JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

ووصف طريقة لتحليل تدهور البروتين باستخدام رديولبلد والبروتينات luciferase المراسل الانصهار في القيطم استخراج البيض والتكيف من أجل الفرز الفائق الإنتاجية للجهري جزيء صغير من تدهور البروتين.

Abstract

القيطم المورق استخراج البيض هو، نظام قوي يتميز جيدا لدراسة الكيمياء الحيوية من العمليات الخلوية المختلفة. وقد استخدمت القيطم استخراج البيض لدراسة دوران البروتين في العديد من السياقات الخلوية، بما في ذلك دورة الخلية ومسارات نقل الإشارة 1-3. هنا، يتم وصف طريقة لعزل القيطم استخراج البيض الذي تم الأمثل لتعزيز تدهور المكون مسار WNT الحرجة، β-catenin. يتم وصف طريقتين مختلفتين لتقدير β-catenin تدهور البروتين في البيض القيطم استخراج. أسلوب واحد هو بالمعلومات بصريا ([35 S]-رديولبلد البروتينات)، في حين أن الآخر يتم تحجيم بسهولة أكبر لفحوصات عالية الإنتاجية (يراعة luciferase المراسل الموسومة البروتينات الانصهار). الأساليب المذكورة يمكن استخدامها ل، ولكن ليس على سبيل الحصر، تقييم β-catenin البروتين دوران وتحديد المكونات الجزيئية التي تسهم في حجم اعمالها. بالإضافة إلى ذلك، أبيإيتي لتنقية كميات كبيرة من متجانسة القيطم استخراج البيض جنبا إلى جنب مع قراءات الكمية والسهل من البروتينات الموسومة luciferase المراسل يسمح هذا النظام ليتم تكييفها بسهولة للكشف عن الإنتاجية العالية للجهري من تدهور β-catenin.

Introduction

وقد استخدم القيطم المورق استخراج البيض على نطاق واسع لدراسة العديد من العمليات البيولوجية الخلية بما في ذلك ديناميات هيكل الخلية، والتجمع النووية والاستيراد، وموت الخلايا المبرمج، والتمثيل الغذائي اليوبيكويتين، تقدم دورة الخلية، نقل الإشارة، والبروتين دوران 1-17. والقيطم البيض استخراج النظام قابلة للتحليل كيميائي حيوي من حشد غفير من العمليات الخلوية لاستخراج البيض يمثل أساسا السيتوبلازم غير مخفف يحتوي على كافة مكونات حشوية الأساسية اللازمة لتنفيذ هذه العمليات وتمكين التحقيق. كميات كبيرة من استخراج البيض يمكن أن تكون على استعداد في وقت واحد للتلاعب البيوكيميائية التي تتطلب كميات كبيرة من المواد (على سبيل المثال، وتنقية البروتين أو الفرز الفائق الإنتاجية) 18-20. ميزة أخرى هي أن تركيز بروتينات معينة في القيطم استخراج البيض يمكن تعديلها على وجه التحديد عن طريق إضافة المؤتلف البروتين و / أو immunodepletion من endogالبروتينات enous على النقيض من ترنسفكأيشن من الحمض النووي البلازميد حيث التعبير عن بروتين من الفائدة من الصعب السيطرة عليها. بالإضافة إلى ذلك، عدم وجود البروتينات المؤتلف متوفرة ويمكن التغلب عليها عن طريق إضافة نصوص ترميز البروتين من الفائدة، والاستفادة من قدرة الطازجة القيطم استخراج البيض العالية لترجمة مرنا وأضاف خارجيا.

تنظيم تدهور البروتين أمر بالغ الأهمية من أجل السيطرة على العديد من مسارات الخلوية والعمليات 21. وقد استخدم على نطاق واسع القيطم استخراج البيض لدراسة تدهور البروتين كما يسمح النظام عن طرق متعددة لرصد دوران البروتين دون التأثيرات الخلط بين النسخ والترجمة. إشارات مسار WNT هو مسار الإشارات حفظا للغاية أن يلعب أدوارا حاسمة في تطوير والمرض. دوران β-catenin، والمستجيب الرئيسية للمسار WNT، ودرجة عالية من التنظيم، وزادت حالة استقرار لترايفل من β-catenin هو أمر حاسم لتفعيل الجينات المستهدفة WNT. وسلط الضوء على أهمية تدهور β-catenin من حقيقة أن الطفرات في مسار WNT التي تمنع تدهور β-catenin جدت في ~ 90٪ من جميع حالات متفرقة من سرطان القولون والمستقيم 22. تدهور β-catenin بواسطة مكونات من مسار WNT يمكن تلخيصها بإخلاص في استخراج البيض القيطم لدراسة آلية من حجم اعمالها، وكذلك لتحديد جهري جزيء صغير الرواية من تدهورها 2، 19، 20، 23-29.

وقد وصفت وسائل لإعداد القيطم استخراج البيض لدراسة دورة الخلية في المنشورات السابقة إن الرب 30-32. يصف البروتوكول الحالي لتعديل هذه الأساليب والأمثل لتدهور [35 S]-β-رديولبلد catenin والموسومة luciferase المراسل β-catenin فيالقيطم استخراج البيض. تدهور فحص رديولبلد يسمح للرؤية مباشرة من مستويات البروتين عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي. أدرج [35 S] ميثيونين في البروتين من الفائدة باستخدام ترجمة رد فعل في المختبر التي يمكن بعد ذلك إضافتها مباشرة إلى رد فعل تدهور. بالإضافة إلى ذلك، لا يتطلب البروتين رديولبلد دوران فحص الأجسام المضادة ضد البروتين من الفائدة أو علامة حاتمة، والتي يمكن أن تؤثر على استقرار البروتين. لأنه حتى التغيرات الصغيرة في مستويات البروتين، كما يتجلى في التغيرات في كثافة البروتين رديولبلد الفرقة، وتصور بسهولة عن طريق تصوير الإشعاع الذاتي، و[35 S]-رديولبلد يمثل تدهور فحص وسيلة مفيدة جدا لرؤية بروتين دوران 2.

انصهار β-catenin ليراعة luciferase (المشار إليها فيما يلي باسم ببساطة "luciferase المراسل") يسمح لقياس الكمي الدقيق والسهل من مستويات البروتين، من أجللتحديد الخصائص الحركية للβ-catenin دوران 19، 20. والميزة الرئيسية للمقايسة luciferase المراسل هو أنه يوفر نظام كمي قوية على أن يتم تحجيم بسهولة. يوفر بروتوكول التالية أساليب بسيطة لمعايرة تدهور β-catenin وطريقة قوية وفعالة، وفعالة لالفرز الفائق الإنتاجية من رواية جهري β-catenin.

Protocol

1. إعداد القيطم استخراج البيض

ملاحظة: كل الضفدع ينتج ما يقرب من 1 مل من استخراج البيضة صالحة للاستعمال. وعادة ما يتم إعداد مقتطفات من 10 الضفادع في وقت واحد، وحجم المخزن المؤقت هو موضح أدناه لإجراء 10 الضفدع القيطم استخراج البيض الإعدادية. حجم المخزن المؤقت يمكن تعديلها وفقا لذلك لتحضير أكبر أو أصغر من استخراج البيض. محضرات ولدت بهذه الطريقة تسفر باستمرار تركيزات البروتين ≥ 50 ملغ / مل. عملية جمع البيض ومعالجتها في استخراج هو الأكثر فعالية عندما أجريت من قبل شخصين. (للحصول على تقنيات تربية الضفادع الأساسية، انظر SIVE وآخرون 33).

  1. جمع البيض
    1. لرئيس الضفادع، وضخ كل الضفادع الإناث مع 100 U من الحوامل ماري المصل موجهة الغدد التناسلية (PMSG) من تقدم طازجة 250 الأسهم U / مل. استخدام 3 مل حقنة السلين مع 27 G إبرة لحقن تحت الجلد، مع شطبة منوحتى إبرة، في كيس الليمفاوية الظهرية، والذي يقع ما يقرب من 1 سم بعيدا عن خط الوسط من تغيير الألوان حقق على طول الساقين الضفدع.
    2. متجر الضفادع معبي في الماء (زائد 20 مم كلوريد الصوديوم، انظر SIVE آخرون 33) عند 18 درجة مئوية لمدة 5-10 أيام. لأنظمة خزان المياه الراكدة، وكثافة الحيوانات ما يقرب من 4 لتر من الماء لكل الضفدع الإناث. ملاحظة: الحد الأدنى للالوقت اللازم لفتيلة نافذة المفعول هو 5 أيام، وآثار فتيلة يزول بعد 10 يوما.
    3. إعداد التعديل قارعو الأجراس (MMR) حل 0.5X مارك لمن MMR الأسهم 20x و. يتكون 20x وMMR من 2 M كلوريد الصوديوم، و 40 ملي كلوريد البوتاسيوم وكلوريد الكالسيوم 40 ملم، 20 ملم كلوريد المغنيسيوم، و 100 ملي 4 - (2-هيدروكسي)-1-piperazineethanesulfonic حمض (HEPES)، ودرجة الحموضة 7.4.
    4. إعداد الدلاء لجميع الضفادع حقن (ضفدع واحد لكل 4 لتر دلو). ملاحظة: على الرغم من ضفدع واحد أو أكثر يمكن وضعها في نفس دلو لجمع البيض، وإذا كان واحد من الضفادعيضع البيض في الغالب ذات جودة رديئة، وسوف تكون هناك حاجة إلى قدر كبير من الجهد لفصل البيض نوعية رديئة من تلك التي هي مناسبة لصنع استخراج. وبالتالي، وتعظيم عدد من الضفادع في الدبابة نفسها لتقليل كمية من العازلة المستخدمة لنجمع البيض هو لا يستحق المخاطرة.
    5. ضخ 750 U الإنسان موجهة الغدد التناسلية المشيمية (HCG) في الكيس الظهري الليمفاوية من كل ضفدع باستخدام إبرة 27 G كما هو موضح في 1.1.1.
    6. وضع كل من الضفادع حقن HCG في دلاء فردية 4 L تحتوي على 0.5X MMR يتم تبريده الى 16 درجة مئوية.
    7. وضع حاويات مع الضفادع في حاضنة 16 درجة مئوية إلى جمع البيض O / N (15-16 ساعة). ملاحظة: الحفاظ على درجة حرارة مناسبة أمر حاسم بالنسبة الإجراء بأكمله، من جمع البيض لإعداد استخراج البيض.
  2. Dejellying بيض
    ملاحظة: يتم تغطية البيض مع معطف هلام التي يجب إزالتها قبل اتخاذ استخراج. احتمال تحلل عفوية من البيض يزيد عن الوقت بين:ن وضع البيض واستخراج الزيادات التحضير. وبالتالي، من المهم المضي قدما من خلال الخطوات التالية بأسرع ما يمكن.
    1. إعداد 4 L من 1X MMR، و 50 مل من 0.1X MMR، و 400 مل من 2٪ السيستين، ودرجة الحموضة 7.7، المحرز في الماء المقطر. الحفاظ على كل الحلول عند 16 درجة مئوية.
    2. لطرد البيض إضافية، الضغط بلطف أسفل الظهر والبطن من الضفادع.
    3. إزالة الضفادع والجزء الأكبر من معدل وفيات الأمهات، وترك البيض في حوالي 1-200 مل من معدل وفيات الأمهات في كل دلو.
    4. إزالة الأنقاض مع ماصة نقل، وتقييم جودة البيض: يتم وضع علامة البيض جودة عالية عموما فصل واضح بين نصف الكرة الحيوان المصطبغة بحزن ونصف الكرة نباتية ملونة خفيفة وتحتوي على أعلى النقيض من الظلام إلى النور. تجاهل مع ماصة نقل أي البيض التي تظهر مفتول العضلات، مرقش، أو هي lysed (أبيض ومنتفخ) لأنها سوف تقلل من الجودة الشاملة للاستخراج. إذا> 10٪ من البيض هي من نوعية رديئة، كامليجب التخلص من دفعة واحدة.
    5. الجمع بين البيض في كوب 500 مل كوب واسكب بقدر MMR ممكن مع الحفاظ على البيض المغمورة.
    6. شطف البيض بنسبة يحوم طيف مع ضعف حجم بيضة MMR. كرر مرتين، وإزالة أي حطام أو البيض نوعية رديئة واضح.
    7. إضافة حوالي 100 مل من 2٪ السيستين إلى الدورق الزجاجي، دوامة بلطف لمزج، والسماح لتسوية البيض لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية. تخلصي من السيستين. ملاحظة: يتم وضع علامة Dejellying بظهور تدريجي للهلام المعاطف تطفو فوق البيض والتعبئة والتغليف أكثر إحكاما من البيض كما أنها الآن تحتل حجم أصغر من دون معطف هلام.
    8. إضافة 100 مل من 2٪ أخرى السيستين، دوامة بلطف، انتظر 5 دقائق، ثم صب ببطء بعيدا عن والسيستين. كرر حتى أصبحت البيض ضغط بإحكام (عادة عن طريق علاج السيستين الثالث). ملاحظة: إذا ترك البيض فترة طويلة جدا في السيستين، فهي عرضة للتحلل. وبالمثل، البيض dejellied هشة وعرضة للتحلل الميكانيكية إذا كانتوملتف بقوة جدا أو إذا تعرضوا للهواء. مرة واحدة تم dejellied البيض، من المهم المضي قدما بسرعة إلى الخطوات الطرد المركزي.
    9. تخلصي السيستين، وشطف بعيدا معطف هلام وغيرها من الحطام عن طريق غسل بلطف البيض في 1X MMR. تخلصي عازلة بعناية على طول الجانب من الكأس. كرر مرتين أو حتى حل MMR لم يعد غائم. بينما الشطف مع 1X MMR مواصلة إزالة البيض سيئة باستخدام ماصة نقل.
    10. إجراء الشطف النهائي لطيف مع 30 مل 0.1X MMR، وبلطف صب قبالة أكبر قدر من العازلة ممكن. مرة أخرى، وإزالة أي الاسوياء واضح.
  3. التعبئة وسحق البيض بواسطة الطرد المركزي
    ملاحظة: يستخدم مستخلص موضح أدناه أن لتدهور β-catenin هو البديل من استخراج عامل تثبيط الخلايا (الطورية II-القبض). وعلى النقيض من سرعة منخفضة وعالية السرعة تستخدم لاستخراج دراسات دورة الخلية، واستخراج سرعة متوسطة يعمل بشكل أفضل لتدهور β-catenin. أنااستخراج nterphase يعزز بالمثل قوية تدهور β-catenin على الرغم من هو أكثر عمالة كثيفة للاستعداد.
    1. إضافة Leupeptin، Pepstatin، أبروتينين خليط (LPA، مثبط البروتياز) في 10 ميكروغرام / مل (المخفف من 10 ملغ / مل في محلول المخزون DMSO) ومثبط حركة الخلايا D في 20 ميكروغرام / مل (المخفف من 10 ملغ / مل محلول المخزون في DMSO) في 20 مل المتبقية من 0.1X MMR.
    2. إضافة 0. س MMR تحتوي LPA ومثبط حركة الخلايا D إلى البيض غسلها، دوامة بلطف، واحتضان لمدة 5 دقائق عند 16 درجة مئوية.
    3. نقل البيض إلى 16 درجة مئوية قبل المبردة 50 مل أنابيب الطرد المركزي، والسماح للبيض ليستقر، وإزالة العازلة المتبقية من أعلى. لمنع التعرض للهواء، سحب كمية صغيرة من العازلة في ماصة نقل قبل سحب البويضات لنقل. مواصلة نقل البيض إضافية في أنابيب الطرد المركزي وإزالة العازلة المتبقية من الجزء العلوي من أنبوب حتى ملء البيض أنبوب الطرد المركزي إلى الأعلى، والتي سوف تعظيم العائد مناستخراج.
