי להיות מועבר במעמד nontranslated, על ידי חלבוני RNA מחייבים כי אינטראקציה עם אזורי noncoding. לחלופין, גוף עבודות גדול מצביע על כך שהתחבורה מתרחשת בזמן שהחלבון הוא להיות מסונתזת. בפרט, מעכבי תרגום הוצגו להשפיע mRNAs עמותה ^8,13. יתר על כן, תכונות תורגמו כגון אוגוסט, רצף של המיטוכונדריה מיקוד (MTS) או אזורי ORF הוצגו כדי לסייע בלוקליזציה ^8,11,15. ch חלבון HSP70 משפחתיaperone וקולטן חלבונים על הקרום החיצוני מיטוכונדריה הוצגו גם כדי לתמוך בעמותת ה-mRNA, רומזים עוד כי תכונות מקודדות חלבונים חשובות ללוקליזציה mRNA ^16. זה עולה בקנה אחד עם מודל שבו החלבון המתעוררים-הריבוזום משמש כאלמנט הכרה למיקוד מורכב mRNA-הריבוזום חלבונים למיטוכונדריה ^17.

תרגום מקומי ליד המיטוכונדריה נחקר על ידי שיטות שונות, ובכלל זה במיקרוסקופ אלקטרונים (כדי להמחיש הריבוזומים) ^3, דגים ^9, RNA הירוק (כדי לזהות mRNAs הספציפי) ^11, וחלוקה ביוכימי (כדי לזהות שני RNA וריבוזומים) ^10,18. בעוד השיטות לשעבר לזהות לוקליזציה in vivo ועשויות לאפשר הדמיה של דינמיקת תחבורה, האחרון מאפשר זיהוי של mRNAs שונים בניסוי יחיד. יתר על כן, לתחומים קידוד חלוקה ביוכימי או noncoding לא צריך להיות אלחזרתי אחורנית, ולכן ניתן להעריך התפקידים הספציפיים שלהם. חלוקה ביוכימיים שמשה בהצלחה במשך שנים רבות, לבידוד תרמי של תאים סלולריים שונים. מנהלים ומגבלותיו מבוססים היטב, ואפשר בקלות לשנות את הפרוטוקולים קיימים למטרות שונות. המכשור הדרוש הוא סטנדרטי במעבדות רבות, ולכן הוא בדרך כלל השיטה הראשונה לבחירה ללימוד לוקליזציה תאית. אנו מתארים פרוטוקול שהיה מותאם לבידוד של mRNAs בעוד הריבוזומים הקשורים למיטוכונדריה. פרוטוקול זה הוא אפוא אופטימלי לחקר גורמים המעורבים בתרגום מקומי ליד המיטוכונדריה.

Protocol

1. מיטוכונדריה טיהור

לשקול את גלולה של תאים. בערך 0.6 גרם מתקבלים מ100 תאים למ"ל.

