Ricostituzione della β-catenina degradazione nel<em&gt; Xenopus</em&gt; Estrai Egg

Riepilogo

Un metodo è descritto per l'analisi degradazione delle proteine ​​usando radioattivo e proteine ​​luciferasi-fusione in estratto uovo Xenopus e il suo adattamento per lo screening high-throughput per piccoli modulatori molecola di degradazione delle proteine.

Abstract

Xenopus laevis estratto uovo è un ben caratterizzato, robusto sistema per studiare la biochimica di diversi processi cellulari. Estratto uovo Xenopus è stato usato per studiare il ricambio proteico in molti contesti cellulari, tra cui il ciclo cellulare e trasduzione del segnale percorsi ^1-3. Qui, è descritto un metodo per isolare estratto uovo Xenopus che è stato ottimizzato per promuovere la degradazione della componente pathway Wnt critico, β-catenina. Due diversi metodi sono descritti per valutare β-catenina degradazione delle proteine ​​in estratti di uova di Xenopus. Un metodo è visivamente informativo ^([35 S] radiomarcato proteine), mentre l'altro è più facilmente scalato per saggi high-throughput (lucciola proteine ​​di fusione luciferasi-tagged). Le tecniche descritte possono essere utilizzate per, ma non sono limitati a, valutare β-catenina turnover proteico e identificare i componenti molecolari che contribuiscono al fatturato. Inoltre, la poslità di purificare grandi volumi di omogenea estratto uovo Xenopus combinata con la lettura quantitativa e facile di proteine ​​luciferasi-tag permette questo sistema di essere facilmente adattato per screening ad alto rendimento per modulatori di degradazione β-catenina.

Introduzione

Estratto uovo Xenopus laevis è stato ampiamente utilizzato per studiare molti cellulari processi biologici, tra cui la dinamica del citoscheletro, l'assemblaggio e l'importazione nucleare, l'apoptosi, il metabolismo ubiquitina, progressione del ciclo cellulare, trasduzione del segnale, e proteine ​​fatturato ^1-17. Il sistema estratto uovo Xenopus è riconducibile alla analisi biochimica di una legione di processi cellulari perché estratto uovo rappresenta sostanzialmente citoplasma non diluito che contiene tutti i componenti essenziali citoplasmatici necessari per eseguire questi processi e consentire indagine. Grandi quantità di estratto di uova possono essere preparati in una sola volta per le manipolazioni biochimiche che richiedono grandi quantità di materiale (ad esempio, purificazione di proteine ​​o high-throughput screening) ^18-20. Un altro vantaggio è che la concentrazione di proteine ​​specifiche in estratto uovo Xenopus può essere regolata con precisione mediante aggiunta di proteine ​​e / o immunodeplezione di endog ricombinanteproteine ​​enous in contrasto trasfezione di DNA plasmidico in cui l'espressione della proteina di interesse è difficile da controllare. Inoltre, la mancanza di proteine ​​ricombinanti disponibili può essere superato con l'aggiunta di trascritti codificanti la proteina di interesse, sfruttando elevata capacità estratto uovo Xenopus preparata per tradurre mRNA esogenamente aggiunti.

La regolazione della degradazione delle proteine ​​è fondamentale per il controllo di molte vie cellulari ed elabora ^21. Estratto uovo di Xenopus è stato ampiamente utilizzato per studiare la degradazione delle proteine ​​in quanto il sistema permette diversi modi per monitorare il turnover proteico, senza influenze confondenti di trascrizione e traduzione. La via di segnalazione Wnt è una via di segnalazione altamente conservato che svolge un ruolo critico nello sviluppo e nella malattia. Il fatturato di β-catenina, il principale effettore della via di Wnt, è altamente regolamentato, e un aumento steady-state level di β-catenina è critica per l'attivazione di Wnt geni bersaglio. L'importanza di degradazione β-catenina è evidenziata dal fatto che mutazioni nella via di Wnt che inibiscono la degradazione β-catenina trovare in ~ 90% di tutti i casi sporadici di tumore colorettale ^22. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt può essere fedelmente riassunta in estratto uovo Xenopus per studiare il meccanismo del fatturato nonché per identificare nuovi modulatori piccole molecola della sua degradazione ^{2, 19, 20, 23-29.}

Metodi per la preparazione di estratto uovo Xenopus per studiare il ciclo cellulare sono stati descritti in precedenti pubblicazioni JoVE ^30-32. Il protocollo attuale descrive una modifica di questi metodi ed è ottimizzato per la degradazione di ^[35 S]-radiomarcato β-catenina e luciferasi-tag β-catenina inEstratto uovo di Xenopus. Il test di degradazione radioattivo permette la visualizzazione diretta dei livelli di proteine ​​tramite autoradiografia. ^[35 S] metionina è incorporata nella proteina di interesse utilizzando una reazione di traduzione in vitro che possono poi essere aggiunto direttamente ad una reazione di degradazione. Inoltre, la proteina radiomarcato dosaggio fatturato non richiede un anticorpo contro la proteina di interesse o un epitopo, che può influenzare la stabilità della proteina. Poiché anche piccoli cambiamenti nei livelli di proteine, che si riflette in variazioni dell'intensità della banda di proteina radiomarcato, sono facilmente visualizzati mediante autoradiografia, la ^[35 S]-radiomarcato saggio degradazione rappresenta un metodo molto utile per la visualizzazione di proteine ​​fatturato ^2.

Fusione di β-catenina a luciferasi di lucciola (di seguito denominato semplicemente "luciferasi") consente di misure quantitative precise e facili dei livelli di proteine, al fine diper determinare le proprietà cinetiche di β-catenina fatturato ^{19, 20.} Uno dei principali vantaggi del saggio luciferasi è che fornisce un sistema quantitativo forte che è facilmente calcificato. Il protocollo che segue fornisce metodi semplici per saggiare la degradazione β-catenina e un metodo affidabile, efficiente ed efficace per high-throughput screening nuovi modulatori β-catenina.

Protocollo

1. Preparazione di Xenopus estratto Egg

NOTA: Ogni rana produce circa 1 ml di estratto uovo utilizzabile. Estratti di 10 rane sono tipicamente preparati in una sola volta, e il volume di tampone di seguito descritto è per l'esecuzione di un 10 rana Xenopus estratto uovo prep. Il volume buffer può essere regolata di conseguenza per preparazioni più o meno grandi di estratto uovo. Preps generato in questa maniera coerente produrre concentrazioni proteiche ≥ 50 mg / ml. Il processo di raccolta delle uova e loro trasformazione in estratto è più efficace se condotta da due persone. (Per le tecniche di base della rana di allevamento, vedere Sive et al. ^33).

1. Egg Collection
   1. Per adescare le rane, iniettano ogni rana femminile con 100 U di Pregnant Mare Serum gonadotropina (PMSG) da un appena fatto 250 U / ml di brodo. Utilizzare una siringa da tubercolina 3 ml con un ago G 27 per iniettare per via sottocutanea, con la smussatural'ago, nella linfa sacco dorsale, che si trova a circa 1 cm di distanza dalla linea mediana dalle macchie dentellato lungo la lunghezza delle gambe della rana.
   2. Conservare rane innescato in acqua (oltre 20 mM NaCl, vedere Sive et al. ³³⁾ a 18 ° C per 5-10 giorni. Per i piedi sistemi serbatoio dell'acqua, la densità degli animali è di circa 4 litri di acqua per ogni rana femminile. NOTA: Il tempo minimo richiesto per l'innesco abbia effetto è di 5 giorni, e gli effetti di priming svanire dopo 10 giorni.
   3. Preparare la soluzione 0.5x di Marc Modificato Ringers (MMR) da un MMR magazzino 20x. 20x MMR consiste di 2 M di cloruro di sodio, cloruro di potassio 40 mM, 40 mM di cloruro di calcio, cloruro di magnesio 20 mM e 100 mM di 4 - (2-idrossietil)-1-piperazineethanesulfonic acido (HEPES), pH 7,4.
   4. Impostare benne per tutte le rane iniettati (una rana per 4 L secchio). NOTA: Anche se più di una rana può essere posizionato nello stesso bucket di raccolta delle uova, se una delle ranedepone le uova di qualità prevalentemente poveri, una notevole quantità di sforzo sarà necessario separare le uova di scarsa qualità da quelli che sono adatto a fare estratto. Così, massimizzando il numero di rane nello stesso serbatoio per minimizzare la quantità di buffer utilizzato per uovo raccoglie non vale il rischio.
   5. Iniettare 750 U gonadotropina corionica umana (HCG) nel sacco linfatico dorsale di ogni rana utilizzando un ago 27 G, come indicato al punto 1.1.1.
   6. Posizionare ciascuna delle rane HCG-iniettato in singole secchi 4 L contenenti 0,5 x MMR raffreddata a 16 ° C.
   7. Posizionare i contenitori con le rane in un incubatore a 16 ° C a raccogliere uova O / N (15-16 ore). NOTA: Mantenere la temperatura corretta è fondamentale per l'intera procedura, dalla raccolta delle uova alla preparazione estratto uovo.
2. Dejellying Uova
   NOTA: Le uova sono ricoperte da uno strato di gelatina che deve essere rimossa prima di effettuare estratto. La probabilità di lisi spontanea delle uova aumenta il tempo between deposizione delle uova ed estrarre gli aumenti di preparazione. Pertanto, è importante procedere attraverso i seguenti passi più rapidamente possibile.
   1. Preparare 4 L di 1x MMR, 50 ml di 0,1 x MMR, e 400 ml di 2% cisteina, pH 7.7, effettuate in acqua distillata. Mantenere tutte le soluzioni a 16 ° C.
   2. Per espellere le uova aggiuntive, premere delicatamente la parte bassa della schiena e l'addome della rana.
   3. Rimuovere le rane e il grosso del MMR, di lasciare le uova in circa 1-200 ml di MMR in ciascun segmento.
   4. Rimuovere i detriti con una pipetta di trasferimento, e valutare la qualità delle uova: uova di alta qualità sono generalmente caratterizzata da una netta separazione tra l'emisfero animale cupamente pigmentate e l'emisfero vegetale leggermente colorato e hanno il più alto contrasto scuro-chiaro. Eliminare con una pipetta di trasferimento tutte le uova che appaiono filante, screziato, o lisato (bianco e gonfio) in quanto diminuirà la qualità complessiva degli estratti. Se> 10% delle uova sono di scarsa qualità, l'interolotto deve essere eliminata.
   5. Unire le uova in un bicchiere di vetro da 500 ml e versare fuori tanto MMR possibile, mantenendo le uova sommerse.
   6. Risciacquare uova delicatamente agitando con il doppio del volume uovo di MMR. Ripetere due volte, e rimuovere eventuali detriti o uova di qualità, ovviamente povere.
   7. Aggiungere circa 100 ml di 2% cisteina per il bicchiere, agitare delicatamente per mescolare, e permettono di uova di stabilirsi per 5 minuti a 16 ° C. Eliminare il cisteina. NOTA: Dejellying è caratterizzata dalla progressiva comparsa di strati di gelatina galleggianti sopra le uova e l'imballaggio più compatta delle uova come ora occupano un volume inferiore senza il cappotto gelatina.
   8. Aggiungere altri 100 ml di 2% cisteina, agitare delicatamente, attendere 5 minuti e poi versare lentamente al largo della cisteina. Ripetere fino uova sono diventate strettamente compattato (di solito dal terzo trattamento cisteina). Nota: Se le uova sono troppo lunghi in cisteina, essi sono soggetti ad lisi. Analogamente, uova dejellied sono fragili e inclini a lisi meccanica sesono roteato troppo vigorosamente o se sono esposti all'aria. Una volta che le uova sono state dejellied, è importante procedere rapidamente alle fasi di centrifugazione.
   9. Versare cisteina, e sciacquare via il cappotto gelatina e altri detriti lavando delicatamente le uova in 1x MMR. Versare il tampone attentamente lungo il lato del bicchiere. Ripetere l'operazione due volte o fino a quando la soluzione MMR non è più torbida. Mentre risciacquo con 1x MMR continuano a rimuovere le uova marce con una pipetta di trasferimento.
   10. Eseguire un risciacquo delicato finale con 30 ml 0.1x MMR, e delicatamente versare fuori tanto del buffer come possibile. Anche in questo caso, rimuovere eventuali uova ovviamente cattivi.
3. Imballaggio e Schiacciamento uova da centrifugazione
   NOTA: L'estratto descritto di seguito che viene utilizzato per la degradazione β-catenina è una variante dell'estratto fattore citostatico (metafase II-arrestato). In contrasto con l'estratto a bassa velocità e ad alta velocità utilizzata per gli studi del ciclo cellulare, estratto di velocità intermedia funziona meglio per degradazione β-catenina. IoEstratto nterphase promuove allo stesso modo robusto degrado β-catenina, anche se è più laborioso da preparare.
   1. Aggiungi leupeptina, Pepstatin, miscela Aprotinin (LPA, un inibitore della proteasi) a 10 mcg / ml (diluito da una / soluzione di 10 mg ml di brodo in DMSO) e Citocalasina D a 20 mcg / ml (diluito da un / ml di soluzione 10 mg in DMSO) nei restanti 20 ml di 0.1x MMR.
   2. Aggiungi 0. X MMR contenente LPA e Citocalasina D per le uova lavate, agitare delicatamente e incubare per 5 minuti a 16 ° C.
   3. Trasferire le uova in 16 ° C pre-refrigerati 50 ml provette per centrifuga, permettono le uova di stabilirsi, e rimuovere il tampone residuo dall'alto. Per evitare l'esposizione all'aria, prelevare una piccola quantità di tampone nella pipetta di trasferimento prima di ritirare le uova per il trasferimento. Continuare a trasferire le uova aggiuntivi nelle provette da centrifuga e rimuovere il tampone residuo dalla parte superiore del tubo fino a quando le uova riempiono il tubo da centrifuga all'inizio, che consentirà di massimizzare la resa deiestrarre.
   4. Per imballare le uova, tubi di centrifuga centrifugare a 400 xg per 60 sec a 4 ° C usando un rotore ad angolo fisso. Rimuovere il tampone residuo dalla parte superiore delle provette da centrifuga.
   5. Per la rotazione di frantumazione, centrifugare le provette a 15.000 xg per 5 minuti a 4 ° C.
4. Raccolta Strato citoplasmatica di estratto
   NOTA: Il metodo descritto di seguito differisce dal metodo classico di bucare il lato della provetta per raccogliere lo strato citoplasmatico. Questo protocollo è stato adattato per semplificazione e per l'utilizzo con particolari provette da centrifuga riutilizzabili. Non ci sono notevoli differenze nella cinetica di degradazione β-catenina si trovano con entrambi i metodi. A questo punto dovrebbe essere estratto tenuti freddo durante tutto il processo, e tutti i passaggi devono essere eseguiti a 4 ° C.
   1. Cancellare un buco nello strato lipidico utilizzando P1000 punta della pipetta.
   2. Raccogliere lo strato citoplasmatico (tra lo strato pigmentato buio e il light strato lipidico) con una nuova punta P1000 pipetta in provette da centrifuga pre-refrigerati pulite (Figura 1). Per estratto alta qualità che degrada robustamente β-catenina, minimizzare la quantità di strato pigmentato e lipidico che viene ritirata con lo strato citoplasmatico.
   3. Spin estratto strato citoplasmatico a 15.000 xg per 10 min a 4 ° C e nuovamente raccogliere lo strato citoplasmatico. Ripetere la rotazione ed estrazione 1X. NOTA: L'estratto dovrebbe essere "paglierino". Se esiste una notevole contaminazione con gli strati pigmentati e lipidi, a questo punto, si può ripetere il lancio ancora una volta, sebbene rotazioni eccessive diminuirà la capacità dell'estratto di degradare β-catenina.
   4. Aggiungere LPA e Citocalasina D all'estratto a concentrazioni finali di 10 pg / ml ciascuna. NOTA: Utilizzando il metodo descritto produce una concentrazione abbastanza consistente di proteine ​​totali di circa 50 mg / ml (52,41 ± 5,40 mg / ml, n = 3 preparazioni separate) in Xenopus esempiog estratti.
   5. (Facoltativo) Per i saggi di traduzione, aggiungere capped mRNA (0,1 mg / ml), RNasin (1,5 U / ml), e il mix rigenerazione di energia (2.2.1) e incubare la reazione a temperatura ambiente per 2 ore (per ulteriori informazioni vedi salica et al. ² e Sive et al. ^33). Utilizzare immediatamente estratto tradotto per β-catenina saggi di degradazione o lo snap-congelare in azoto liquido per un uso successivo. NOTA: estratto di appena preparato ha una elevata capacità di tradurre in modo esogeno aggiunto mRNA, ma purtroppo, questa capacità è persa una volta che l'estratto è congelato. Capped mRNA può essere facilmente preparato utilizzando kit commerciali.
   6. Estratto Snap-congelamento in azoto liquido. NOTA: Gli estratti sono memorizzati in piccolo (200 ml) aliquote per uso singolo, perché perdono rapidamente la loro capacità di degradare β-catenina, se ricongelati. Per la conservazione a lungo termine, estratto può essere conservato in azoto liquido. Per la conservazione a breve termine, estratto può essere conservato a -80 ° C, anche se la capacità oEstratto f per degradare β-catenina può essere drasticamente ridotta con la conservazione prolungata a -80 ° C (più di 2 mesi).

2. Preparazione estratto di β-catenina degradazione Assay

1. L'esaurimento da Xenopus estratto
   NOTA: Uno dei principali vantaggi di estratto di Xenopus è la capacità di esaurire facilmente componenti di un percorso e aggiungere precisamente indietro una quantità definita di proteine ​​al fine di determinare i suoi effetti dipendenti dalla dose.
   1. Utilizzare estratto uovo Xenopus preparati al momento o in modo rapido disgelo estratto e posto congelato sul ghiaccio. Eseguire tutte le manipolazioni del freddo.
   2. Aggiungi estratto a 1/10 del volume di anticorpo pellet o perle di affinità (ad esempio, 20 ml di perline pellet all'estratto di 200 ml). Per minimizzare diluizione dell'estratto, ritirare quanto più liquido dalle perline possibili prima aggiunta dell'estratto utilizzando punte di caricamento di gel con lunghe punte affusolate.
   3. Ruotare extract-miscela di sferette a 4 ° C per 1 ora.
   4. Spin mix extract-tallone a 12.600 xg in microcentrifuga a 4 ° C per 30 sec. In alternativa, se si usano perline magnetiche, applica il campo magnetico per raccogliere perline.
   5. Trasferimento impoverito estratto in una provetta da microcentrifuga fresco su ghiaccio. Fare attenzione a non trasferire le perle con l'estratto.
   6. Confermare l'efficienza di esaurimento mediante immunoblotting sia estratto e perline impoverito.
   7. Preparare l'estratto di β-catenina saggio di degradazione, come descritto in 2.2.
2. Ottimizzazione Xenopus Estratto di β-catenina degradazione
   NOTA: degradazione β-catenina in estratto uovo Xenopus è un processo energia-dipendente che esaurisce rapidamente le riserve di ATP endogeni. Di conseguenza, un sistema di rigenerazione di energia è necessaria per mantenere solida la degradazione β-catenina.
   1. Preparare un mix 20x rigenerazione di energia (ER), composto da 150 mm creatina fosfato 20 mM ATP, 600 mg / ml creatinfosfochinasi,e 20 mM MgCl _2. ER dovrebbe essere aliquotati e conservati a -80 ° C. Evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento utilizzando piccole aliquote congelate.
   2. Scongelare rapidamente estratto uovo di Xenopus strofinando il tubo ghiacciato tra le mani. Posizionare il tubo in ghiaccio poco prima che tutti dell'estratto si è sciolto.
   3. Aggiungere 10 ml di mix recupero dell'energia (20x ER) in una aliquota (200 ml) di estratto d'uovo Xenopus. Mescolare accuratamente muovendo rapidamente il vortex tubo e il polso. Pulse-spin e mettere immediatamente in ghiaccio.
   4. (Facoltativo) Il fatturato di β-catenina può essere leggermente migliorata in estratto uovo Xenopus mediante l'aggiunta di ubiquitina (1,25 mg / ml finale). Cicloeximide (0,1 mg / ml finale) può anche essere aggiunto a minimizzare definizione di trascritti endogeni.
   5. Aliquota i volumi adeguati per il dosaggio degrado in tubi microcentrifuga pre-refrigerati su ghiaccio. Per radiomarcati saggi di degradazione β-catenina, ritirare 2-5 estrarre ml per ogni punto di tempo.

3. Marcata radioattivamente β-catenina degrado test in estratto uovo Xenopus

NOTA: Tutti i passaggi devono essere eseguite su ghiaccio, se non diversamente indicato.

1. Preparazione marcata radioattivamente β-catenina
   1. Preparare freschi in vitro per sintesi ^[35 S] metionina-radiomarcato proteina utilizzando kit disponibili in commercio. NOTA: Generazione ³⁵ S-etichettati (emivita 87 giorni) proteine ​​sono facilmente ed efficientemente prodotti utilizzando vitro accoppiato kit di trascrizione-traduzione disponibili commercialmente in. E 'importante che la proteina tradotta è sufficientemente etichettato tale che le variazioni ricambio proteico può essere facilmente visualizzati.
   2. Per confermare radiomarcatura successo, eseguire SDS-PAGE/autoradiography con 0,5 ml di proteina tradotta. Quantificare l'intensità della banda β-catenina radiomarcato utilizzando ImageJ, ImageQuant, o in alternativa software progr quantitativaam. NOTA: La banda proteina β-catenina radiomarcato deve essere chiaramente visibile sulla pellicola nel giro di poche ore (4-6 h).
   3. Snap-congelare la proteina radiomarcato in azoto liquido per la conservazione fino all'uso. Nota: prolungato (> 2 mesi) e aerei gelo / disgelo (maggiore di 2) possono influenzare gravemente la capacità del radiomarcato β-catenina a degradare robusto in estratto uovo Xenopus. Tipicamente, la stabilità delle proteine ​​radiomarcati diminuisce significativamente dopo 1 mese di conservazione a -80 ° C; così, preparata relativamente fresco radioattivo β-catenina dà migliori risultati in questi test di degradazione.
2. Esecuzione di β-catenina degradazione Assay
   1. Aggiungere 1-3 ml (a seconda della potenza del segnale di banda radiomarcato) in vitro tradotte β-catenina (e altre proteine, piccole molecole, ecc in prova) in 20 ml di miscela di reazione Xenopus su ghiaccio. Mescolare accuratamente quickly sfogliando il tubo e un breve impulso di vortex; questo è un passo importante in quanto estratto uovo di Xenopus è molto viscoso, e la miscelazione incompleta interesserà la coerenza dei risultati. Rotazione del polso e posto sul ghiaccio.
   2. Avviare la β-catenina reazione di degradazione spostando i tubi a RT.
   3. Al punto di tempo designato, rimuovere 1-5 ml di campione e miscelare immediatamente con tampone campione SDS (volume 5x) per arrestare la reazione. Per assicurarsi la reazione di degradazione è completamente terminata, tubo film diverse volte e vortice vigorosamente.
   4. Eseguire SDS-PAGE/autoradiography. Eseguire 1 ml equivalenti (~ 50 mg di proteine) di estratto per ogni punto / corsia. Degradazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus dovrebbe essere evidenziata dalla diminuzione dipendente dal tempo in intensità della radioattivo β-catenina banda Figura 2. Quantificare i risultati utilizzando ImageJ, ImageQuant, o altri software di imaging preferito, se necessario.
   5. (Optionale) immergere il gel SDS-poliacrilammide in soluzione di fissaggio (10% acido acetico e 30% di metanolo in acqua distillata) prima dell'essiccamento a diminuire radioattività di fondo e aumentare la qualità dell'immagine.

4. Β-catenina-luciferasi Degradazione Assay in Xenopus estratto Egg

Eseguire tutti i passaggi su ghiaccio, se non diversamente indicato.

1. Preparazione β-catenina-luciferasi
   1. Sintetizzare non radioattivo, luciferasi-tagged β-catenina con il sistema accoppiato trascrizione-traduzione in piena mix di aminoacidi.
   2. Confermare produzione della luciferasi-tag β-catenina misurando l'attività luciferasi 0,5-1 microlitri della reazione. Valutare sfondo luminescenza misurando luminescenza da una miscela di reazione non tradotta. NOTA: kit commerciali multipli sono disponibili per misurare l'attività luciferasi. Luminescenza di lunga durata, tuttavia, funziona particolarmente bene per il ASSA degradoy.
2. Esecuzione di β-catenina-luciferasi degradazione Assay
   1. Scongelare e preparare l'estratto uovo di Xenopus come in 2.2.
   2. Aggiungi in vitro tradotte β-catenina-luciferasi di fusione (da 4.1) in miscela di reazione Xenopus preparata (da 2.2) su ghiaccio e mescolare bene come in 3.2.1. NOTA: L'attività della luciferasi β-catenina che viene aggiunto l'estratto è tipicamente compresa tra 20 - 50.000 unità di luminescenza relativa (RLU) / ml di estratto (basata su misurazioni ottenute da 4.1.2). Segnale di partenza dovrebbe essere di circa 100.000 RLU (2-5 ml della vitro tradotte β-catenina-luciferasi fusione).
   3. Spostare l'estratto di RT per avviare la reazione di degradazione.
   4. Rimuovere una aliquota della reazione al tempo indicato e lo snap-congelare in azoto liquido. NOTA: i campioni in triplo sono generalmente rimosse per analisi per ogni punto di tempo. Estratto congelato può essere conservato a -80 ° C untIl loro sono pronti per essere analizzati.
   5. Campioni Scongelare ghiaccio, campioni di trasferimento a piastre da 96 pozzetti standard bianche su ghiaccio, ed il processo per attività di luciferasi.

Risultati

Uno schema di degradazione β-catenina in estratto uovo Xenopus è mostrato in Figura 2A. ³⁵ S-marcato β-catenina è stata incubata in estratto uovo Xenopus, aliquote (1 ml estratto equivalente) sono stati rimossi al momento opportuno, ed i campioni sono stati sottoposti a SDS-PAGE seguita da autoradiografia. β-catenina degradazione di componenti della via di Wnt è mediata dal sistema ubiquitina-proteasoma ^2, e il degrado di ^[35 S]-radiomarcato β-ca...

Discussione

Estratto uovo di Xenopus è un sistema biochimico robusto per indagare fatturato β-catenina. La concentrazione di β-catenina in estratto uovo di Xenopus è ~ 25 Nm ^2. In condizioni ottimali, l'estratto uovo è in grado di degradare β-catenina ad una velocità di 50-100 nM / hr e metà-massimale a 200 nM ^24. Ci sono diversi passaggi critici per il successo ricostituzione del degrado β-catenina con estratto di uova di Xenopus. Questi includono 1) generare Xenopu...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pregnant mare serum gonadotropin (PMSG)	ProSpec	hor-272-A	Reconstituted with distilled water before use.
Human chorionic gonadotropin	Sigma	CG10-10VL
Potassium chloride	Fisher	BP366-1
Sodium chloride	Research Products International	S23020-5000.0
Magnesium chloride	Fisher	BP214-500
Calcium chloride	Acros Organics	AC42352-5000
HEPES	Fisher	BP310-1
Cysteine	Acros Organics	AC17360-1000
Leupeptin	Sigma	L2884-10MG
Aprotinin	Sigma	A1153-10MG
Pepstatin	Sigma	P4265-5MG
Cytochalasin B	Sigma	C8273-10MG
3 ml syringe: Luer Lock tip	Becton Dickinson	309657
27 G needle	Becton Dickinson	305109
96 well solid white polystyrene microplate, round bottomed	Corning	3605
Steady-Glo luciferase assay system	Promega	E2520	Store long-term at -80 °C, can store for up to 1 month at -20 °C
TNT Sp6 coupled reticulocyte lysate system	Promega	L4600
TNT Sp6 high-yield wheat germ protein expression system	Promega	L3260	Generally higher yield than reticulocyte lysate
EasyTag Express protein labeling mix [S35]	Perkin Elmer	NEG772007MC
Creatine phosphate	Sigma	27920-5G
ATP	Sigma	A2383-5G
Creatine phosphokinase	Sigma	C3755-35KU
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418-50ML
Dual-Glo luciferase assay system	Promega	E2920	Same storage conditions as Steady-Glo
50 ml Centrifuge tubes	Fisher Scientific	0556214D
Sorvall SS-34 fixed angle rotor	Thermo Scientific	28020
115 V 50/60 Hz Minicentrifuge	Fisher Scientific	05-090-128
mMessage mMachine Sp6 kit	Ambion	AM1340
Anti-firefly luciferase antibody	Abcam	ab16466
Anti-GSK3 antibody	BD Transduction Laboratories	610201
FLUOStar Optima	BMG Labtech
Sorvall RC-6 Plus centrifuge	Thermo Scientific
16 °C Incubator	Percival Scientific