    4. لحزم البيض، وأنابيب تدور أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 60 ثانية في 4 درجات مئوية باستخدام الدوار زاوية ثابتة. إزالة العازلة المتبقية من الجزء العلوي من أنابيب الطرد المركزي.
    5. لسحق تدور، وتدور في أنابيب 15،000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. جمع طبقة السيتوبلازم من استخراج
    ملاحظة: الطريقة الموضحة أدناه يختلف عن الأسلوب الكلاسيكي من ثقب جانب أنبوب الطرد المركزي من أجل جمع طبقة حشوية. وقد تم تكييف هذا البروتوكول لتبسيط وخاصة للاستخدام مع أنابيب الطرد المركزي، والتي هي قابلة لإعادة الاستخدام. لم يتم العثور على اختلافات ملحوظة في حركية تدهور β-catenin مع أي من الطريقتين. في هذا المقتطف نقطة يجب أن تبقى باردة أثناء جميع مراحل العملية، ويجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية.
    1. مسح ثقب في طبقة الدهون باستخدام ماصة P1000 طرف.
    2. جمع طبقة حشوية (بين طبقة مصطبغة داكنة ولىطبقة الدهون GHT) باستخدام ماصة P1000 جديدة في تلميح نظيفة أنابيب الطرد المركزي قبل المبردة (الشكل 1). لاستخراج عالية الجودة التي تحط بقوة β-catenin، تقليل كمية طبقة المصطبغة والدهون التي يتم سحبها مع طبقة حشوية.
    3. تدور استخراج طبقة حشوية في 15،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية، ومرة ​​أخرى جمع طبقة حشوية. تكرار تدور واستخراج 1X. ملاحظة: استخراج يجب أن يكون "القشة الملونة." إذا كان هناك تلوث كبير مع طبقات الدهون المصطبغة وعند هذه النقطة، يمكن للمرء أن تكرار تدور واحد مزيد من الوقت، على الرغم من أن يدور المفرط سيقلل من قدرة استخراج أن تتحلل β-catenin.
    4. إضافة LPA ومثبط حركة الخلايا D لاستخراج بتركيزات النهائي من 10 ميكروغرام / مل لكل منهما. ملاحظة: استخدام الأسلوب هو موضح ينتج ما مجموعه تركيز ثابت تقريبا من البروتين حوالي 50 ملغ / مل (52.41 ± 5.40 ملغ / مل، ن = 3 محضرات منفصلة) في مثل القيطمز مقتطفات.
    5. (اختياري) لفحوصات الترجمة، إضافة توج مرنا (0.1 ملغ / مل)، RNAsin (1.5 U / مل)، والطاقة مزيج تجديد (2.2.1)، واحتضان رد فعل على RT لمدة 2 ساعة (لمزيد من المعلومات انظر ساليك وآخرون آل 2 و SIVE وآخرون 33). استخدام مستخلص ترجمتها على الفور لفحوصات تدهور β-catenin أو المفاجئة للتجمد في النيتروجين السائل لاستخدامها لاحقا. ملاحظة: أعدت طازجة استخراج لديه قدرة عالية على ترجمة أضاف خارجيا مرنا، ولكن للأسف، يتم فقدان هذه القدرة مرة واحدة يتم تجميد استخراج. توج مرنا يمكن تحضير بسهولة باستخدام مجموعات متاحة تجاريا.
    6. استخراج الأداة الإضافية تجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: يتم تخزين مقتطفات صغيرة في (200 ميكرولتر) مأخوذة عن استخدام مرة واحدة لأنها تفقد بسرعة قدرتها على تتحلل β-catenin إذا أعيد تجميدها مرة أخرى. للتخزين على المدى الطويل، ويمكن تخزينها في استخراج النيتروجين السائل. للتخزين على المدى القصير، ويمكن تخزين استخراج في -80 درجة مئوية، على الرغم من قدرة سو استخراج أن تتحلل β-catenin يمكن الحد بشكل كبير مع تخزين طويلة في -80 ° C (أطول من شهر 2).

2. إعداد مستخلص للβ-catenin تدهور الفحص

  1. استنزاف من القيطم استخراج
    ملاحظة: والميزة الرئيسية لاستخراج القيطم هو القدرة على تستنزف بسهولة مكونات طريقا وإضافة إلى الوراء بالضبط كمية محددة من البروتين من أجل تحديد الآثار تعتمد على الجرعة الخاصة به.
    1. استخدام الطازجة القيطم استخراج البيض أو ذوبان الجليد بسرعة استخراج المجمدة ومكان على الجليد. أداء جميع التلاعب في البرد.
    2. إضافة إلى استخراج 1/10 من حجم الأجسام المضادة مكعبات او الخرز تقارب (على سبيل المثال، 20 مل حبات مكعبات لاستخراج 200 مل). من أجل تقليل التخفيف من استخراج، سحب قدر السائل من الخرز ممكن قبل بالإضافة للاستخراج باستخدام هلام نصائح التحميل مع طويلة، نصائح مدبب.
    3. تدوير استخراج-مزيج حبة في 4 درجات مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. تدور مزيج استخراج حبة في 12،600 XG في microfuge في 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بدلا من ذلك، إذا تم استخدام الخرز المغناطيسي، وتطبيق المجال المغناطيسي لجمع الخرز.
    5. نقل المنضب استخراج إلى أنبوب microfuge جديدة على الجليد. يجب الحرص على عدم نقل أي الخرز مع استخراج.
    6. تأكيد كفاءة نضوب بواسطة immunoblotting كلا استخراج المنضب والخرز.
    7. إعداد مستخلص لβ-catenin تدهور الفحص كما هو موضح في 2.2.
  2. تحسين القيطم استخراج لβ-catenin تدهور
    ملاحظة: تدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض هو عملية تعتمد على الطاقة التي تستنزف بسرعة مخازن ATP الذاتية. بالتالي، لا بد من وضع نظام تجديد الطاقة للحفاظ على قوة تدهور β-catenin.
    1. إعداد مزيج 20x وتجديد الطاقة (ER)، ويتألف من 150 ملي فوسفات الكرياتين، 20 ملي ATP، 600 ميكروغرام / مل فسفوكيناز الكرياتين،و 20 ملي MgCl 2. وينبغي aliquoted ER وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب تكرار دورات تجميد / الذوبان باستخدام مأخوذة المجمدة صغيرة.
    2. ذوبان الجليد بسرعة القيطم استخراج البيض من قبل فرك أنبوب المجمدة بين يديه. وضع أنبوب على الجليد قبل كل من مستخلص قد ذاب.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من مزيج تجديد الطاقة (20x وER) في قسامة (200 ميكرولتر) من القيطم استخراج البيض. مزيج دقيق من قبل بسرعة عبها الأنبوب ونبض vortexing ل. نبض تدور ووضع على الفور على الجليد.
    4. (اختياري) دوران β-catenin يمكن تعزيز قليلا في القيطم استخراج البيض بإضافة اليوبيكويتين (1.25 ملغ / مل النهائي). ويمكن أيضا سيكلوهيكسيميد (النهائية 0.1 ملغ / مل) أن تضاف إلى تقليل ترجمة النصوص الذاتية.
    5. قسامة وحدات التخزين المناسبة لتدهور الفحص في أنابيب microfuge قبل المبردة على الجليد. لرديولبلد المقايسات تدهور β-catenin، سحب 2-5 استخراج مل لكل نقطة زمنية.

3. رديولبلد β-catenin تدهور في مقايسة القيطم استخراج البيض

ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يرد خلاف ذلك.

  1. إعداد رديولبلد β-catenin
    1. إعداد طازجة في المختبر توليفها [35 S] البروتين ميثيونين رديولبلد باستخدام مجموعات متاحة تجاريا. يتم بسهولة وكفاءة إنتاجها توليد 35 S المسمى (نصف عمر 87 يوما) البروتينات باستخدام المتاحة تجاريا في المختبر، إلى جانب مجموعات النسخ الترجمة: ملاحظة. من المهم أن البروتين ترجمتها هو المسمى بما فيه الكفاية بحيث التغييرات في دوران البروتين يمكن تصور بسهولة.
    2. لتأكيد radiolabeling ناجحة، نفذ SDS-PAGE/autoradiography مع 0.5 ميكرولتر من البروتين ترجمتها. قياس كثافة رديولبلد الفرقة β-catenin باستخدام يماغيج، ImageQuant، أو بديلا الكمي الحديثة اضافة بالصور البرمجياتأنا. ملاحظة: يجب أن يكون رديولبلد β-catenin الفرقة البروتين واضحة للعيان على الفيلم في غضون ساعات قليلة (4-6 ساعة).
    3. الأداة الإضافية تجميد البروتين رديولبلد في النيتروجين السائل لتخزين حتى الاستخدام. ملاحظة: التخزين لفترات طويلة (> 2 أشهر) ومتعددة تجميد / الذوبان (أكبر من 2) يمكن أن تؤثر بشدة على قدرة رديولبلد β-catenin أن تتحلل بقوة في القيطم استخراج البيض. عادة، واستقرار البروتينات رديولبلد ينخفض ​​بشكل ملحوظ بعد شهر 1 من التخزين في -80 درجة مئوية؛ وبالتالي، طازجة نسبيا رديولبلد β-catenin يعطي أفضل النتائج في هذه المقايسات تدهور.
  2. أداء β-catenin تدهور الفحص
    1. إضافة 1-3 ميكرولتر (اعتمادا على قوة الإشارة الفرقة رديولبلد) في المختبر ترجمة-β-catenin (وغيرها من البروتينات، والجزيئات الصغيرة، الخ. التي يجري اختبارها) في 20 ميكرولتر من مزيج القيطم رد فعل على الجليد. مزيج دقيق من قبل وجه السرعهذ عبها الأنبوب ونبضة قصيرة من vortexing ل؛ هذا هو خطوة هامة كما القيطم استخراج البيض هو لزج جدا، وسوف تؤثر على خلط غير مكتملة اتساق النتائج. نبض تدور ومكان على الجليد.
    2. بدء تدهور رد فعل β-catenin عن طريق تحويل أنابيب لRT.
    3. في نقطة زمنية معينة، وإزالة 1-5 مل من العينة وخلط فورا مع SDS عينة العازلة (حجم 5X) لوقف رد الفعل. للتأكد من إنهاء رد فعل تدهور تماما، أنبوب نفض الغبار عدة مرات ودوامة بقوة.
    4. أداء SDS-PAGE/autoradiography. تشغيل 1 مل حكمه (~ 50 ملغ من البروتين) من استخراج كل مرة لنقطة / حارة. يجب أن يتضح تدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض من الانخفاض تعتمد على الوقت في شدة رديولبلد β-catenin الفرقة الشكل 2. القياس الكمي النتائج باستخدام يماغيج، ImageQuant، أو غيرها من برامج التصوير المفضل إذا لزم الأمر.
    5. (الأمثلاونال) نقع هلام SDS-بولكرلميد في تحديد الحل (حامض الخليك 10٪ و 30٪ الميثانول في الماء المقطر) قبل التجفيف لخفض النشاط الإشعاعي الخلفية وزيادة جودة الصورة.

4. β-catenin luciferase المراسل تدهور الفحص في القيطم استخراج البيض

تنفيذ جميع الخطوات على الجليد ما لم يرد خلاف ذلك.

  1. إعداد β-catenin-luciferase المراسل
    1. توليف غير رديولبلد، الموسومة luciferase المراسل β-catenin باستخدام جانب نظام النسخ الترجمة كاملة مع مزيج من الأحماض الأمينية.
    2. تأكيد إنتاج الموسومة luciferase المراسل β-catenin عن طريق قياس luciferase النشاط 0،5-1 ميكرولتر من رد الفعل. تقييم التلألؤ الخلفية عن طريق قياس التلألؤ من مزيج رد فعل غير مترجمة. ملاحظة: هي مجموعات تجارية متعددة متاحة لقياس luciferase النشاط. التلألؤ طويلة الأجل، ومع ذلك، يعمل بشكل جيد لا سيما بالنسبة لتدهور أساذ.
  2. أداء β-catenin-luciferase المراسل تدهور الفحص
    1. ذوبان الجليد وإعداد القيطم استخراج البيض كما في 2.2.
    2. إضافة في المختبر المترجمة β-catenin-luciferase المراسل الانصهار (من 4.1) في إعداد القيطم مزيج التفاعل (من 2.2) على الجليد وتخلط جيدا كما هو الحال في 3.2.1. ملاحظة: نشاط luciferase المراسل β-catenin التي يتم إضافتها إلى استخراج عادة بين 20 - 50،000 وحدة التلألؤ النسبي (RLU) / مل من مستخلص (على أساس القياسات التي تم الحصول عليها من 4.1.2). يجب أن تكون إشارة البدء حوالي 100،000 RLU (2-5 مل من المختبر ترجمة-β-catenin luciferase المراسل الانصهار في).
    3. تحويل لاستخراج RT لبدء رد فعل تدهور.
    4. إزالة قسامة من رد فعل في الوقت المشار إليه والمفاجئة التجميد في النيتروجين السائل. ملاحظة: عادة ما يتم إزالة عينات للتحليل ثلاث نسخ عن كل نقطة زمنية. ويمكن تخزين استخراج المجمدة في -80 ° C الاتحاد الوطني للعمالايل انهم مستعدون لتحليلها.
    5. عينات ذوبان الجليد، ونقل العينات إلى اللون الأبيض القياسية لوحات 96 جيدا على الجليد، وعملية luciferase النشاط.

النتائج

ويرد التخطيطي للتدهور β-catenin في القيطم استخراج البيض في الشكل 2A. وقد حضنت 35 S-β-وصفت catenin في القيطم استخراج البيض، وأزيلت مأخوذة (1 مل ​​استخراج ما يعادلها) في الأوقات المناسبة، وتعرض عينات ل SDS-PAGE تليها تصوير الإشعاع الذاتي. وتوسط تدهور β-catenin ب?...

Discussion

القيطم استخراج البيض هو نظام البيوكيميائية قوية للتحقيق في دوران β-catenin. تركيز β-catenin في القيطم استخراج البيض هو ~ 25 نانومتر 2. تحت الظروف المثلى، واستخراج البيض قادر على المهينة β-catenin بمعدل 50-100 نانومتر / ساعة ونصف القصوى، في 200 نانومتر 24. وهناك الع?...

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

نشكر لوري لي لقراءة نقدية للمخطوطة. معتمد من قبل TWC دكتوراه مسبقا زمالة جمعية القلب الأمريكية (12PRE6590007). ويدعم MRB من منحة تدريب المعهد الوطني للسرطان (T32 CA119925). ويدعم SSH من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01DK078640). ويدعم EL من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01GM081635 وR01GM103926).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)ProSpechor-272-AReconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropinSigmaCG10-10VL
Potassium chlorideFisherBP366-1
Sodium chlorideResearch Products InternationalS23020-5000.0
Magnesium chlorideFisherBP214-500
Calcium chlorideAcros OrganicsAC42352-5000
HEPESFisherBP310-1
CysteineAcros OrganicsAC17360-1000
LeupeptinSigmaL2884-10MG
AprotininSigmaA1153-10MG
PepstatinSigmaP4265-5MG
Cytochalasin BSigmaC8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tipBecton Dickinson309657
27 G needleBecton Dickinson305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomedCorning3605
Steady-Glo luciferase assay systemPromegaE2520Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate systemPromegaL4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression systemPromegaL3260Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35]Perkin ElmerNEG772007MC
Creatine phosphateSigma27920-5G
ATPSigmaA2383-5G
Creatine phosphokinaseSigmaC3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay systemPromegaE2920Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubesFisher Scientific0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotorThermo Scientific28020
115 V 50/60 Hz MinicentrifugeFisher Scientific05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kitAmbionAM1340
Anti-firefly luciferase antibodyAbcamab16466
Anti-GSK3 antibodyBD Transduction Laboratories610201
FLUOStar OptimaBMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific
16 °C IncubatorPercival Scientific

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

to:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 µl pelleted beads to 200 µl extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 µl extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 µl of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 µl equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/µl of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 µl of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88 radiolabel luciferase

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved