JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Erratum Notice
  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Erratum
  • Reprints and Permissions

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Summary

שיטה מתוארת לניתוח פירוק חלבונים באמצעות רדיואקטיבי וחלבונים לוציפראז-Fusion בתמצית ביצי Xenopus והתאמת להקרנת תפוקה גבוהה למאפנני מולקולה קטנים של פירוק חלבונים.

Abstract

תמצית ביצת laevis Xenopus היא מערכת מאופיינת היטב, חזקה ללימוד הביוכימיה של תהליכים תאיים שונים. תמצית ביצי Xenopus נעשתה שימוש כדי ללמוד מחזור חלבון בהקשרים רבים תאיים, כולל את מחזור התא ומסלולים הולכים אותות 1-3. בזאת, שיטה מתוארת לבידוד תמצית ביצי Xenopus שעבר אופטימיזציה כדי לקדם את ההשפלה של המרכיב הקריטי Wnt המסלול, β-catenin. שתי שיטות שונות מתוארות להעריך פירוק חלבוני β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. שיטה אחת היא מבחינה ויזואלית אינפורמטיבי ([S 35]-radiolabeled חלבונים), ואילו השני הוא לשנותם בקלות רבה יותר למבחני תפוקה גבוהה (גחלילית חלבוני היתוך מתויג לוציפראז). הטכניקות המתוארות יכולות לשמש, אך אינם מוגבלות, להערכת מחזור חלבון β-catenin ולזהות רכיבים מולקולריים תרמו למחזור שלה. בנוסף, ability לטהר כמויות גדולות של תמצית ביצים הומוגנית Xenopus בשילוב עם קריאת הנתונים הכמותיים וקלילות של חלבונים מתויגים לוציפראז מאפשר מערכת זו כדי להתאים בקלות להקרנת תפוקה גבוהה למאפננים של השפלה β-catenin.

Introduction

תמצית ביצת laevis Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב כדי ללמוד תהליכים בתא ביולוגיים רבים כולל דינמיקת cytoskeletal, הרכבה ויבוא גרעיניים, אפופטוזיס, חילוף חומרים של היוביקוויטין, התקדמות מחזור התא, העברת אותות, ומחזור חלבון 1-17. מערכת תמצית ביצי Xenopus ניתן לניתוח ביוכימי של לגיון של תהליכים תאיים, כי תמצית ביצה מייצגת בעצם ציטופלסמה חי המכילה את כל המרכיבים החיוניים cytoplasmic דרוש לביצוע תהליכים אלו ולאפשר חקירה. ניתן להכין כמויות גדולות של תמצית ביצים בפעם אחת למניפולציות ביוכימיות הדורשות כמויות גדולות של חומר (למשל, טיהור חלבון או הקרנת תפוקה גבוהה) 18-20. יתרון נוסף הוא שהריכוז של חלבונים ספציפיים בתמצית ביצי Xenopus יכול להיות מותאם בדיוק על ידי תוספת של חלבון ו / או immunodepletion של endog רקומביננטיחלבונים בוגדניים בניגוד לtransfection של DNA פלסמיד שבו ביטוי של החלבון של עניין הוא קשה לשליטה. בנוסף, המחסור בחלבונים רקומביננטיים זמינים ניתן להתגבר על ידי התוספת של תמלילים המקודדים את החלבון של עניין, תוך ניצול של הקיבולת הגבוהה של תמצית ביצי Xenopus מוכנה הטרי לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני.

הרגולציה של פירוק חלבונים היא קריטית לשליטה רבים מסלולי הסלולר ומעבדת 21. תמצית ביצי Xenopus כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד פירוק חלבונים, שכן המערכת מאפשרת מספר דרכים לעקוב אחר מחזור חלבון ללא השפעות מבלבלות של שעתוק ותרגום. מסלול איתות Wnt הוא מסלול איתות שמור ביותר שמשחק תפקידים קריטיים בהתפתחות ומחלה. מחזור של β-catenin, מפעיל העיקרי של מסלול Wnt, מוסדר מאוד, ואני במצב יציב מוגבראיבל של β-catenin הוא קריטי להפעלה של גנים מטרת Wnt. החשיבות של השפלה β-catenin מודגשת על ידי העובדה שמוטציות במסלול Wnt המעכבות השפלה β-catenin מצאו ב~ 90% מכל מקרים ספורדיים של סרטן מעי גס 22. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt יכולה להיות סכמה בנאמנות בתמצית ביצי Xenopus ללמוד את המנגנון של המחזור שלה, כמו גם לזהות מאפנני מולקולה קטנים רומן של השפלה שלה 2, 19, 20, 23-29.

