Β-katenin Bozulması Of Sulandırma<em&gt; Xenopus</em&gt; Yumurta Özü

Özet

Bir yöntem olup Xenopus yumurta özü ve protein degradasyon küçük molekül modülatörleri için yüksek miktarda madde taraması için uyarlanması radyoaktif olarak etiketlenmiş ve lusiferaz füzyon proteinleri kullanılarak protein degradasyonunu analiz edilmesi için anlatılmıştır.

Özet

Xenopus laevis yumurta ekstresi. Xenopus yumurta özü, hücre döngüsü ve sinyal transdüksiyon yollarının ^1-3 dahil olmak üzere birçok hücresel bağlamlarda protein dönüşümünü incelemek için kullanılmıştır çeşitli hücresel süreçlerin biyokimyasını incelemek için iyi karakterize edilmiş sağlam bir sistemdir. Burada, bir yöntem olup, Wnt yolu kritik bir bileşen, β-katenin degradasyonunu teşvik etmek için optimize edilmiştir Xenopus yumurta özü izole edilmesi için anlatılmıştır. Iki farklı yöntem Xenopus yumurta özü β-katenin protein degradasyonunu değerlendirmek için tarif edilmiştir. Diğer hali hazırda daha yüksek verimlilik deneyleri (ateş böceği lusiferaz etiketli füzyon proteinleri) için ölçekli bir yöntem ise, ^([35 S]-radyo-etiketli proteinleri) görsel olarak bilgilendirici. Açıklanan teknikler β-katenin protein ciro değerlendirmek ve ciro katkıda molekül bileşenleri tanımlamak için kullanılabilir, ancak bunlarla sınırlı değildir. Buna ek olarak, öğrendiğilusiferaz etiketli proteinlerin sayısal ve kolay okuma ile birlikte homojen bir Xenopus yumurta ekstresi geniş hacimli arındırmak için ity bu sistem kolaylıkla β-katenin bozulmasının modülatörler için yüksek miktarda madde taraması için adapte edilmesine olanak sağlamaktadır.

Giriş

Xenopus laevis yumurta özü sitoskeletal dinamikleri, nükleer montaj ve ithalat, apoptoz, ubikuitin metabolizması, hücre döngüsü ilerlemesi, sinyal iletimi, ve protein cirosu ^1-17 dahil olmak üzere birçok hücre biyolojik süreçleri incelemek için yaygın olarak kullanılır olmuştur. Yumurta özü aslında bu süreçleri yürütmek ve soruşturma sağlamak için gerekli tüm temel sitoplazmik bileşenleri içeren sulandırılmamış sitoplazmasını temsil ettiği Ksenopus yumurta özü sistem hücresel süreçlerin bir lejyon biyokimyasal analiz için uygun değildir. Yumurta ekstresi büyük miktarlarda malzeme (örneğin, protein saflaştırma veya yüksek verimli tarama) ^18-20 büyük miktarlarda ihtiyaç biyokimyasal manipülasyonlar için aynı anda hazırlanabilirler. Diğer bir avantajı Xenopus yumurta özü spesifik protein konsantrasyonu tam olarak yeniden birleştirici protein ve / veya imüno-endog eklenmesi ile ayarlanabilir olmasıdırilgilenilen proteinin ekspresyonu kontrol etmek zordur, plazmid DNA transfeksiyonu aksine enous proteinleri. Buna ek olarak, mevcut rekombinant proteinlerin eksikliği eksogen olarak ilave mRNA çevirmek için taze hazırlanmış Xenopus yumurta ekstrakte yüksek kapasiteli yararlanarak, ilgi konusu proteini kodlayan transkriptlerin eklenmesi ile aşılabilir.

Protein degradasyon düzenleme pek çok hücresel yollarının kontrolü için kritiktir ve ^21,. Xenopus yumurta özüt sistem, transkripsiyon ve çevirinin karıştırıcı etki olmadan protein devir izlemek için çok sayıda yollar sağlar gibi protein degradasyonunu incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır işler. Wnt sinyal yolu hastalığı geliştirme ve kritik roller oynayan bir yüksek ölçüde korunmuş bir sinyal yoludur. Β-katenin, Wnt yolu en önemli effektör devir, son derece artan bir kalıcı-hal yarım litre, veβ-katenin evel Wnt hedef genlerin aktivasyonu için kritiktir. Β-katenin bozulması önemi β-katenin bozulmasını engelleyen Wnt yolu mutasyonlar ~ kolorektal kanser ²² tüm sporadik vakaların% 90 olarak bulundu gerçeği ile vurgulanır. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması sadık olarak ciro mekanizması çalışma yanı sıra bozulma ^{2, 19, 20, 23-29} e ait yeni küçük moleküllü modülatörlerini tanımlamak için Xenopus yumurta özü değinmeyecek edilebilir.

Hücre döngüsü incelemek için Xenopus yumurta ekstresinin hazırlanması için yöntemler önceki yayınlarda JoVE ^30-32 'de tarif edilmiştir. Mevcut protokol bu yöntemlerin bir modifikasyonunu açıklar ve bozulması için optimize edilmiştir ^[35 S]-radyo işaretli β-katenin ve lusiferaz etiketli β-katenin inXenopus yumurta özü. Radyo-etiketli bozulma deney otoradyografi ile protein seviyelerinin doğrudan görselleştirme için izin verir. ^[35 S] methionine daha sonra doğrudan bir bozulma reaksiyona ilave edilebilir bir in vitro çeviri reaksiyonu kullanılarak, ilgi konusu proteine ​​dahil edilebilir. Buna ek olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş protein devir tahlili protein istikrarı etkileyebilir ilgilenilen protein veya bir epitop etiketi, karşı bir antikor gerektirmez. Protein düzeylerindeki küçük değişikliklerin bile, radyo-etiketli protein bandının yoğunluğundaki değişiklikler yansıtılan kolaylıkla otoradyografi ile görselleştirilmektedir için, ^[35 S]-radyo işaretli bozunma protein tahlili devir ² görselleştirilmesi için çok yararlı bir yöntemi temsil eder.

Amacıyla, ateşböceği lusiferaz için β-katenin Fusion (bundan sonra sadece "lusiferaz" olarak anılacaktır), protein düzeylerinin kesin ve kolay nicel de elde edilebilirβ-katenin devir ^{19, 20} kinetik özelliklerini belirlemek için. Lusiferaz deneyi önemli bir avantajı kolay bir şekilde ölçeklenir güçlü bir kantitatif sistem sağlamasıdır. Aşağıdaki protokol β-katenin bozulmasını ve yeni β-katenin modülatörlerinin, yüksek miktarda madde taraması için sağlam, etkin ve etkili bir yöntem test etmek için basit bir yöntem sağlamaktadır.

Protokol

Xenopus Yumurta Özü 1. Hazırlanması

NOT: Her kurbağa kullanılabilir yumurta ekstresi, yaklaşık 1 ml verir. 10 kurbağalar ekstreler, tipik olarak bir anda hazırlanır, ve aşağıda tarif tampon hacmi, 10 kurbağa Xenopus yumurta özü hazırlık yapmak için olan edilir. Tampon madde hacmi, yumurta özü daha büyük veya daha küçük preparasyonlar için uygun olarak ayarlanabilir. Bu şekilde üretilen Preps sürekli protein konsantrasyonlarının ≥ 50 mg / ml elde edildi. Iki kişi tarafından gerçekleştirildiği zaman yumurta toplama ve özü içine işleme süreci en verimli. (Temel kurbağa yetiştirme teknikleri için, Sive et al. ^33).

1. Yumurta Toplama
   1. Prime kurbağalar, bir taze yapılmış 250 U / ml stok Hamile Mare Serum Gonadotropin 100 U (PMSG) ile her bir dişi kurbağa enjekte. Ve konik, deri altından enjekte etmek için bir 27 G iğne ile, 3 ml tüberkülin şırınga kullanınYaklaşık 1 cm uzakta kurbağa bacaklarının uzunluğu boyunca çentikli renklenmeler gelen orta hattan bulunduğu dorsal lenf kesesi içine iğne kadar.
   2. Su deposu astarlanmış kurbağa 5-10 gün boyunca 18 ° C 'de (ek 20 mM NaCl, Sive et al. ^33). Su tankı sistemleri ayakta için, hayvan yoğunluk dişi kurbağa başına su yaklaşık 4 L,. NOT: yürürlüğe girmesi emişli için gereken minimum süre 5 gün ve prime etkisi 10 gün sonra eskitmek.
   3. 20x MMR stoktan 0.5x Marc'ın Modifiye Ringers (MMR) çözeltisi hazırlayın. (2-hidroksietil)-1-piperazinetansülfonik asit (HEPES), pH 7.4 - 20x MMR 2 M sodyum klorid, 40 mM potasyum klorid, 40 mM kalsiyum klorid, 20 mM magnezyum klorür ve 100 mM 4 oluşur.
   4. Tüm enjekte kurbağalar (4 L kova başına bir kurbağa) kepçeler ayarlayın. NOT: Birden fazla kurbağa, yumurta toplanması için aynı kova yerleştirilebilir rağmen eğer kurbağa biriağırlıklı olarak kalitesiz yumurta bırakır, çaba önemli bir miktarda ekstresi yapmak için uygun olanlardan kalitesiz yumurtaları ayırmak için gerekli olacaktır. Böylece, yumurta için kullanılan tampon miktarını en aza indirmek için aynı tankta kurbağa sayısını toplamak maksimize risk almaya değmez.
   5. 1.1.1 de açıklandığı gibi, 27 G iğne kullanılarak her bir kurbağa dorsal lenf kesesi içine 750 U İnsan koryonik gonadotropin (HCG) enjekte edilir.
   6. 0.5x MMR içeren tek 4 L kova içine HCG enjekte kurbağaların her Sıra 16 ° C'ye soğutuldu
   7. O / N (15-16 saat) yumurta toplamak için bir 16 ° C inkübatör kurbağa ile kapları yerleştirin. Not: uygun sıcaklık bakımı yumurta ekstrenin hazırlanması için yumurta toplama gelen, bütün prosedür için çok önemlidir.
2. Yumurta Dejellying
   NOT: Yumurta öncesi özü yapmak için kaldırılması gereken bir jöle tabakası ile kaplıdır. Yumurta kendiliğinden lizis olasılığı zaman betwee artarn yumurtlama ve hazırlık artar ayıklayın. Bu nedenle, mümkün olduğunca hızla aşağıdaki adımlarda devam etmek önemlidir.
   1. 1x MMR 4 L, 0.1x MMR 50 ml ve damıtılmış su içerisinde yapılan% 2 sistein, pH 7.7, 400 ml hazırlayın. 16 ° C'de tüm çözümler koruyun
   2. Ek yumurta çıkarmak için yavaşça kurbağa alt sırt ve karın sıkın.
   3. , Kurbağa ve MMR toplu çıkarın her kova MMR yaklaşık 1-200 ml yumurta bırakmak.
   4. Bir transfer pipet ile enkaz kaldırma ve yumurta kalitesini değerlendirmek: Yüksek kaliteli yumurta genellikle koyu pigmentli hayvan yarımkürede ve hafif renkli bitkisel yarımkürede arasında net bir ayrım tarafından işaretlenir ve en koyu-to-ışık kontrast vardır. Bir transfer pipet atmak onlar ekstraktının genel kalitesini azalacak gibi (beyaz ve kabarık), lifli benekli veya lize görünür herhangi bir yumurta. Yumurtaların>% 10 kalitesiz ise, tümToplu atılmalıdır.
   5. 500 ml'lik bir cam kabın içine yumurta birleştirin ve su altı yumurta tutarken mümkün olduğunca MMR dökmek.
   6. MMR iki yumurta hacmi ile nazik dönme tarafından yumurta durulayın. Iki kez tekrarlayın, ve herhangi bir enkaz veya açıkça kalitesiz yumurta kaldırmak.
   7. , Cam behere 2% sisteinin yaklaşık 100 ml ilave edilir karıştırmak için yavaşça girdap ve yumurta 16 ° C'de 5 dakika boyunca yerleşmek için izin Sistein dökün. NOT: onlar şimdi jöle kat olmadan daha küçük bir hacim işgal olarak Dejellying yumurta ve yumurta daha kompakt ambalaj üzerinde yüzen jöle kat kademeli görünümünü tarafından işaretlenir.
   8. ,% 2 sisteinin diğer bir 100 ml ilave edilir yavaşça girdap, 5 dakika bekleyin ve daha sonra yavaş yavaş sistein dökün. Yumurta (genellikle üçüncü sistein tedavisi ile) sıkıca sıkıştırılmış haline gelmiştir kadar tekrarlayın. Not: yumurta sistein çok uzun süre kalan, bunlar lize yatkındır. Benzer şekilde, dejellied yumurta kırılgan ve mekanik liziz eğilimli eğerOnlar havaya maruz eğer çok güçlü bir şekilde kıvrıldı veya edilir. Yumurta dejellied edilmiş, hızlı bir şekilde santrifüj adımları devam etmek için önemlidir.
   9. Sistein dökün ve hafifçe 1x MMR yumurta yıkayarak jöle ceket ve diğer enkaz uzaklıkta yıkayın. Beherin tarafı boyunca dikkatli bir şekilde tampon dökün. Iki kez tekrarlayın veya MMR çözüm kadar bulutlu artık. 1x MMR ile durulama sırasında bir transfer pipet kullanarak kötü yumurta kaldırmak için devam ediyor.
   10. 30 ml 0.1x MMR ile bir nihai nazik durulama gerçekleştirmek ve yavaşça mümkün olduğu kadar tampon kadar kapalı dökün. Yine, herhangi bir tabii ki kötü yumurta kaldırmak.
3. Santrifüj ile Yumurta Paketleme ve Kırma
   Not: Bu, aşağıda tarif Ekstre β-katenin bozulması için kullanılan sitostatik faktör ekstraktı (metafaz II-tutuklandı) bir çeşididir. Hücre döngüsü çalışmaları için kullanılan düşük hızda ve yüksek hızlı ekstresi aksine, orta hızlı ekstresi β-katenin indirgenmesi için en iyi şekilde çalışır. Benhazırlamak için yoğun emek daha olmasına rağmen nterphase özü benzer sağlam β-katenin bozulmasını teşvik etmektedir.
   1. 10 mg / ml stok solüsyonundan seyreltilmiştir 20 ug / ml (at ve Cytochalasin D (a DMSO içerisinde 10 mg / ml stok çözeltisinden seyreltilmiş) 10 ug / ml 'de Leupeptin, Pepstatin, Aprotinin karışımı (LPA, bir proteaz inhibitörü) ekleme 0.1x MMR kalan 20 ml), DMSO.
   2. 0 ekleyin. X MMR yıkandı, yumurta ve LPA Cytochalasin D ihtiva eden, yavaşça girdap ve 16 ° C sıcaklıkta 5 dakika boyunca inkübe
   3. , 16 ° C önceden soğutulmuş 50 ml santrifüj tüplerine yumurta transferi yumurta yerleşmek için izin ve üst kalıntı tamponu çıkarın. , Havaya maruz kalmayı önlemek önce transferini yumurta çekilmesi için aktarma pipet içine tampon küçük bir miktar geri çekmek için. Yumurta üstüne santrifüj tüpü doldurmak kadar verimini maksimize edecek olan, santrifüj tüplerine ilave yumurta transferi ve tüpün üstünden kalan tampon kaldırmak için devamayıklayın.
   4. Bir sabit açılı rotor kullanılarak 4 ° C'de 60 saniye boyunca 400 xg'de yumurta, spin santrifüj tüpleri paketi için. Santrifüj tüplerine üstünden kalıntı tamponunu çıkarın.
   5. Ezme bir dönüş için, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 15,000 xg'de tüpler dönmeye
4. Özü Sitoplazmik Katmanı Toplama
   Not: Aşağıda tarif edilen yöntem olup, sitoplazmik tabaka toplamak için, santrifüj tüpünün yan delme klasik yöntem farklıdır. Bu protokol, basitleştirme ve yeniden kullanılabilir, özellikle santrifüj tüpleri, kullanım için adapte edilmiştir. Β-katenin degradasyon kinetiği hiçbir gözle görülür bir fark yöntemi ile ya da bulunur. Bu noktada özü de süreç boyunca sırasında soğuk tutulmalıdır ve tüm adımlar 4 ° C'de gerçekleştirilmelidir
   1. P1000 pipet kullanarak lipit tabakasında bir delik temizleyin.
   2. Koyu renkli bir tabaka ile li arasında sitoplazmik tabakasının (toplamaktemiz önceden soğutulmuş santrifüj tüplerine yeni P1000 pipet kullanarak GHT lipit tabakası) (Şekil 1). Sağlam β-katenin bozan, yüksek kaliteli özü için, sitoplazmik tabaka ile çekilir pigmentli ve lipid tabakasının miktarını en aza indirir.
   3. Spin 4 ° C'de 10 dakika boyunca 15,000 xg'de sitoplazmik tabaka tekrar ekstre edildi ve sitoplazmik faz toplanır. Spin ve çıkarma 1X tekrarlayın. NOT: özü "saman renkli." Olmalıdır Önemli bir kirlenme bu noktada pigmentli ve lipid tabakaları ile varsa fazla döndürme β-katenin indirgeme özü kapasitesini azaltmak rağmen, bir, spin bir kez daha tekrarlayın.
   4. 10 ug / ml her bir nihai konsantrasyonlarda ekstreye LPA ve Cytochalasin D ekleyin. Not: tanımlanan yöntemi kullanarak, bir yaklaşık olarak 50 mg / ml 'lik oldukça tutarlı bir toplam protein konsantrasyonunu (52.41 ± 5.40 mg / ml, n = 3 ayrı preparatlarıyla) Xenopus verir, örneğing özler.
   5. (İsteğe bağlı) çeviri tahlilleri için, kapaklı mRNA (0.1 mg / ml) ekleyin, RNAsin (1.5 U / ml), ve enerji yenilenmesi karışımı (2.2.1) ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, reaksiyonu inkübe (Daha fazla bilgi için bkz: Salisli diğ ark. ² ve Sive et al. ^33). Β-katenin bozulması deneyleri ya da daha sonra kullanmak için sıvı azot içinde ek dondurulmasını yerelleştirilmiş özü kullanın. NOT: Taze hazırlanmış özü egzojenik eklendi mRNA çevirmek için yüksek kapasiteye sahip, ama özü donmuş bir kez, ne yazık ki, bu kapasite kaybolur. Kapaklı mRNA hali hazırda ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak hazırlanabilir.
   6. Sıvı nitrojen içinde dondurularak özü ek bileşen. Not: hızla refrozen ise β-katenin indirgeme kapasitelerini kaybeder çünkü özleri, tek kullanım için küçük (200 ul) alikotlar içinde muhafaza edilirler. Uzun süreli depolama için, özü sıvı azot içinde saklanabilir. Kısa süreli depolama için, özü, -80 ° C'de saklanabilir rağmen kapasite oβ-katenin indirgeme f çıkarmak önemli ölçüde -80 ° C (2 aydan daha uzun) da uzatılmış depolama ile azaltılabilir.

2.. Β-katenin Parçalanma Testi için ekstresinin hazırlanması

1. Xenopus Özü Tükenme
   Not: Xenopus özü önemli bir avantajı, kolay bir şekilde bir yolunun bileşenlerini tüketmek ve tam da doza bağlı etkileri belirlemek amacıyla bir proteinin belirli bir miktar geri ekleme kapasitesidir.
   1. Taze hazırlanmış Xenopus yumurta özü kullanın ya da hızlı buz üzerinde donmuş özü ve yer eritin. Soğuk tüm manipülasyonlar gerçekleştirin.
   2. Topak haline antikor veya afinite taneleri (örneğin, 200 mi, 20 ml ekstresine topak boncuk) hacminin 1/10 ile özü ekleyin. , Ekstrenin seyreltme en aza indirmek uzun, konik uçları olan jel yükleme ipuçları ile özü eklenerek önce mümkün olduğu tanelerden kadar sıvıyı çekmek için.
   3. Döndür özü-1 saat boyunca 4 ° C 'de boncuk karışımı.
   4. 30 saniye için 4 ° C'de 12,600 x g'de mikrofüj içinde Spin özü boncuk karışımı. Alternatif olarak, manyetik boncuklar kullanıldığında, boncuk toplamak için manyetik bir alan uygulanır.
   5. Aktarım buz üzerinde yeni bir mikrofüj tüpüne özü tükenmiş. Özü ile herhangi bir boncuk aktarmak için dikkatli olun.
   6. Tükenmiş özü ve boncuklar hem imünolekelemeyle tükenmesi verimliliğini onaylayın.
   7. 2.2 'de tarif edildiği gibi β-katenin indirgeme deneyi için özü hazırlayın.
2. Xenopus β-katenin Bozulması Özü optimize
   Not: Xenopus yumurta özü β-katenin bozunma hızlı bir endojen ATP depolarını azaltan bir enerji-bağımlı bir süreçtir. Sonuç olarak, bir enerji dönüşüm sistemi güçlü bir β-katenin bozulmasını sağlamak için gereklidir.
   1. 150 mM kreatin fosfat aşağıdakilerden oluşan bir 20x enerjisi geri kazanımı (ER) karışım hazırlayın, 20 mM ATP, 600 mg / mL kreatin fosfokinaz,ve 20 mM _MgCl2. ER -80 ° C'de numune alınır ve saklanmalıdır Küçük dondurulmuş alikotları kullanılarak tekrarlanan donma / çözülme döngüsü kaçının.
   2. Hızla elleri arasında donmuş tüp sürtünme tarafından Ksenopus yumurta özü eritin. Ekstrenin her eridikten hemen önce buz üzerinde tüp yerleştirin.
   3. Xenopus yumurta ekstresinin bir kısım (200 ul) içine enerji yenilenmesi karışımı (20x ER) 10 ul ekle. Hızlı boru ve darbe vorteks hafifçe vurarak iyice karıştırın. -Spin Darbe ve hemen buz üzerine yerleştirin.
   4. (Isteğe bağlı) β-katenin devir hafifçe ubikitin (1.25 mg / ml nihai) ilavesi ile Xenopus yumurta özü geliştirilebilir. Sikloheksimid (nihai 0.1 mg / ml), aynı zamanda, endojen transkriptlerinin çevrilmesinin en aza indirmek için ilave edilebilir.
   5. Buzda önceden soğutulmuş mikrofüj tüplerine bozulması tahlili için, uygun hacimleri kısım. Radyo-etiketli β-katenin bozulması deneyleri için, 2-5 ml her bir zaman noktası için geri çıkarmak. '/ Li>

Xenopus yumurta özü 3. Radyo-β-katenin indirgeme deneyi

NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm aşamaları, buz üzerinde gerçekleştirilmelidir.

1. Radyo-β-katenin hazırlanması
   1. Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak in vitro olarak sentezlenmiş ^[35 S] methionine-radyo işaretli protein taze hazırlayın. Not: Yaratma ³⁵ (87 gün yarı-ömür) S-etiketli proteinler, kolay ve etkili bir şekilde ticari olarak temin edilebilir, in vitro transkripsiyon çiftli-çeviri kitleri kullanılarak üretilmektedir. Bu çevrilen protein yeterince protein devir değişiklikler kolaylıkla görselleştirilebilir şekilde işaretlenmiş olması önemlidir.
   2. Başarılı radyolabelinge doğrulamak için, çevrilmiş proteinin 0.5 ul SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. ImageJ, ImageQuant, ya da alternatif bir kantitatif bir yazılım progr kullanılarak radyo-etiketlenmiş β-katenin bant yoğunluğunu ölçmekduyuyorum. NOT: radyoetiketlenmiş β-katenin protein bandı birkaç saat (4-6 saat) içinde filmde açıkça görülebilir olmalıdır.
   3. Depolama için sıvı azot içinde radyo etiketli protein Gizlenebilir dondurularak kullanılana kadar. Not: Uzun süreli depolama (> 2 ay) ve birden fazla donma / çözülme (2 'den daha büyük) ciddi bir şekilde Xenopus yumurta özü sağlam indirgeme radyo-etiketli β-katenin kapasitesini etkileyebilir. Tipik olarak, radyoaktif olarak işaretlenmiş proteinlerin stabilitesi -80 ° C 'de depolama 1 ay sonra önemli ölçüde azalır; Bu şekilde nispeten taze hazırlanmış radyo-etiketli β-katenin, bu bozulma deneylerde iyi sonuçları verir.
2. Β-katenin Parçalanma Testi gerçekleştirmek
   1. In vitro dönüştürülmemiş β-katenin 1-3 ul (radyo-etiketli bant sinyalinin gücüne bağlı olarak) ilave (ve diğer proteinler, test edilmektedir gibi küçük moleküller) buz üzerinde Xenopus Reaksiyon karışımı 20 ul halinde. Quickl ile iyice karıştırıntüp ve vorteks kısa bir darbe flicking y; Xenopus yumurta özü çok viskoz olduğu gibi bu önemli bir adımdır, ve eksik karıştırma sonuçlarının tutarlılığını etkileyecektir. Buz üzerinde nabız spin ve yer.
   2. Oda sıcaklığına kadar tüpler kaydırarak β-katenin bozunma reaksiyonunu başlatın.
   3. Belirlenmiş bir zaman noktasında, numunenin 1-5 ml çıkarın ve reaksiyonu durdurmak için SDS numune tamponu (5x hacim) ile hemen karıştırın. Emin olmak için bozunma reaksiyon tamamen şiddetle fiske tüpü, birkaç kez ve vorteks sonlandırılır.
   4. SDS-PAGE/autoradiography gerçekleştirin. Her bir zaman noktası / şerit için ekstraktı 1 mL eşdeğer (~ 50 mg protein) çalıştırın. Xenopus yumurta özü β-katenin bozulması radyo-etiketli β-katenin bant Şekil 2'nin yoğunluğu zamana bağımlı olarak azalmasına bağlı olmalıdır. ImageJ, ImageQuant veya diğer tercih edilen görüntüleme yazılımı gerektiğinde kullanarak sonuçları ölçmek.
   5. (Optimumonal) arka plandaki radyoaktivitenin azaltmak ve görüntü kalitesini arttırmak için kurutmadan önce damıtılmış su) çözeltisi içinde (% 10 asetik asit ve% 30 metanol sabitleme SDS-poliakrilamid jeli bekletin.

Xenopus Yumurta Özü 4. Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Deneyi

Aksi belirtilmedikçe, buz üzerinde tüm adımları uygulayın.

1. Β-katenin-lusiferaz hazırlanması
   1. Tam bir amino asit karışımı ile transkripsiyon-çevirme bağlanmış sistemi kullanılarak radyo-etiketlenmemiş, lusiferaz etiketli-β-katenin sentezlenmesi.
   2. Reaksiyonun 0.5-1 ul lusiferaz aktivitesi ölçülerek lusiferaz etiketli β-katenin üretimini teyit edin. Çevrilmemiş Reaksiyon karışımı ışıltı ölçülerek arka plan aydınlığı değerlendirin. NOT: Birden çok kit lusiferaz aktivitesinin ölçülmesi için kullanılabilir. Uzun ömürlü parlaklık Bununla birlikte, bozunma assa için özellikle iyi çalışıry.
2. Β-katenin-lusiferaz Parçalanma Testi gerçekleştirmek
   1. Çözülme ve 2.2 olarak Ksenopus yumurta özü hazırlamak.
   2. Buz üzerinde (2,2) hazırlanan Ksenopus reaksiyon karışımı içine in-vitro tercüme β-katenin-lusiferaz füzyon (4.1 dan itibaren) ekleyin ve 3.2.1 olarak iyice karıştırın. Not: ekstresine ilave edilir β-katenin lusiferaz aktivitesi, tipik olarak 20'dir - 50000, göreli ışık birimi (4.1.2 elde edilen ölçümlerine göre) ekstresinin (RLU) / ml. Başlangıç ​​sinyali yaklaşık olarak 100.000 RLU (in vitro çevrilmiştir-β-katenin-lusiferaz füzyon 2-5 ml) az olmalıdır.
   3. Oda sıcaklığına özü Shift bozunma reaksiyonunu başlatın.
   4. Belirtildiğinde, reaksiyonun bir kısım çıkarın ve ek sıvı azot içinde dondurulması. Not: Üç kopya numuneler tipik olarak, her bir zaman noktası için analiz için kaldırılır. Dondurulmuş özü -80 ° C'de saklanabilir until bunlar analiz edilecek hazırız.
   5. Çözülme örnekleri buz, buz üzerinde standart beyaz 96 oyuklu plakalara aktarımı örnekleri, ve lusiferaz aktivitesi için işlem.

Sonuçlar

Xenopus yumurta özü β-katenin bozulmasının bir şematik Şekil 2A'da gösterilmiştir. ³⁵ S-etiketli β-katenin Xenopus yumurta özü inkübe edildi, alikotlar (1 mi eşdeğer özü) uygun zamanlarda çıkarıldı ve numuneler tabi tutuldu SDS-PAGE ve ardından otoradyografi. Wnt yolağının bileşenleri ile β-katenin bozulması, ubikitin-proteazom sistemi ² tarafından aracılık edilir ve Xenopus özü ^[35 S]-radyo işaretli β-kat...

Tartışmalar

Xenopus yumurta özü β-katenin ciro araştırmak için sağlam bir biyokimyasal sistemidir. Xenopus yumurta özü β-katenin konsantrasyonu ~ 25 nM ^2'dir. Uygun koşullar altında, yumurta özü 50-100 nM / st 'lik bir oranda β-katenin parçalama yeteneğine sahip olan ve 200 ^{nM, 24} yarı-maksimumdur. Xenopus yumurta özü kullanılarak β-katenin bozulması başarılı sulandırma için birkaç önemli adım vardır. Bu yüksek kaliteli Xenopus yumurt...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human chorionic gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium chloride	Fisher	BP366-1
Sodium chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Calcium chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27 G needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express protein labeling mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific
16 °C Incubator	Percival Scientific