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Dans cet article

  • Erratum Notice
  • Résumé
  • Résumé
  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Erratum
  • Réimpressions et Autorisations

Erratum Notice

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Résumé

Un procédé est décrit pour l'analyse de la dégradation des protéines en utilisant des protéines radiomarquées et la luciférase-fusion dans Xenopus extrait d'oeufs et de son adaptation pour le criblage à haut débit pour les petites molécules modulateurs de la dégradation des protéines.

Résumé

Xenopus extrait d'oeufs de laevis est un système robuste et bien caractérisés pour étudier la biochimie de divers processus cellulaires. Xenopus extrait d'œuf a été utilisé pour étudier le renouvellement des protéines dans de nombreux contextes cellulaires, y compris le cycle cellulaire et la transduction du signal des voies 1-3. Le présent mémoire, on décrit un procédé pour isoler l'extrait d'oeuf de Xénope qui a été optimisé pour favoriser la dégradation de la protéine de la voie Wnt critique, β-caténine. Deux méthodes différentes sont décrites pour évaluer β-caténine la dégradation des protéines dans Xenopus extrait d'oeufs. Une méthode est visuellement informatif ([35 S] radiomarqué protéines), tandis que l'autre est plus facilement mis à l'échelle pour les essais à haut débit (luciole protéines de fusion luciférase marqués). Les techniques décrites peuvent être utilisés, mais ne sont pas limités à, d'évaluer β-caténine renouvellement des protéines et identifier les composants moléculaires qui contribuent à son chiffre d'affaires. En outre, la capalité de purifier de grands volumes de homogène extrait d'oeufs de Xénope combinée à la lecture facile et quantitative des protéines de la luciférase à marquage de ce système permet d'être facilement adaptée pour le criblage à haut débit pour des modulateurs de la dégradation de β-caténine.

Introduction

Xenopus laevis extrait d'oeufs a été largement utilisée pour étudier de nombreux processus biologiques cellulaires, y compris la dynamique du cytosquelette, l'assemblage nucléaire et l'importation, l'apoptose, le métabolisme de l'ubiquitine, la progression du cycle cellulaire, la transduction du signal, et le renouvellement des protéines 1-17. Le système d'extraction d'oeufs de Xenopus se prête à l'analyse biochimique d'une légion de processus cellulaires parce extrait d'oeufs représente essentiellement cytoplasme non dilué qui contient tous les composants cytoplasmiques essentielles nécessaires à l....

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Protocole

1. Préparation de l'extrait d'oeufs de Xenopus

REMARQUE: Chaque grenouille donne environ 1 ml d'extrait d'oeufs utilisable. Des extraits de 10 grenouilles sont typiquement préparés en une seule fois, et le volume de tampon décrite ci-dessous est destiné à effectuer une 10 grenouille Xenopus extrait d'oeufs prep. Le volume du tampon peut être ajusté en conséquence pour des préparations plus ou moins grandes de l'extrait d'œuf. Preps générés de cette manière fournissent constamment des concentrations de protéine de ≥ 50 mg / ml. Le processus de collecte des œufs et leur transformation en extrait e....

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Résultats

Un schéma de dégradation de β-caténine chez Xenopus extrait d'œuf est représenté sur la figure 2A. 35S marqué β-caténine a été incubé dans Xenopus extrait de l'oeuf, des fractions aliquotes (1 ml d'extrait équivalent) ont été prélevés à des moments appropriés, et des échantillons ont été soumis à SDS-PAGE suivie d'une autoradiographie. la dégradation de β-caténine par des composants de la voie Wnt est médiée par le système ubiqui.......

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Discussion

Xenopus extrait d'oeuf est un système biochimique robuste pour enquêter sur le chiffre d'affaires β-caténine. La concentration de β-caténine chez Xenopus extrait d'œuf est 25 ~ 2 nM. Dans des conditions optimales, l'extrait d'œuf est capable de dégrader les β-caténine à un débit de 50 à 100 nM / h et est semi-maximale à 24 200 nM. Il ya plusieurs étapes essentielles pour la reconstitution réussie de la dégradation de β-caténine utilisant

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu'ils n'ont aucun intérêt financier concurrents.

Remerciements

Nous remercions Laurie Lee pour la lecture critique du manuscrit. TWC est soutenu par une bourse prédoctorale American Heart Association (12PRE6590007). MRB est soutenu par une subvention de formation de l'Institut national du cancer (T32 CA119925). SSH est soutenue par les Instituts nationaux de la santé (R01DK078640). EL est soutenue par les National Institutes of Health (R01GM081635 et R01GM103926).

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)ProSpechor-272-AReconstituted with distilled water before use. 
Human chorionic gonadotropinSigmaCG10-10VL
Potassium chlorideFisherBP366-1
Sodium chlorideResearch Products InternationalS23020-5000.0
Magnesium chlorideFisherBP214-500
Calcium chlorideAcros OrganicsAC42352-5000
HEPESFisherBP310-1
CysteineAcros OrganicsAC17360-1000
LeupeptinSigmaL2884-10MG
AprotininSigmaA1153-10MG
PepstatinSigmaP4265-5MG
Cytochalasin BSigmaC8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tipBecton Dickinson309657
27 G needleBecton Dickinson305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomedCorning3605
Steady-Glo luciferase assay systemPromegaE2520Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate systemPromegaL4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression systemPromegaL3260Generally higher yield than reticulocyte lysate 
EasyTag Express protein labeling mix [S35]Perkin ElmerNEG772007MC
Creatine phosphateSigma27920-5G
ATPSigmaA2383-5G
Creatine phosphokinaseSigmaC3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)SigmaD8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay systemPromegaE2920Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubesFisher Scientific0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotorThermo Scientific28020
115 V 50/60 Hz MinicentrifugeFisher Scientific05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kitAmbionAM1340
Anti-firefly luciferase antibodyAbcamab16466
Anti-GSK3 antibodyBD Transduction Laboratories610201
FLUOStar OptimaBMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifugeThermo Scientific
16 °C IncubatorPercival Scientific

Références

  1. Glotzer, M., Murray, A. W., Kirschner, M. W. Cyclin is degraded by the ubiquitin pathway. Nature. 349, 132-138 (1991).
  2. Salic, A., Lee, E., Mayer, L., Kirschner, M. W. Control of beta-catenin stability: reconstitution of the cytoplasmic steps of the wnt pathwa....

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Erratum


Formal Correction: Erratum: Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to Reconstitution Of β-catenin Degradation In Xenopus Egg Extract. At the time of publication there were some instances where an incorrect volume notation was used. These instances were corrected from:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 ml pelleted beads to 200 ml extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 ml extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 ml of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 ml equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/ml of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 ml of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

to:

2.1.2. Add extract to 1/10 the volume of pelleted antibody or affinity beads (e.g., 20 µl pelleted beads to 200 µl extract). In order to minimize dilution of the extract, withdraw as much liquid from the beads as possible before addition of the extract using gel loading tips with long, tapered tips.

2.2.5. Aliquot the appropriate volumes for degradation assay into pre-chilled microfuge tubes on ice. For radiolabeled β-catenin degradation assays, withdraw 2-5 µl extract for each time point.

3.2.3. At the designated time point, remove 1-5 µl of the sample and mix immediately with SDS sample buffer (5x volume) to stop the reaction. To make sure the degradation reaction is completely terminated, flick tube several times and vortex vigorously.

3.2.4. Perform SDS-PAGE/autoradiography. Run 1 µl equivalents (~50 mg of protein) of the extract for each time point/lane. Degradation of β-catenin in Xenopus egg extract should be evidenced by the time-dependent decrease in intensity of the radiolabeled β-catenin band Figure 2. Quantify results using ImageJ, ImageQuant, or other preferred imaging software if necessary.

4.2.2. Add in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion (from 4.1) into prepared Xenopus reaction mix (from 2.2) on ice and mix well as in 3.2.1. NOTE: The activity of the β-catenin luciferase that is added to the extract is typically between 20 - 50,000 relative luminescence units (RLU)/µl of extract (based on measurements obtained from 4.1.2). Starting signal should be approximately 100,000 RLU (2-5 µl of the in vitro-translated β-catenin-luciferase fusion).

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