שיטות להכנה של תמצית ביצי Xenopus לחקר מחזור התא תוארו בפרסומי יופיטר הקודמים 30-32. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שינוי של שיטות אלה, והוא מותאם לשפלה של [35 S]-radiolabeled β-catenin ומתויג לוציפראז β-catenin בתמצית ביצי Xenopus. Assay השפלה radiolabeled מאפשר הדמיה ישירה של רמות חלבון באמצעות autoradiography. מתיונין [35 S] הוא שולב החלבון של עניין באמצעות תגובה בתרגום חוץ גופית שלאחר מכן ניתן להוסיף ישירות לתגובת השפלה. בנוסף, assay מחזור חלבון radiolabeled אינו דורש נוגדן נגד החלבון של עניין או תג אפיטופ, שיכול להשפיע על יציבות חלבון. כי אפילו שינויים קטנים ברמות חלבון, כפי שבאו לידי ביטוי בשינויים בעוצמתה של להקת חלבון רדיואקטיבי, הם דמיינו בקלות על ידי autoradiography, [S 35]-radiolabeled assay השפלה מייצג שיטה שימושית מאוד להדמיה של חלבון מחזור 2.

שילוב של β-catenin לגחלילית בלוציפראז (להלן בפשטות "לוציפראז") מאפשר למדידות כמותיות מדויקות וקלילות של רמות חלבון, כדיכדי לקבוע את מאפייני הקינטית של מחזור β-catenin 19, 20. יתרון עיקרי של assay בלוציפראז הוא שהיא מספקת מערכת כמותיים חזקה הלשנותם בקלות. הפרוטוקול הבא מספק שיטות פשוטות למנסה לאמוד השפלה β-catenin ושיטה חזקה, יעילה ואפקטיבית להקרנת תפוקה גבוהה של מאפנני β-catenin רומן.

Protocol

1. הכנת תמצית ביצי Xenopus

הערה: כל צפרדע בתשואה של כ 1 מיליליטר של תמצית ביצים שמישה. תמציות מ10 צפרדעים מוכנות בדרך כלל בזמן זה, והנפח של החיץ המתואר להלן הוא לביצוע הכנת תמצית ביצת 10 צפרדע Xenopus. חיץ הנפח יכול להיות מותאם בהתאם לגדולות יותר או קטנות יותר בהכנות של תמצית ביצים. Preps שנוצר באופן זה יניב בעקביות ריכוזי חלבון ≥ 50 מ"ג / מיליליטר. התהליך של איסוף ביצים ועיבודם לתמצית הוא יעיל ביותר בעת שנערך על ידי שני אנשים. (לטכניקות גידול בעלי צפרדע בסיסיות, ראה סייב et al. 33).

  1. אוסף ביצה
    1. לראש הצפרדעים, להזריק כל נקבת צפרדע עם של הריון Mare סרום גונדוטרופין 100 U (PMSG) ממניות U / ml טרי 250. השתמש במזרק טוברקולין 3 מיליליטר עם מחט G 27 להזריק מתחת לעור, עם השיפוע שלאת המחט, לתוך שק הלימפה הגבי, הנמצא כ 1 סנטימטר מקו האמצע מכתמי מחורצים לאורכו של הרגליים של הצפרדע.
    2. צפרדעי חנות דרוכה במים (בתוספת 20 mM NaCl, ראו סייב et al. 33) ב18 מעלות צלזיוס למשך 5-10 ימים. לעומד מערכות מיכל מים, צפיפות בעלי החיים היא כ -4 ליטר מים לצפרדע ממין נקבה. הערה: הזמן המינימאלי הנדרש לתחולו ייכנס לתוקף הוא 5 ימים, ואת ההשפעות של הטרמה להתפוגג לאחר 10 ימים.
    3. הכן פתרון האצבעות (MMR) ממניות MMR 20x השתנה של 0.5x מארק. 20x MMR מורכב מ2 M נתרן כלורי, אשלגן כלורי 40 מ"מ, סידן כלורי 40 מ"מ, מגנזיום כלוריד 20 מ"מ, ו100 4 מ"מ - (2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), pH 7.4.
    4. הגדר את הדליים לכל צפרדעים מוזרקות (צפרדע אחת לכל 4 דלי L). הערה: למרות שצפרדע יותר מאחד יכולה להיות ממוקמת באותו הדלי לאיסוף ביצים, אם אחד מהצפרדעיםמטיל ביצים באיכות ירודה בעיקר, כמות ניכרת של מאמץ תידרש להפריד את הביצים באיכות ירודה מאלה המתאימים להכנת תמצית. לפיכך, למקסם את מספר הצפרדעים באותו הטנק כדי למזער את הכמות של חיץ המשמשת לביצה לאסוף הוא לא שווה את הסיכון.
    5. הזרק 750 U גונדוטרופין כוריוני האנושי (HCG) לתוך שק הלימפה הגבי של כל צפרדע באמצעות מחט 27 G כפי שמתואר ב1.1.1.
    6. מניחים כל אחד מהצפרדעים הזריק HCG לסלים 4 L בודדים המכילים MMR 0.5x מקורר 16 ° C.
    7. מניחים את המכולות עם הצפרדעים בחממה 16 ° C כדי לאסוף ביצי O / N (15-16 hr). הערה: שמירה על הטמפרטורה הנכונה היא קריטית עבור ההליך כולו, מאיסוף ביצים להכנת תמצית ביצה.
  2. Dejellying ביצים
    הערה: ביצים מכוסות במעיל ריבה שיש להסירו לפני קבלת תמצית. הסבירות של תמוגה הספונטנית של הביצים גדלה ככל שהזמן betweeביצת n הנחת ולחלץ עליות הכנה. לכן, חשוב להמשיך את השלבים הבאים במהירות אפשרית.
    1. הכן 4 L של 1x MMR, 50 מיליליטר של 0.1x MMR, ו400 מיליליטר של ציסטאין 2%, pH 7.7, שנעשה במים מזוקקים. לשמור את כל הפתרונות ב16 ° C.
    2. לגרש ביצים נוספות, ללחוץ בעדינות בגב התחתון והבטן של הצפרדע.
    3. הסר את הצפרדעים ואת חלק הארי של MMR, לעזוב את הביצים בכ 1-200 מיליליטר של MMR בכל אחד מהסלים.
    4. להסיר שאריות עם טפטפת העברה, ולהעריך את איכות הביצים: ביצים באיכות גבוהה בדרך כלל מתאפיינות בהפרדה ברורה בין האונה החיה הכהה פיגמנט וחצי הכדור הצמחי בצבע בקלילות ויש החושך לאור הניגוד הגבוה ביותר. בטל עם טפטפת העברה כל ביצים המופיעות סיבי, מנומר, או lysed (לבן ונפוח) כפי שהם יקטינו את האיכות הכוללת של התמצית. אם> 10% מהביצים הם באיכות ירודה, כלאצווה צריך להיות מושלך.
    5. מערבבים את הביצים לתוך כוס זכוכית 500 מיליליטר ולשפוך את כמה שיותר MMR ככל האפשר, תוך שמירה על ביצים מתחת למים.
    6. יש לשטוף את ביצים על ידי מתערבל עדין עם פעמיים ביצת הנפח של MMR. חזור על הפעולה פעמיים, ולהסיר את כל פסולת או ביצים באיכות ירודה ללא ספק.
    7. להוסיף כ 100 מיליליטר של ציסטאין 2% לכוס הזכוכית, לערבל בעדינות לתערובת, ולאפשר ביצים להתפשר על 5 דקות ב16 ° C. יוצקים את ציסטאין. הערה: Dejellying מתאפיין בהופעה ההדרגתית של שכבות ריבה צפות מעל הביצים והאריזה קומפקטית יותר של הביצים כפי שהם עכשיו תופסים נפח קטן יותר ללא מעיל הג'לי.
    8. הוספה של ציסטאין 2% עוד 100 מיליליטר, בעדינות מערבולת, חכה 5 דקות, ואז לשפוך לאט ציסטאין. חזור על פעולה עד ביצים הפכו בחוזקה דחוסה (בדרך כלל על ידי טיפול ציסטאין השלישי). הערה: אם ביצים נשארות יותר מדי זמן בציסטאין, הם נוטים תמוגה. בדומה לכך, ביצי dejellied שבירות ונוטה תמוגה מכאנית אם הםהם הסתחררו נמרצים מדי, או אם הם נחשפים לאוויר. ברגע שהביצים כבר dejellied, חשוב להמשיך במהירות לשלבי צנטריפוגה.
    9. יוצקים את ציסטאין, ולשטוף משם את מעיל הריבה ופסולת אחרת בעדינות על ידי שטיפת ביצים ב1x MMR. יוצקים את החיץ בזהירות בצד של הכוס. חזור פעמיים או עד פתרון MMR הוא כבר לא מעונן. בעוד שטיפה עם 1x MMR תמשיך להסיר את הביצים הרעות באמצעות פיפטה העברה.
    10. לבצע שטיפה עדינה סופית עם 30 MMR 0.1x מיליליטר, ובעדינות לשפוך את כמה שיותר החיץ ככל האפשר. שוב, להסיר כל ביצים כמובן רעות.
  3. אריזה וריסוק ביצים על ידי צנטריפוגה
    הערה: התמצית המתוארת להלן המשמשת לפירוק β-catenin הינה נגזרת של תמצית cytostatic הגורם (metaphase II-נעצר). בניגוד לתמצית במהירות נמוכה ומהירות גבוהה המשמשת למחקרי מחזור התא, תמצית מהירות ביניים עובדת הכי טוב בשביל השפלה β-catenin. אניתמצית nterphase דומה מקדמת השפלה β-catenin חזקה אף יותר עבודה אינטנסיבית להכנה.
    1. הוספת leupeptin, Pepstatin, תערובת Aprotinin (LPA, מעכבי פרוטאז) ב10 מיקרוגרם / מיליליטר (בדילול מלא מ10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות בDMSO) וCytochalasin D ב20 מיקרוגרם / מיליליטר (בדילול מלא מ10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות DMSO) ל20 מיליליטר הנותר של 0.1x MMR.
    2. הוסף 0. X MMR המכילה LPA וCytochalasin ד 'לביצים השטופות, מערבולת בעדינות, ודגירה במשך 5 דקות ב16 ° C.
    3. העבר את הביצים לתוך 16 ° 50 צינורות צנטריפוגה מיליליטר טרום צוננים C, לאפשר את הביצים להתיישב, ולהסיר את החיץ שיורית מלמעלה. כדי למנוע חשיפה לאוויר, למשוך כמות קטנה של חיץ לתוך פיפטה ההעברה לפני נסיגת ביצים להעברה. תמשיך להעביר את ביצים נוספות לתוך צינורות צנטריפוגה ולהסיר חיץ שיורית מהחלק העליון של הצינור עד הביצים למלא את צינור צנטריפוגות לעליונה, אשר יהיה למקסם את התשואה שללחלץ.
    4. לארוז את הביצים, מבחנות צנטריפוגה ספין על XG 400 ל60 שניות על 4 מעלות צלזיוס באמצעות הרוטור זווית קבוע. הסרת חיץ שיורית מהחלק העליון של צינורות צנטריפוגה.
    5. לספין הריסוק, ספין צינורות ב 15,000 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C.
  4. איסוף שכבת cytoplasmic של חלץ
    הערה: השיטה המתוארת להלן שונה מהשיטה הקלאסית של ניקוב הצד השני של צינור צנטריפוגות על מנת לגבות את שכבת cytoplasmic. פרוטוקול זה הותאם לפישוט ולשימוש עם צינורות צנטריפוגה מסוימים, שהם לשימוש חוזר. אין הבדלים בולטים בקינטיקה של השפלה β-catenin נמצאים עם אחת משיטות. בתמצית את הנקודה הזו צריכה להיות כל הזמן קר במהלך כל התהליך, ויש לבצע את כל השלבים ב 4 ° C.
    1. נקה חור בשכבת השומנים באמצעות קצה פיפטה P1000.
    2. לאסוף את שכבת cytoplasmic (בין שכבת פיגמנט הכהה וliשכבת ght שומנים בדם) באמצעות קצה פיפטה P1000 חדש לתוך צינורות צנטריפוגה טרום צוננים נקיים (איור 1). לתמצית איכות גבוהה וחסונה שמדרדרת β-catenin, לצמצם את כמות שכבת פיגמנט ושומנים בדם, כי הוא נסוג עם שכבת cytoplasmic.
    3. ספין שחולץ שכבת cytoplasmic ב15,000 XG 10 דקות ב 4 ° C ושוב לאסוף את שכבת cytoplasmic. חזור על הספין והחילוץ 1X. הערה: התמצית צריכה להיות "קש צבעוני." אם יש זיהום משמעותי עם השכבות פיגמנט ושומנים בדם בשלב זה, ניתן לחזור על הספין עוד פעם אחת, למרות ספינים מוגזמים יקטינו את הקיבולת של התמצית להשפיל β-catenin.
    4. הוספת LPA וCytochalasin ד 'לתמצית בריכוזים סופיים של 10 מיליליטר כל מיקרוגרם /. הערה: שימוש בשיטה המתוארת תשואות ריכוז עקבי למדי בסך הכל חלבון של כ 50 מ"ג / מיליליטר (52.41 ± 5.40 מ"ג / מיליליטר, n = 3 preps הנפרד) בXenopus למשלתמציות גרם.
    5. (אופציונאלי) למבחני תרגום, להוסיף mRNA (0.1 מ"ג / מיליליטר) כתרים, RNasin (1.5 U / ml), ותמהיל התחדשות אנרגיה (2.2.1) ודגירת התגובה על RT במשך שעה 2 (לפרטים נוספים ראה et Salic אל. 2 וסייב et al. 33). השתמש בתמצית תורגמה מייד למבחני השפלה β-catenin או Snap-הקפאה בחנקן נוזלי לשימוש מאוחר יותר. יש תמצית שהוכנה טרי קיבולת גבוהה לתרגם mRNA הוסיף אקסוגני, אך למרבה הצער, יכולת זו הולכת לאיבוד ברגע שהתמצית קפוא: הערה. כתרי mRNA יכול להיות מוכן בקלות באמצעות ערכות זמינות מסחרי.
    6. תמצית Snap-הקפאה בחנקן נוזלי. הערה: תמציות מאוחסנות בaliquots הקטנים (200 μl) ליחד כי הם במהירות לאבד את יכולתם כדי לבזות β-catenin אם refrozen. עבור אחסון לטווח ארוך, תמצית ניתן לאחסן בחנקן נוזלי. עבור אחסון לטווח קצר, תמצית ניתן לאחסן ב -80 מעלות צלזיוס, אם כי o הקיבולתתמצית ו להשפיל β-catenin, ניתן להפחית באופן דרמטי עם אחסון ממושך ב-80 ° C (יותר מ 2 חודשים).

2. הכנת תמצית עבור assay השפלה β-catenin

  1. דלדול מתמצית Xenopus
    הערה: יתרון עיקרי של תמצית Xenopus הוא היכולת לרוקן בקלות רכיבים של מסלול ודווקא להוסיף בחזרה כמות מוגדרת של חלבון על מנת לקבוע את ההשפעות תלויות המינון שלה.
    1. השתמש בתמצית ביצי Xenopus מוכנה טרי או במהירות להפשיר תמצית ומקום קפוא בקרח. לבצע את כל המניפולציות בקור.
    2. להוסיף תמצית ל1/10 הנפח של נוגדן pelleted או חרוזים זיקה (לדוגמא, 20 מיליליטר חרוזים pelleted 200 תמצית מיליליטר). על מנת למזער את הדילול של התמצית, למשוך כמה שיותר נוזלים מהחרוזים ככל האפשר לפני תוספת של התמצית באמצעות טיפים טעינת ג'ל עם טיפים ארוכים, מחודדים.
    3. סובב תמציתתמהיל חרוז ב-C ° 4 במשך שעה 1.
    4. תמהיל ספין תמצית חרוז ב12,600 XG בmicrofuge ב-C ° 4 ל30 שניות. לחלופין, אם חרוזים מגנטיים משמשים, להחיל שדה מגנטי כדי לאסוף חרוזים.
    5. העברה מדולדלת תמצית לצינור microfuge טרי על קרח. היזהר שלא להעביר כל חרוזים בתמצית.
    6. לאשר את היעילות של דלדול ידי immunoblotting שתי תמצית וחרוזים מדולדלים.
    7. הכן את התמצית עבור assay השפלה β-catenin כפי שמתואר ב2.2.
  2. אופטימיזציה של Xenopus חלץ לביזוי β-catenin
    הערה: השפלה β-catenin בתמצית ביצי Xenopus היא תהליך אנרגיה תלויה שכלה את מהירות חנויות ATP אנדוגני. כתוצאה מכך, נדרשת מערכת התחדשות אנרגיה כדי לשמור השפלה β-catenin חזקה.
    1. להכין תערובת 20x התחדשות אנרגיה (ER) בהיקף של 150 קריאטין פוספט מ"מ, 20 מ"מ ה-ATP, 600 מיקרוגרם / phosphokinase קריאטין מיליליטר,ו20 מ"מ MgCl 2. ER צריך להיות aliquoted ומאוחסן ב -80 ° C. הימנע מהקפאה / הפשרה מחזורים חוזרים ונשנים באמצעות aliquots הקפואים קטנים.
    2. מהירות להפשיר תמצית ביצי Xenopus ידי שפשוף הצינור הקפוא בין ידיים. מניחים את הצינור על קרח ממש לפני כל התמצית נמס.
    3. הוסף 10 μl תמהיל התחדשות אנרגיה (20x ER) לaliquot (200 μl) של תמצית ביצי Xenopus. מערבבים היטב על ידי מצליף vortexing הצינור והדופק במהירות. Pulse-ספין ומייד מניח על קרח.
    4. (אופציונלי) מחזור של β-catenin ניתן לשפר מעט בתמצית ביצי Xenopus על ידי תוספת של היוביקוויטין (סופי 1.25 מ"ג / מיליליטר). Cycloheximide (0.1 מ"ג / מיליליטר סופי) ניתן גם להוסיף כדי למזער את התרגום של תמלילי אנדוגני.
    5. Aliquot הכרכים המתאימים עבור assay השפלה לתוך צינורות microfuge טרום צוננים על קרח. עבור מבחני השפלה β-catenin radiolabeled, לסגת 2-5 מיליליטר לחלץ עבור כל נקודת זמן.

3. Assay השפלה β-catenin radiolabeled בתמצית ביצי Xenopus

הערה: יש לבצע את כל הצעדים על קרח, אלא אם כן צוינו אחרת.

  1. הכנת β-catenin radiolabeled
    1. הכן טרי בחלבון מתיונין-radiolabeled-מסונתז מבחנה [35 S] באמצעות ערכות זמינות מסחרי. הערה: חלבוני יצירת 35 S-שכותרתו (זמן מחצית חיים 87 ימים) מיוצרים בקלות וביעילות באמצעות במצמידי מבחנה ערכות תמלול בתרגום זמינות מסחרי. חשוב שהחלבון המתורגם מתויג מספיק כך שהשינויים במחזור חלבון ניתן דמיינו בקלות.
    2. כדי לאשר radiolabeling המוצלח, לבצע SDS-PAGE/autoradiography עם 0.5 μl של החלבון המתורגם. לכמת את עוצמת להקת β-catenin radiolabeled באמצעות ImageJ, ImageQuant, או progr תוכנה כמותיים חלופיאני. הערה: להקת חלבון β-catenin radiolabeled צריכה להיות לעין בסרט תוך כמה שעות (4-6 hr).
    3. Snap-להקפיא את חלבון רדיואקטיבי בחנקן נוזלי לאחסון עד לשימוש. הערה: אחסון ממושך (> 2 חודשים) והקפאה / הפשרה מרובה (יותר מ -2) יכול להשפיע קשות את היכולת של β-catenin radiolabeled להשפיל וחסונה בתמצית ביצי Xenopus. בדרך כלל, היציבות של חלבוני radiolabeled יורדת באופן משמעותי לאחר חודש 1 של אחסון ב -80 ° C; וכך, β-catenin radiolabeled יחסית מוכן טרי נותן את התוצאות הטובות ביותר במבחני השפלה אלה.
  2. ביצוע Assay השפלה β-catenin
    1. להוסיף 1-3 μl (תלוי בעוצמת אות להקת radiolabeled) של בβ-catenin תורגם חוץ הגופייה (וחלבונים אחרים, מולקולות קטנות, וכו 'שנבדקות) ל20 μl של תערובת תגובת Xenopus על קרח. מערבבים היטב על ידי quickly מצליף את הצינורית ודופק קצר של vortexing; זה הוא צעד חשוב כתמצית ביצי Xenopus היא צמיגה מאוד, וערבוב שלם ישפיע על העקביות של התוצאות. ספין דופק ומניחים על קרח.
    2. להתחיל את תגובת השפלה β-catenin על ידי העברת צינורות RT.
    3. בנקודת הזמן המיועדת, להסיר 1-5 מיליליטר של המדגם ומערבבים מייד עם חיץ SDS מדגם (5x נפח) כדי לעצור את התגובה. כדי לוודא תגובת השפלה הוא הופסק לחלוטין, צינור קפיצי מספר פעמים ומערבולת במרץ.
    4. בצע SDS-PAGE/autoradiography. הפעל 1 מיליליטר שווה (~ 50 מ"ג של חלבון) של התמצית עבור כל נקודה / נתיב זמן. השפלה של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus יש שמעידה הירידה תלויה בזמן בעוצמת איור להקת β-catenin radiolabeled 2. לכמת תוצאות באמצעות ImageJ, ImageQuant, או תוכנת הדמיה מועדפת אחרת במידת צורך.
    5. (Optional) משרים ג'ל SDS-polyacrylamide בתיקון פתרון (10% חומצה אצטית ומתנול 30% במים מזוקקים) לפני הייבוש כדי להקטין רדיואקטיביות רקע ולהגדיל את האיכות של התמונה.

4. Β-catenin-לוציפראז Assay השפלה בתמצית ביצי Xenopus

לבצע את כל הצעדים על קרח, אלא אם כן צוין אחרת.

  1. הכנת β-catenin-לוציפראז
    1. לסנתז β-catenin הלא רדיואקטיבי, מתויג לוציפראז שימוש במערכת בשילוב תמלול בתרגום עם תערובת חומצות אמינו מלאה.
    2. אשר ייצור של β-catenin-מתויג לוציפראז על ידי מדידת פעילות לוציפראז .5-1 μl של התגובה. להעריך הארה רקע על ידי מדידת הארה מתערובת תגובה לא מתורגמת. הערה: ערכות מסחריות מרובות זמינות למדידת פעילות לוציפראז. הארה חיים ארוך, לעומת זאת, עובדת טוב במיוחד עבור אסא השפלהy.
  2. ביצוע Assay השפלה β-catenin-לוציפראז
    1. להפשיר ולהכין תמצית ביצי Xenopus כמו ב2.2.
    2. להוסיף בהיתוך תורגם מבחנה β-catenin-לוציפראז (מ4.1) לתוך תערובת מוכנה Xenopus תגובה (מ2.2) על קרח ומערבבים היטב כמו ב3.2.1. הערה: הפעילות של לוציפראז β-catenin שמתווסף לתמצית היא בדרך כלל בין 20 - 50,000 יחידות הארה יחסי (RLU) / מיליליטר של תמצית (המבוסס על מדידות המתקבלות מ4.1.2). אות זינוק צריכה להיות כ 100,000 RLU (2-5 מיליליטר של-catenin-לוציפראז β ההיתוך בתורגם חוץ הגופייה).
    3. Shift כדי לחלץ RT כדי להתחיל את תגובת השפלה.
    4. הסרת aliquot של התגובה בזמן המצוין וSnap-הקפאה בחנקן נוזלי. הערה: דגימות שלושה עותקים יוסרו בדרך כלל לניתוח עבור כל נקודת זמן. תמצית קפואה יכולה להיות מאוחסנת ב -80 ° C האנטil הם מוכנים להיות מנותחים.
    5. קרח דגימות הפשרה, דגימות העברה לצלחות סטנדרטיות לבנה 96 היטב על קרח, ותהליך לפעילות לוציפראז.

תוצאות

סכמטי של השפלה β-catenin בתמצית ביצי Xenopus מוצג באיור 2 א. 35 β-catenin כותרת-S הודגר בתמצית ביצי Xenopus, aliquots (1 מיליליטר לחלץ שווה ערך) הוסרו במועדים המתאימים, ודגימות היו נתונים SDS-PAGE ואחרי autoradiography. השפלה β-catenin על ידי רכיבים של מסלול Wnt מתווכת על ידי מערכת ה...

Discussion

תמצית ביצי Xenopus היא מערכת ביוכימית חזקה לחקירת מחזור β-catenin. הריכוז של β-catenin בתמצית ביצי Xenopus הוא ~ 25 ננומטר 2. בתנאים אופטימליים, תמצית הביצה היא מסוגלת משפיל β-catenin בשיעור של 50-100 ננומטר / שעה וחצי מקסימאלי ב200 ננומטר 24. ישנם מספר צעדים קריטיים לכינו?...

Disclosures

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לורי לי לקריאה ביקורתית של כתב היד. TWC נתמך על ידי predoctoral מלגת איגוד לב אמריקאי (12PRE6590007). MRB נתמך על ידי מענק לאומי לסרטן מכון אימון (CA119925 T32). SSH נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01DK078640). EL נתמך על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01GM081635 וR01GM103926).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)ProSpechor-272-AReconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropinSigmaCG10-10VL
Potassium chlorideFisherBP366-1
Sodium chlorideResearch Products InternationalS23020-5000.0
Magnesium chlorideFisherBP214-500
Calcium chlorideAcros OrganicsAC42352-5000
HEPESFisherBP310-1
CysteineAcros OrganicsAC17360-1000
LeupeptinSigmaL2884-10MG
AprotininSigmaA1153-10MG
PepstatinSigmaP4265-5MG
Cytochalasin BSigmaC8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tipBecton Dickinson309657
27 G needleBecton Dickinson305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomedCorning3605
Steady-Glo luciferase assay systemPromegaE2520Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate systemPromegaL4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression systemPromegaL3260Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35]Perkin ElmerNEG772007MC
Creatine phosphateSigma27920-5G
ATPSigmaA2383-5G
Creatine phosphokinaseSigmaC3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay systemPromegaE2920Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubesFisher Scientific0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotorThermo Scientific28020
115 V 50/60 Hz MinicentrifugeFisher Scientific05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kitAmbionAM1340
Anti-firefly luciferase antibodyAbcamab16466
Anti-GSK3 antibodyBD Transduction Laboratories610201
FLUOStar OptimaBMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific
16 °C IncubatorPercival Scientific

References

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathway in Xenopus egg extracts. Molecular Cell. 5, 523-532 (2000).
  3. Murray, A. W. Cell cycle extracts. Methods in cell biology. 36, 581-605 (1991).
  4. Dabauvalle, M. C., Scheer, U. Assembly of nuclear pore complexes in Xenopus egg extract. Biology of the cell / under the auspices of the European Cell Biology Organization. 72, 25-29 (1991).
  5. Tutter, A. V., Walter, J. C. Chromosomal DNA replication in a soluble cell-free system derived from Xenopus eggs. Methods Mol Biol. 322, 121-137 (2006).
  6. Theriot, J. A., Rosenblatt, J., Portnoy, D. A., Goldschmidt-Clermont, P. J., Mitchison, T. J. Involvement of profilin in the actin-based motility of L. monocytogenes in cells and in cell-free extracts. Cell. 76, 505-517 (1994).
  7. Maresca, T. J., Heald, R. Methods for studying spindle assembly and chromosome condensation in Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 459-474 (2006).
  8. Shennan, K. I. Xenopus egg extracts: a model system to study proprotein convertases. Methods Mol Biol. 322, 199-212 (2006).
  9. Kornbluth, S., Yang, J., Powers, M. Analysis of the cell cycle using Xenopus egg extracts. Current protocols in cell biology / editorial board, Juan S. Bonifacino ... [et al.]. 11, (2006).
  10. Chan, R. C., Forbes, D. I. In vitro study of nuclear assembly and nuclear import using Xenopus egg extracts. Methods Mol Biol. 322, 289-300 (2006).
  11. Masui, Y., Markert, C. L. Cytoplasmic control of nuclear behavior during meiotic maturation of frog oocytes. The Journal of experimental zoology. 177, 129-145 (1971).
  12. Forbes, D. J., Kirschner, M. W., Newport, J. W. Spontaneous formation of nucleus-like structures around bacteriophage DNA microinjected into Xenopus eggs. Cell. 34, 13-23 (1983).
  13. Lohka, M. J., Masui, Y. Formation in vitro of sperm pronuclei and mitotic chromosomes induced by amphibian ooplasmic components. Science. 220, 719-721 (1983).
  14. Newport, J. W., Kirschner, M. W. Regulation of the cell cycle during early Xenopus development. Cell. 37, 731-742 (1984).
  15. Mitchison, T., Kirschner, M. Dynamic instability of microtubule growth. Nature. 312, 237-242 (1984).
  16. Blow, J. J., Laskey, R. A. Initiation of DNA replication in nuclei and purified DNA by a cell-free extract of Xenopus eggs. Cell. 47, 577-587 (1986).
  17. Verma, R., et al. Ubistatins inhibit proteasome-dependent degradation by binding the ubiquitin chain. Science. 306, 117-120 (2004).
  18. Yu, H., King, R. W., Peters, J. M., Kirschner, M. W. Identification of a novel ubiquitin-conjugating enzyme involved in mitotic cyclin degradation. Curr Biol. 6, 455-466 (1996).
  19. Thorne, C. A., et al. Small-molecule inhibition of Wnt signaling through activation of casein kinase 1alpha. Nature Chemical Biology. 6, 829-836 (2010).
  20. Thorne, C. A., et al. A biochemical screen for identification of small-molecule regulators of the Wnt pathway using Xenopus egg extracts. Journal of Biomolecular Screening. 16, 995-1006 (2011).
  21. Hinkson, I. V., Elias, J. E. The dynamic state of protein turnover: It's about time. Trends in Cell Biology. 21, 293-303 (2011).
  22. Kinzler, K. W., Vogelstein, B. Lessons from Hereditary Colorectal Cancer. Cell. 87, 159-170 (1996).
  23. Lee, E., Salic, A., Kirschner, M. W. Physiological regulation of [beta]-catenin stability by Tcf3 and CK1epsilon. J Cell Biol. 154, 983-993 (2001).
  24. Lee, E., Salic, A., Krüger, R., Heinrich, R., Kirschner, M. W. The roles of APC and Axin derived from experimental and theoretical analysis of the Wnt pathway. PLoS Biology. 1, (2003).
  25. Seeling, J. M., et al. Regulation of beta-catenin signaling by the B56 subunit of protein phosphatase 2A. Science. 283, 2089-2091 (1999).
  26. Guger, K. A., Gumbiner, B. M. beta-Catenin has Wnt-like activity and mimics the Nieuwkoop signaling center in Xenopus dorsal-ventral patterning. Dev Biol. 172, 115-125 (1995).
  27. Cselenyi, C. S., et al. LRP6 transduces a canonical Wnt signal independently of Axin degradation by inhibiting GSK3's phosphorylation of β-catenin. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105, 8032-8037 (2008).
  28. Jernigan, K. K., et al. Gbetagamma activates GSK3 to promote LRP6-mediated beta-catenin transcriptional activity. Science Signaling. 3, (2010).
  29. Major, M. B., et al. Wilms tumor suppressor WTX negatively regulates WNT/beta-catenin signaling. Science. 316, 1043-1046 (2007).
  30. Cross, M. K., Powers, M. Obtaining eggs from Xenopus laevis females. J Vis Exp. , (2008).
  31. Cross, M. K., Powers, M. Preparation and fractionation of Xenopus laevis egg extracts. J Vis Exp. , (2008).
  32. Willis, J., DeStephanis, D., Patel, Y., Gowda, V., Yan, S. Study of the DNA damage checkpoint using Xenopus egg extracts. J Vis Exp. , (2012).
  33. Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus Laevis : A Laboratory Manual. , (2000).
  34. Rubinfeld, B., et al. Binding of GSK3β to the APC-β-Catenin Complex and Regulation of Complex Assembly. Science. 272, 1023-1026 (1996).
  35. Salic, A., King, R. W. Identifying small molecule inhibitors of the ubiquitin-proteasome pathway in Xenopus egg extracts. Methods in Enzymology. 399, 567-585 (2005).
  36. Trinkle-Mulcahy, L., et al. Identifying specific protein interaction partners using quantitative mass spectrometry and bead proteomes. J Cell Biol. 183, 223-239 (2008).
  37. Tan, C. W., et al. Wnt signalling pathway parameters for mammalian cells. PLoS One. 7, (2012).

Erratum


Formal Correction: Erratum: Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

to:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 µl pelleted beads to 200 µl extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 µl extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 µl of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 µl equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/µl of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 µl of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88Laevis XenopusXenopusradiolabelautoradiography

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved