Rekonstitution von β-Catenin-Abbau in<em&gt; Xenopus</em&gt; Egg Extract

Zusammenfassung

Es wird ein Verfahren zur Analyse von Protein-Abbau unter Verwendung radioaktiv markiert und die Luciferase-Fusionsproteine ​​in Xenopus-Ei-Extrakt und deren Anpassung für Hochdurchsatz-Screening für Kleinmolekül-Modulatoren der Proteinabbaus beschrieben.

Zusammenfassung

Xenopus laevis-Ei-Extrakt ist eine gut charakterisierte, robustes System zur Untersuchung der Biochemie der verschiedenen zellulären Prozessen. Xenopus-Ei-Extrakt verwendet wurde, um den Proteinumsatz in vielen zellulären Kontexten, einschließlich des Zellzyklus und der Signalübertragungswege ^1-3 studieren. Hierin wird ein Verfahren zur Isolierung von Xenopus-Ei-Extrakt, das optimiert wurde, um die Verschlechterung der kritischen Wnt-Komponente, β-Catenin fördert beschrieben. Zwei verschiedene Verfahren werden beschrieben, um β-Catenin Proteinabbau in Xenopus-Ei-Extrakt zu beurteilen. Ein Verfahren ist visuell aussage ^([35 S]-radioaktiv markierte Proteine), während das andere leichter für Hochdurchsatz-Assays (Firefly-Luciferase-markierte Fusionsproteine) skaliert. Die beschriebenen Techniken können dazu verwendet werden, ein, sind aber nicht darauf beschränkt, zu beurteilen β-Catenin-Protein zu identifizieren und Umsatz molekularen Komponenten beiträgt, den Umsatz. Zusätzlich wird die Fähigkeit, um große Mengen von homogenen Xenopus-Ei-Extrakt in Kombination mit der quantitativen und einfache Auslesung der Luciferase-markierte Proteine ​​zu reinigen, ermöglicht dieses System leicht für Hochdurchsatz-Screening auf Modulatoren von β-Catenin Abbau angepasst werden.

Einleitung

Xenopus laevis-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um viele Zell biologischen Prozessen einschließlich Zytoskeletts, Kernanordnung und Import, Apoptose, Ubiquitin-Stoffwechsel, Zellzyklus-Progression, Signaltransduktion und Proteinumsatz ^1-17 studieren. Die Xenopus-Ei-Extrakt-System ist offen für die biochemische Analyse einer Legion von zellulären Prozessen, weil Ei-Extrakt stellt im Wesentlichen unverdünnt Zytoplasma, die alle wesentlichen Komponenten zytoplasmatischen notwendig, diese Prozesse auszuführen und ermöglichen Untersuchung enthält. Große Mengen von Ei-Extrakt kann auf einmal zur biochemischen Manipulationen, die große Mengen von Material (z. B. Proteinreinigung oder Hochdurchsatz-Screening) ^18-20 erfordern, hergestellt werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass die Konzentration von spezifischen Proteinen in Xenopus-Ei-Extrakt kann präzise durch Zugabe von rekombinantem Protein und / oder der Immunodepletion ENDOG eingestellt werdenenous Proteine ​​im Gegensatz zur Transfektion von Plasmid-DNA, wobei die Expression des Proteins von Interesse ist schwierig zu steuern. Darüber hinaus kann der Mangel an verfügbaren rekombinanten Proteinen durch die Zugabe von Transkripten, die das Protein von Interesse kodiert, überwunden werden, unter Ausnutzung der hohen Kapazität der frisch hergestellten Xenopus-Ei-Extrakt zur exogen zuge mRNA zu übersetzen.

Die Regulation der Proteinabbau ist entscheidend für die Steuerung vieler zelluläre Wege und Prozesse ^21. Xenopus-Ei-Extrakt wurde ausgiebig verwendet, um den Proteinabbau zu untersuchen, wie das System erlaubt mehrere Möglichkeiten, um den Proteinumsatz ohne verwirrende Einflüsse der Transkription und Translation kontrollieren. Der Wnt-Signalweg ist eine hoch konservierte Signalweg, der eine entscheidende Rolle in der Entwicklung und Krankheit spielt. Der Umsatz von β-Catenin, der Haupt Effektor des Wnt-Signalwegs, ist stark reguliert, und eine erhöhte Steady-State-level von β-Catenin ist entscheidend für die Aktivierung der Wnt-Zielgene. Die Bedeutung der β-Catenin-Abbau wird durch die Tatsache, dass Mutationen im Wnt-Signalweg, die β-Catenin-Abbau hemmen, gefunden in ~ 90% der sporadischen Fälle von Darmkrebs ²² hervorgehoben. β-Catenin-Abbau durch Komponenten des Wnt-Signalwegs getreu in Xenopus-Ei-Extrakt rekapituliert, um den Mechanismus des Umsatzes zu studieren sowie neuartiger niedermolekularer Modulatoren von seiner Abbau ^{2, 19, 20, 23-29} zu identifizieren.

Verfahren zur Herstellung von Xenopus-Ei-Extrakt zur Untersuchung der Zellzyklus sind in früheren Veröffentlichungen JoVE ^30-32 beschrieben. Das derzeitige Protokoll beschreibt eine Modifikation dieser Verfahren und ist für den Abbau von optimierten ^[35 S]-radioaktiv markierten β-Catenin und die Luciferase-markierten β-Catenin inXenopus-Ei-Extrakt. Das radioaktiv markierte Abbau-Assay ermöglicht die direkte Visualisierung von Protein-Ebene über Autoradiographie. ^[35 S]-Methionin in das Protein von Interesse unter Verwendung eines in vitro-Translationsreaktion, die dann direkt auf eine Abbaureaktion zugegeben werden kann, eingebaut. Darüber hinaus ist das radioaktiv markierte Proteinumsatz-Assay erfordern einen Antikörper gegen das Protein von Interesse oder ein Epitop-Tag, das die Proteinstabilität beeinflussen. Da selbst kleine Veränderungen in der Proteinniveaus, wie in Änderungen der Intensität des radioaktiv markierten Proteinbande reflektiert, werden leicht durch Autoradiographie sichtbar gemacht, die ^[35 S]-radioaktiv markierte Abbauassay stellt ein sehr nützliches Verfahren zur Visualisierung des Proteinumsatzes ^2.

Fusion von β-Catenin an Leuchtkäfer-Luciferase (im folgenden einfach als "Luciferase" genannt) ermöglicht eine genaue und einfache quantitative Messung der Proteinspiegel, umum die kinetischen Eigenschaften der β-Catenin-Umsatz ^{19, 20} zu bestimmen. Ein wesentlicher Vorteil der Luciferase-Assay ist, dass es eine starke quantitative System, in dem bis skaliert wird. Das folgende Protokoll bietet einfache Methoden zur Bestimmung von β-Catenin-Abbau und eine robuste, effiziente und effektive Methode für die Hochdurchsatz-Screening von neuen β-Catenin-Modulatoren.

Protokoll

1. Vorbereitung der Xenopus-Ei-Extrakt

HINWEIS: Jeder Frosch ergibt etwa 1 ml der verwendbaren Ei-Extrakt. Extrakte aus 10 Frösche werden typischerweise zu einer Zeit hergestellt wird, und das Volumen der unten beschriebenen Puffer zur Durchführung einer 10 Frosches Xenopus-Ei-Extrakt prep. Das Puffervolumen kann somit für größere oder kleinere Zubereitungen von Ei-Extrakt eingestellt werden. Preps auf diese Weise erzeugte Proteinkonzentrationen konsequent ergeben ≥ 50 mg / ml. Die Erfassung Eier und Verarbeitung zu extrahieren ist am effizientesten, wenn sie von zwei Personen durchgeführt. (Für die Grundhaltung Frosch Techniken siehe Sive et al. ^33).

1. Ei-Sammlung
   1. Auffrischen der Frösche, spritzen jeden weiblichen Frosch mit 100 U Pregnant Mare Serum Gonadotropin (PMSG) von einem frisch zubereiteten 250 U / ml Lager. Verwenden Sie ein 3 ml Tuberkulin-Spritze mit einer 27 G-Nadel subkutan zu injizieren, mit der Schrägedie Nadel nach oben in die Rücken Lymphsack, die etwa 1 cm von der Mittellinie von der gekerbten Verfärbungen entlang der Länge der Schenkel des Strahls befindet.
   2. Shop grundiert Frösche im Wasser (plus 20 mM NaCl, siehe Sive et al. ³³⁾ bei 18 ° C für 5-10 Tage. Für stehende Wassertank-Systemen ist die Tierdichte etwa 4 l Wasser pro Weibchen Frosch. HINWEIS: Die Mindestzeit für die Grundierung wirksam werden benötigt 5 Tage, und die Auswirkungen der Grundierung tragen off nach 10 Tagen.
   3. Bereiten 0.5x Marc Geändert Ringers (MMR)-Lösung aus einer 20x MMR Lager. 20x MMR besteht aus 2 M Natriumchlorid, 40 mM Kaliumchlorid, 40 mM Calciumchlorid, 20 mM Magnesiumchlorid und 100 mM 4 - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure (HEPES), pH 7,4.
   4. Richten Sie Eimer für alle injiziert Frösche (ein Frosch pro 4 l Eimer). HINWEIS: Obwohl mehr als ein Frosch kann in der gleichen Eimer für Eiersammlung gebracht werden, wenn einer der Fröschelegt überwiegend schlechte Qualität Eier, wird ein erheblicher Aufwand erforderlich, um die schlechte Qualität Eier von denen, die für die Herstellung Extrakt sind zu trennen. Somit maximiert die Anzahl von Fröschen im gleichen Behälter, die Menge an Puffer zum Ei zu minimieren Collect ist das Risiko nicht wert.
   5. Inject 750 U Humanes Choriongonadotropin (HCG) in die dorsale Lymphsack jeder Frosch mit einer 27 G-Nadel, wie in 1.1.1 beschrieben.
   6. Legen Sie jede der HCG injiziert Frösche in einzelne 4 L Eimer enthält 0,5 x MMR abgekühlt auf 16 ° C
   7. Legen Sie die Behälter mit den Fröschen in einem 16 ° C-Inkubator, um Eier zu sammeln O / N (15-16 h). HINWEIS: Die Aufrechterhaltung der richtigen Temperatur ist entscheidend für das gesamte Verfahren, von der Erhebung der Vorbereitung Eier Ei-Extrakt.
2. Dejellying Eier
   HINWEIS: Die Eier werden mit einer Gallerthülle, die vor der Herstellung Extrakt entfernt werden müssen, abgedeckt. Die Wahrscheinlichkeit der spontanen Lyse der Eier als die Zeit zwische erhöhtn Eiablage und extrahieren Vorbereitung steigt. Somit ist es wichtig, durch die folgenden Schritte so schnell wie möglich ablaufen.
   1. Herstellung von 4 l 1x MMR, 50 ml 0,1 x MMR, und 400 ml 2% Cystein, pH 7,7, in destilliertem Wasser hergestellt. Pflegen Sie alle Lösungen bei 16 ° C
   2. Um weitere Eier zu vertreiben, drücken Sie leicht den unteren Rücken und Bauch des Frosches.
   3. Entfernen Sie die Frösche und den Großteil der MMR, um die Eier in etwa 1-200 ml MMR in jedem Eimer zu verlassen.
   4. Entfernen Sie Schmutz mit einer Transferpipette und beurteilen die Qualität der Eier: hochwertige Eier werden in der Regel durch eine klare Trennung zwischen der dunkel pigmentierten Tier Hemisphäre und der leicht gefärbt pflanzlichen Hemisphäre markiert und haben die höchste Dunkel-Lichtkontrast. Entsorgen mit einer Transferpipette alle Eier, die sehnig, fleckige oder lysiert (weiß und geschwollen) erscheinen, wie sie die Qualität des Extraktes zu verringern. Wenn> 10% der Eier sind von schlechter Qualität, die gesamteBatch sollte verworfen werden.
   5. Kombinieren Sie Eier in einen 500-ml-Becherglas und gießen Sie so viel wie möglich MMR während Eier getaucht.
   6. Eier Spülen unter leichtem Schwenken mit dem doppelten Volumen der MMR-Ei. Zweimal wiederholen, und entfernen Sie Schmutz oder offensichtlich schlechte Qualität Eier.
   7. In ca. 100 ml 2% Cystein zu dem Becherglas, vorsichtig schwenken zu mischen und ermöglichen Eier für 5 min bei 16 ° C absetzen Gießen Sie die Cystein. HINWEIS: Dejellying wird durch die allmähliche Auftreten von Gelee Mäntel schweben über die Eier und der kompakteren Verpackung der Eier gekennzeichnet, wie sie jetzt ein kleineres Volumen einnimmt, ohne die Gallerthülle.
   8. In weiteren 100 ml 2% Cystein, schwenken, warten Sie 5 Minuten, und dann langsam abgießen Cystein. Wiederholen, bis Eier haben sich zu stark verdichtet (in der Regel von der dritten Cystein-Behandlung). Hinweis: Wenn Eier zu lange in Cystein übrig sind, anfällig für die Lyse sind sie. Ebenso sind dejellied Eier zerbrechlich und anfällig für mechanische Lyse, wenn siesind zu kräftig gewirbelt, oder wenn sie der Luft ausgesetzt sind. Nachdem die Eier wurden dejellied, ist es wichtig, schnell auf die Zentrifugation fortfahren.
   9. Abgießen Cystein und wegspülen das Gelee Mantel und andere Verunreinigungen durch leichtes Waschen Eier in 1x MMR. Gießen Sie Puffer sorgfältig an der Seite des Bechers. Zweimal wiederholen oder bis MMR-Lösung nicht mehr trüb. Während Spülen mit 1x MMR weiterhin die schlechte Eier zu entfernen mit einer Transferpipette.
   10. Eine abschließende schonendes Spülen mit 30 ml 0,1 x MMR, und vorsichtig abgießen, wie viel von dem Puffer wie möglich. Wieder, entfernen Sie alle natürlich schlecht Eier.
3. Verpackung und Crushing Eier durch Zentrifugation
   HINWEIS: Die unten beschriebenen Extrakt wird für β-Catenin-Abbau ist eine Variante des Zytostatikums Faktor-Extrakt (Metaphase II festgenommen). Im Gegensatz zu der Niedriggeschwindigkeits-und Hochgeschwindigkeits-Extrakt für die Zellzyklusstudien verwendet, Zwischengeschwindigkeit Extrakt besten für β-Catenin-Abbau. Ichnterphase Extrakt fördert ähnlich robust β-Catenin-Abbau ist zwar arbeitsintensiver, sich vorzubereiten.
   1. In Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin-Mischung (LPA, einem Protease-Inhibitor) bei 10 pg / ml und Cytochalasin D (aus einer 10 mg / ml Stammlösung in DMSO) bei 20 pg / ml (aus einer 10 mg / ml Stammlösung verdünnt in DMSO) in die verbleibenden 20 ml 0,1 x MMR.
   2. 0 hinzufügen. X MMR enthalten LPA und Cytochalasin D zu den gewaschenen Eier, vorsichtig schwenken und Inkubation für 5 min bei 16 ° C
   3. Übertragen Eier in 16 ° C vorgekühlte 50 ml Zentrifugenröhrchen, damit die Eier zu regeln, und entfernen Restpuffer von oben. Um an der Luft zu verhindern, in die Transferpipette zurückzutreten eine kleine Menge Puffer vor dem Abziehen Eier für die Übertragung. Weiterhin zusätzliche Eier in die Zentrifugenröhrchen übertragen und entfernen Restpuffer von der Spitze der Röhre, bis die Eier füllen die Zentrifugenröhrchen nach oben, was die Ausbeute zu maximieren wird vonextrahieren.
   4. Um die Eier, Spin Zentrifugenröhrchen bei 400 g für 60 Sekunden bei 4 ° C Packung mit einem Festwinkelrotor. Entfernen Restpuffer von der Spitze der Zentrifugenröhrchen.
   5. Für die Zerkleinerung Spin, Spin Röhrchen bei 15.000 × g für 5 min bei 4 ° C.
4. Sammeln Cytoplasmic Schicht von Extract
   HINWEIS: Die unten beschriebene Methode unterscheidet sich von der klassischen Methode der Punktion der Seite der Zentrifugenröhrchen, um die Zytoplasma-Schicht zu sammeln. Dieses Protokoll wurde zur Vereinfachung und für die Verwendung mit bestimmten Zentrifugenröhrchen, die wiederverwendbar sind, angepasst. Keine merkliche Unterschiede in der Kinetik der β-Catenin-Abbau sind entweder Verfahren gefunden. An diesem Punkt Extrakt sollte während des gesamten Prozesses kalt gehalten werden, und alle Schritte bei 4 ° C durchgeführt werden
   1. Deaktivieren Sie ein Loch in die Lipidschicht mit Hilfe von P1000 Pipettenspitze.
   2. Sammeln Sie die Zytoplasma-Schicht (zwischen dem dunklen Pigmentschicht und der light Lipidschicht) mit einer neuen P1000 Pipettenspitze in saubere vorgekühlte Zentrifugenröhrchen (Abbildung 1). Für hochwertige Extrakt, robust abbaut β-Catenin, minimieren die Menge von pigmentierten und Lipidschicht, die mit der zytoplasmatischen Schicht abgezogen wird.
   3. Spin extrahiert zytoplasmatische Schicht bei 15.000 × g für 10 min bei 4 ° C und Sammeln der cytoplasmatischen Schicht wieder. Wiederholen Sie den Spin-und Extraktions 1X. HINWEIS: Der Extrakt sollte "strohfarben." Wenn es wesentliche Kontamination mit den pigmentierten und Lipidschichten an diesem Punkt kann man den Spin noch einmal zu wiederholen, obwohl übermäßige Spins wird die Kapazität des Extraktes auf β-Catenin abgebaut verringern.
   4. Hinzufügen LPA und Cytochalasin D, um den Extrakt in Endkonzentrationen von 10 ug / ml. HINWEIS: Mit dem beschriebenen Verfahren ergibt eine ziemlich konsequente Gesamtproteinkonzentration von ca. 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 separate Preps) in Xenopus zBg-Extrakten.
   5. (Optional) Für Übersetzungs Assays, fügen bedeckten mRNA (0,1 mg / ml), RNAsin (1,5 U / ml), und die Regeneration Energie-Mix (2.2.1) und Inkubation der Reaktion bei RT für 2 Stunden (für weitere Informationen siehe salischen et al. ³³⁾ al. ² und Sive et. Verwenden Sie übersetzte Auszug sofort für β-Catenin-Abbau-Assays oder Snap-freeze in flüssigem Stickstoff für die spätere Verwendung. HINWEIS: Frisch hergestellte Extrakt hat eine hohe Fähigkeit, exogen zuge mRNA übersetzen, aber leider ist diese Fähigkeit verloren, sobald der Extrakt wird eingefroren. Capped-mRNA kann leicht unter Verwendung kommerziell erhältlichen Kits werden.
   6. Snap-Extrakt Einfrieren in flüssigem Stickstoff. HINWEIS: Extrakte werden in kleinen (200 ul) Aliquots für den einmaligen Gebrauch gespeichert werden, da sie schnell ihre Fähigkeit, β-Catenin, wenn wieder eingefroren verschlechtern. Für langfristige Lagerung kann Extrakt in flüssigem Stickstoff gelagert werden. Für Kurzzeitspeicher kann Extrakt bei -80 ° C gelagert werden, obwohl die Kapazität of-Extrakt zu β-Catenin abbauen können dramatisch mit längerer Lagerung reduziert werden bei -80 ° C (länger als 2 Monate).

2. Vorbereitung Extract für β-Catenin-Abbau-Assay

1. Depletion von Xenopus-Extrakt
   HINWEIS: Ein wesentlicher Vorteil des Xenopus-Extrakt ist die Fähigkeit, ohne weiteres verbrauchen Komponenten eines Weges und eine bestimmte Menge eines Proteins genau wieder hinzuzufügen, um die Dosis-abhängigen Effekte zu bestimmen.
   1. Verwenden Sie frisch zubereitete Xenopus-Ei-Extrakt oder schnell auftauen gefrorenen Extrakt und auf Eis. Führen Sie alle Manipulationen in der Kälte.
   2. Add-Extrakt auf 1/10 des Volumens des pelle Antikörper oder Affinitätskügelchen (z. B. 20 ml Kügelchen pelletiert und 200 ml Extrakt). Zur Verdünnung des Extraktes zu minimieren, ziehen so viel Flüssigkeit aus den Perlen wie möglich vor der Zugabe des Extraktes mit Gel-Ladespitzen mit langen, sich verjüngenden Spitzen.
   3. Drehen Extrakt-Beadgemisch bei 4 ° C für 1 Stunde.
   4. Spin-Extrakt Beadgemisch bei 12.600 × g in Mikrozentrifuge bei 4 ° C für 30 sek. Alternativ, wenn Magnetkügelchen verwendet werden, gelten Magnetfeld, um Perlen zu sammeln.
   5. Überweisung erschöpft Extrakt zu einem frischen Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Seien Sie vorsichtig, keine Perlen mit dem Extrakt zu übertragen.
   6. Effizienz der Erschöpfung Bestätigen durch Immunoblotting sowohl abgereichertem Extrakt und Perlen.
   7. Bereiten Extrakt für β-Catenin-Abbau-Assay, wie in 2.2 beschrieben.
2. Optimierung Xenopus Extrakt für β-Catenin-Abbau
   HINWEIS: β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ein energieabhängiger Prozess, schnell erschöpft das endogene ATP speichert. Folglich wird ein Energierückgewinnungssystem erforderlich, um robuste β-Catenin-Abbau zu erhalten.
   1. Bereiten Sie eine 20x Energie-Rückgewinnung (ER)-Mix, bestehend aus 150 mM Kreatinphosphat, 20 mM ATP, 600 ug / ml Creatinphosphokinase,und 20 mM MgCl _2. ER sollte aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden Vermeiden Sie wiederholte Einfrieren / Auftauen von eingefrorenen Aliquots mit kleinen.
   2. Tauen schnell Xenopus-Ei-Extrakt durch Reiben der gefrorenen Röhre zwischen den Händen. Das Röhrchen auf Eis unmittelbar bevor der gesamte Extrakt wurde geschmolzen.
   3. Werden 10 ul Energierückmischung (20x ER) in einem Aliquot (200 ul) von Xenopus-Ei-Extrakt. Gründlich mischen durch schnippen schnell den Schlauch und Impuls Verwirbelung. Pulse-Spin und sofort auf Eis legen.
   4. (Optional) Der Umsatz von β-Catenin kann etwas in Xenopus-Ei-Extrakt durch Zugabe von Ubiquitin (1,25 mg / ml final) verbessert werden. Cycloheximid (0,1 mg / ml Endkonzentration) zugesetzt werden, um die Translation endogener Transkripte zu minimieren.
   5. Aliquot die entsprechenden Volumina für den Abbau-Assay in vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis. Für radioaktiv markiertem β-Catenin-Abbau-Assays, zurückzutreten 2-5 ml für jeden Zeitpunkt zu extrahieren.

3. Radioaktiv markierte β-Catenin-Abbau-Assay in Xenopus-Ei-Extrakt

HINWEIS: Alle Schritte sollten auf Eis durchgeführt, sofern nicht anders angegeben.

1. Vorbereiten Radioaktiv markierte β-Catenin
   1. Vorbereitung frisch in vitro synthetisierten ^[35 S]-Methionin radioaktiv markiertes Protein unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. HINWEIS: Generieren ³⁵ S-markierten (Halbwertszeit 87 Tage) Proteine ​​leicht und effizient unter Verwendung von im Handel erhältlichen in vitro gekoppelten Transkriptions-Translations-Kits hergestellt. Es ist wichtig, dass das translatierte Protein ausreichend markiert, so daß Veränderungen in den Proteinumsatz leicht sichtbar gemacht werden kann.
   2. Um erfolgreich zu radioaktiven Markierung bestätigen, führen SDS-PAGE/autoradiography mit 0,5 ul des übersetzten Protein. Quantifizierung der Intensität der radioaktiv markiertem β-Catenin-Band mit ImageJ, Imagequant oder eine alternative quantitative Software progrbin. HINWEIS: Die radioaktiv markierten β-Catenin-Protein-Bande sollte in wenigen Stunden (4-6 Std.) auf dem Film deutlich sichtbar sein.
   3. Schnapp Einfrieren der radioaktiv markierten Protein in flüssigen Stickstoff für die Lagerung bis zur Verwendung. Hinweis: Längere Lagerung (> 2 Monate) und mehrfaches Einfrieren / Auftauen (größer als 2) erheblich beeinträchtigen kann die Kapazität des radioaktiv markierten β-Catenin zu robust in Xenopus-Ei-Extrakt abzubauen. Typischerweise wird die Stabilität der radiomarkierten Proteine ​​sinkt signifikant nach 1 Monat Lagerung bei -80 ° C; somit relativ frisch zubereitet radioaktiv markiertem β-Catenin liefert die besten Ergebnisse in dieser Abbau-Assays.
2. Darstellende β-Catenin-Abbau-Assay
   1. In 1-3 ul (abhängig von der Stärke des radioaktiv markierten Bandsignal) von in-vitro-übersetzte β-Catenin (und andere Proteine, kleine Moleküle usw., die getestet werden) in 20 ul Xenopus-Reaktionsmischung auf Eis. Gründlich mischen quickly Dazu den Schlauch und einen kurzen Impuls von Wirbeln; dies ist ein wichtiger Schritt, da Xenopus-Ei-Extrakt ist sehr viskos, und unvollständiges Mischen wird die Konsistenz der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Pulse Spin und auf Eis stellen.
   2. Starten Sie den β-Catenin-Abbaureaktion durch Verschieben der Rohre auf RT.
   3. Zum festgelegten Zeitpunkt, entfernen Sie 1-5 ml der Probe und sofort mischen mit SDS-Probenpuffer (5x Volumen), um die Reaktion zu stoppen. Um sicherzustellen, dass die Abbaureaktion ist vollständig beendet, Röhrchen klopfen mehrmals und kräftig vortexen.
   4. Führen SDS-PAGE/autoradiography. Führen Sie 1 ml-Äquivalente (~ 50 mg Protein) des Extraktes für jeden Zeitpunkt / Spur. Abbau von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt sollte durch die zeitabhängige Abnahme der Intensität der radioaktiv markierten β-Catenin-Band Abbildung 2 nachgewiesen werden. Quantifizierung Ergebnisse mit ImageJ, Imagequant oder anderen bevorzugten Bildbearbeitungssoftware, wenn nötig.
   5. (Optional) Tränken SDS-Polyacrylamid-Gel in Fixierlösung (10% Essigsäure und 30% Methanol in destilliertem Wasser) vor dem Trocknen, um Hintergrundradioaktivität zu verringern und die Qualität des Bildes.

4. Β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt

Führen Sie alle Schritte auf Eis, es sei denn anders angegeben.

1. Vorbereiten β-Catenin-Luciferase-
   1. Synthetisieren, nicht-radioaktiv markierten, Luciferase-markierten β-Catenin mit der Transkriptions-Translations-System gekoppelt mit vollständigen Aminosäuremischung.
   2. Herstellung des Luciferase-markierten β-Catenin durch Messung der Luciferase-Aktivität von 0,5 bis 1 &mgr; l der Reaktion zu bestätigen. Bewerten Hintergrund Lumineszenz durch Messung der Lumineszenz von einem nicht übersetzten Reaktionsmischung. HINWEIS: Mehrere kommerzielle Kits sind für die Messung Luciferase-Aktivität zur Verfügung. Langlebige Lumineszenz, jedoch funktioniert besonders gut für den Abbau assay.
2. Darstellende β-Catenin-Luciferase-Assay-Abbau
   1. Auftauen und bereiten Xenopus-Ei-Extrakt, wie in 2.2.
   2. In in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions (ab 4.1) in vorbereitete Xenopus-Reaktionsgemisch (2,2) auf Eis und gut mischen, wie in 3.2.1. HINWEIS: Die Aktivität der β-Catenin-Luciferase, die zu dem Extrakt zugegeben wird, ist typischerweise zwischen 20 - 50.000 relativen Lumineszenz-Einheiten (RLU) / ml des Extrakts (basierend auf Messungen 4.1.2) erhalten. Startschuss sollte ungefähr 100.000 RLU (2-5 ml der in vitro-übersetzte β-Catenin-Luciferase-Fusions) sein.
   3. Verschieben Sie den Extrakt auf RT , um die Abbaureaktion zu starten.
   4. Entfernen Sie einen aliquoten Teil der Reaktion in der angegebenen Zeit und Snap-in flüssigem Stickstoff einfrieren. HINWEIS: Dreifachproben werden typischerweise zur Analyse entfernt für jeden Zeitpunkt. Gefrorene Extrakt kann bei -80 ° C gelagert werden, until sie bereit sind, analysiert werden.
   5. Tauwetter Eis-Proben, Proben Übertragung auf Standard-Weiß 96-Well-Platten auf Eis, und ein Verfahren zur Luciferase-Aktivität.

Ergebnisse

Eine schematische Darstellung des β-Catenin-Abbau in Xenopus-Ei-Extrakt ist in 2A gezeigt. ³⁵ S-markierten β-Catenin wurde in Xenopus-Ei-Extrakt inkubiert wurden Aliquots (1 ml Extrakt Äquivalent) zu den entsprechenden Zeiten entnommen und die Proben wurden einer SDS-PAGE, gefolgt von Autoradiographie. β-Catenin Abbau von Komponenten des Wnt-Signalwegs durch das Ubiquitin-Proteasom-System ² vermittelt wird, und den Abbau von ^[35 S]-radioaktiv markie...

Diskussion

Xenopus-Ei-Extrakt ist ein robustes System für die Untersuchung von biochemischen β-Catenin-Umsatzes. Die Konzentration von β-Catenin in Xenopus-Ei-Extrakt 25 ~ ² nM. Unter optimalen Bedingungen ist die Ei-Extrakt, der zum Abbau β-Catenin mit einer Geschwindigkeit von 50-100 Nm / h und ist halb-maximal bei 200 nM ^24. Es gibt mehrere wichtige Schritte für eine erfolgreiche Wiederherstellung der β-Catenin-Abbau unter Verwendung von Xenopus-Ei-Extrakt. Dazu gehören 1)...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human chorionic gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium chloride	Fisher	BP366-1
Sodium chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Calcium chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27 G needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express protein labeling mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific
16 °C Incubator	Percival Scientific