1. לגדול 100-150 מיליליטר של תאי שמרים לOD ₆₀₀ = 1-1.5 ב30 ° C במדיום גידול nonfermentable, כגון מצע גידול מבוסס גלקטוז, על מנת להעשיר למיטוכונדריה.
2. תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר וזורקים supernatant.
3. שטוף את הכדור עם מים מזוקקים כפולים ו צנטריפוגות שוב. בטל supernatant.
4. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר DTT הצפת ל0.5 גרם של תאים. חשוב לטיפול בתאים עם סוכן צמצום כדי לשבור את קשרי דיסולפיד בתוך דופן התא, ובכך לשפר את הידרוליזה.
5. דגירה התאים עבור 10 דקות ב30 ° C עם רעד עדין. בינתיים, שוקל zymolyase 6 מ"ג לכל 1 גרם של תאים ולהשעות אותו בZymolyase הצפת.
6. תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקותטמפרטורת חדר לא וזורקים supernatant.
7. Resuspend גלולה ב 1 מיליליטר Zymolyase הצפת ל0.15 גרם של תאים. לא מערבולת.
8. מדוד OD ₆₀₀ של 10 aliquot μl של התאים ב990 μl מים.
9. הוספת Zymolyase (שלב 1.5) לתאים לhydrolyze פולימרים של גלוקוז בβ-1 ,3-גלוקן הקשרים וליצור spheroplasts. מהשלב הזה, צריך להיות כל הזמן spheroplasts בתמיסה איזוטונית כדי להימנע תמוגה.
10. דגירה תאים עבור 15 דקות ב 30 מעלות צלזיוס (לפעילות אופטימלית של zymolyase) עם רעד עדין. כדי לוודא הידרוליזה של דופן התא ודור spheroplasts, לערבב 10 μl של התאים עם 990 μl מים. Spheroplasts צפוי lyse בשל הבדל האוסמוטי, _ו600 OD צריכים להיות לפחות פי 10 פחות מהשווי שנקבע בשלב 1.9. אם לא, תמשיך דגירה עם zymolyase לעוד דקות 15.
11. תאי צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. זהירות דיסכרטיס supernatant, כגלולה עשוי להיות לא יציב.
12. שטוף spheroplasts עם Zymolyase הצפת וזורקים supernatant.
13. Resuspend spheroplasts עם 100 בינוני שחזור מיליליטר. העבר spheroplasts לבקבוק Erlenmeyer דגירה במשך שעה 1 ב30 ° C עם רעד. צעד התאוששות זו הוא הכרחי שכן בתרגום טיפול Zymolyase נעצר ולוקליזציה mRNA מופרת (איור 1).
14. הוסף 0.1 מ"ג / מיליליטר CHX וspheroplasts העברת צינור חרוטי 50 מיליליטר precooled. בנוסף CHX חשוב להקפיא את העמותה 'הריבוזומים עם mRNAs. לפיכך, הריבוזומים תלויים עמותת mRNA עם מיטוכונדריה נשמר.
15. spheroplasts צנטריפוגה ב 3,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C וזורקים supernatant.
16. שטוף פעמיים עם קרה מניטול הצפת.
17. Resuspend spheroplasts עם 4 מיליליטר קר מניטול הצפת ולהעביר אותם לhomogenizer Dounce של 15 מיליליטר קיבולת מצויד בהולם בחוזקההעלי. בעדינות לשבור spheroplasts עם 15 משיכות ולהעביר lysate לצינור 13 מיליליטר.
18. צנטריפוגה lysate ב1,500 XG במשך 6 דקות ב 4 ° C עד גלולה גרעינים ותאים רצופים.
19. להעביר בזהירות את supernatant לצינור חדש. להפריש 1 מיליליטר (25%) של המדגם כמדגם unfractionated (מדגם "סך הכל"). העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4X LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם "סך הכל" (ראה פרוטוקול 3, ממטרים RNA).
20. צנטריפוגה supernatant ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה מיטוכונדריה.
21. מעביר את supernatant (~ 3 מיליליטר) לצינור חדש ולשמור אותו על קרח. זה שבריר "Cytosolic". העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי. משקע RNA משאר המדגם "Cytosolic" (ראה Protocol 3, ממטרים RNA).
22. שטוף את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת ו צנטריפוגות שוב ב 10,000 XG 10 דקות ב 4 ° C.
23. Resuspend את הכדור עם 3 מיליליטר מניטול הצפת. מדגם זה מכיל את המיטוכונדריה, ומכונה שבר "מיטוכונדריה". העברת 50 מיליליטר של מדגם זה לצינור חדש ולהוסיף 15 מיליליטר של 4x LSB לניתוח כתם מערבי.

2. RNA חילוץ

1. הוסף לכל נפח דגימה אחת של ז 8 guanidinium-HCl ושני כרכים של 100% אתנול. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C.
2. צנטריפוגה דגימות 10,000 XG במשך 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant. להיזהר כמו גלולה עשויה להיות לא יציבה.
3. שטוף את הכדור עם EtOH 70%.
4. Resuspend את הכדור עם 400 מיליליטר מים RNase ללא ולהעביר את הדגימה לצינור Eppendorf חדש.
5. לזרז את הרנ"א שוב על ידי הוספת 0.1 נפח של 3 acetat M נתרןדואר pH 5.2 ושני כרכים של 100% EtOH. וורטקס ו דגירה של לפחות 2 שעות ב-20 ° C.
6. צנטריפוגה דגימות 20,000 XG עבור 20 דקות ב 4 ° C. בטל supernatant ולשטוף עם EtOH 70%.
7. אוויר יבש גלולה ו resuspend במי RNase חינם. דגימות RNA החנות ב -80 ° C. דוגמאות יכולות לשמש לניתוח צפוני ¹⁹ או ניתוח microarray ¹⁸ (ראה פרוטוקול 3).

3. הכנת RNA לMicroarray ניתוח

1. Resuspend mRNA משלב 2.2 עם 650 מיליליטר מים RNase חינם.
2. כדי להסיר כל דנ"א או חלבוני שייר, להוסיף נפח שווה (650 מיליליטר) של פנול חומצי: כלורופורם (5:1, pH 4.7) ומערבולת במרץ. צנטריפוגה במהירות המרבית למשך 2 דקות.
3. העבר 500 מיליליטר של השלב העליון (השלב ​​המימית) לצינור חדש. הימנע מלקחת את שלבי ביניים, מכיוון שהיא מכילה DNA. גם להיות זהיר של לקיחת פנול, אשר יכול לעכב את תגובת השעתוק לאחור.
4. מדגם RNA מכיל כמות משמעותית של הפרין, שהוא מעכב חזק של reverse transcriptase. כך, RT-PCR או תיוג microarray זה צריך להסירו. הסר הפרין על ידי המשקעים LiCl: להוסיף LiCl לריכוז סופי של 2 מ 'ודגירת דגימות במשך הלילה ב -20 ° C.
5. להפשיר את הדגימות בשעה 4 מעלות צלזיוס ו צנטריפוגות ב XG 20,000 עבור 20 דקות ב 4 ° C.
6. להשליך בזהירות את supernatant לשטוף את הכדור עם 80% אתנול. שוב צנטריפוגות כמתואר בשלב 3.5.
7. בטל supernatant, האוויר היבש וresuspend את הכדור ב150 מיליליטר מים RNase חינם.
8. כדי להסיר כל LiCl שייר, לזרז שוב עם 0.1 נפח של 3 pH אצטט M נתרן 5.3 ו3 כרכים של 100% אתנול. לדגור על -20 ° C לפחות 2 שעות.
9. צנטריפוגה במהירות שיא ל20 דקות ב 4 ° C. שטוף בזהירות את הכדור השקוף עם 80% אתנול ואוויר יבש.
10. Resuspendגלולה עם מים RNase ללא 25 מ"ל ולשמור את הדגימות ב -80 ° C.
11. בצע את השלבים לתיוג RNA והכלאה מתואר ^ב18,20.

תוצאות

פרוטוקול זה מאפשר הפרדה של חלק המכיל את המיטוכונדריה מרכיבי cytosolic. הדרך הטובה ביותר לבחון את הצלחתה היא לבצע ניתוח צפוני וניתוח מערבי (איור 1) לדגימות מצעדי הבידוד השונים. שלושה פרמטרים לאיכות הבידוד נגזרים מניתוחים אלו. ראשית, אם RNA או חלבונים בדגימות הם שלמי...

Discussion

התקדמות טכנולוגית בתחום ההדמיה הניבה כלים ברזולוציה גבוהה ללמוד לוקליזציה mRNA. כיום, ניתן למדוד את התנועה של אפילו מולקולת mRNA אחד בזמן בקנה מידה msec ^23-26. עם זאת, גישות ביוכימיות מסורתיות, כפי שתואר לעיל, גם אינפורמטיבי ועדיפים במקרים מסוימים. בידוד ביוכימיים מאפש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Yeast Extract
BactoPeptone
Galactose			Do not autoclave Galactose
Growth medium			For mitochondrial enrichment, you should use any nonfermentable carbon source, such as Galactose-based growth medium sterilized 1% Yeast Extract, 2% BactoPeptone, 2% Galactose
0.1 M Tris-HCl, pH 9.4
30 mM Tris-HCl, pH 7.6
Dithiothreitol (DTT)
10 mM DTT Buffer			0.1 M TrisHCl pH 9.4, 10 mM Dithiothreitol (DTT). Make fresh every time
1.2 M Sorbitol
4 mM KH2PO4
16 mM K2HPO4
0.2 μm filter
Zymolyase Buffer			1.2 M Sorbitol, 4 mM KH2PO4 , 16 mM K2HPO4. Filter this buffer (0.2 μm) and keep at room temperature for future use
Zymolyase 20T			20,000 U/g
Recovery medium			Galactose-based growth medium supplemented with 1 M Sorbitol
0.1 mg/ml Cycloheximide (CHX)
0.6 M Mannitol
5 mM MgAc
100 mM KCl
0.5 mg/ml Heparin
1 mM Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF)
Mannitol Buffer			0.6 M Mannitol, 30 mM Tris-HCl pH7.6, 5 mM MgAc, 100 mM KCl. Add freshly: 0.5 mg/ml Heparin, 0.1 mg/ml CHX and 1mM (PMSF). Filter this buffer and use it ice-cold
8 M Guanidinium-HCl
100% and 70% Ethanol (EtOH)
3 M Sodium Acetate, pH 5.2
10 M LiCl stock solution
250 mM Tris HCl pH 6.8
SDS
Glycerol
β-Mercaptoethanol
Bromophenol blue
4x LSB			250 mM Tris HCl pH 6.8, 8% SDS, 40% Glycerol, 20% β-mercaptoethanol, and 0.02% Bromophenol blue
Dounce homogenizer of 15 ml capacity equipped with tight fitting pestle