الجلوتامين الجريان التصوير باستخدام مجسات مشفرة وراثيا

Summary

هذه المادة سوف تظهر كيفية رصد ديناميات الجلوتامين في الخلايا الحية باستخدام الحنق. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية وسوف تناقش لأجهزة الاستشعار الجلوتامين المشفرة وراثيا.

Abstract

أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا يسمح مراقبة الوقت الحقيقي من الجزيئات البيولوجية في قرار التحت خلوية. أصبحت مجموعة متنوعة هائلة من مثل أجهزة الاستشعار عن الجزيئات البيولوجية المتاحة في السنوات ال 15 الماضية، وأصبح بعض من الأدوات التي لا غنى عنها التي يتم استخدامها بشكل روتيني في العديد من المختبرات.

واحدة من التطبيقات المثيرة من أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا هو استخدام هذه المجسات في التحقيق في عمليات النقل الخلوية. خصائص نقل مثل حركية والخصوصيات الركيزة يمكن التحقيق على المستوى الخلوي، وتوفير الإمكانيات لتحليلات محددة من أنشطة النقل خلية من نوع. في هذه المقالة، سوف نظهر كيف يمكن ملاحظة ديناميات نقل باستخدام ترميز وراثيا استشعار الجلوتامين كمثال على ذلك. التصميم التجريبي والتفاصيل الفنية للإعدادات التجريبية، واعتبارات لتحليلات ما بعد التجريبية سيتم مناقشتها.

Introduction

بسبب التقدم الملحوظ في التقنيات التي تتيح فحص Transcriptome على وبروتيوم على المستوى الخلوي، فقد أصبح من الواضح الآن أن الكيمياء الحيوية والتدفق الناتج من المركبات والأيونات هي غاية خلية من نوع معين. على سبيل المثال، في الكبد الثدييات، تتم تدهور الجلوتامين متتابعة والتوليف في وقت واحد من قبل خلايا والخلايا حول الأوعية البابية محيط بالوريد على التوالي، والتغذية الأمونيوم لدورة اليوريا في نوع من الخلايا السابقة في حين تستهلك الأمونيا الزائدة في الأخير ^1-3. في بعض الحالات، تم الكشف عن عدم التجانس البيوكيميائية كبيرة حتى في واحد "نوع من الخلايا" ^{4، 5.} بالإضافة إلى مثل هذه النوعية المكانية، ومستويات الأيض الخلوية والأيونات هي ديناميكية للغاية (على سبيل المثال، يشير الجزيئات مثل كا ^{2 +} والنيوكليوتيدات الحلقية). الأنماط الزمانية المكانية من المركبات والأيونات غالبا ما تلعب أدوارا حاسمة في نقل الإشارة. Monitoring ديناميات الخلوية من المركبات والأيونات، ومع ذلك، تشكل تحديا فريدا من نوعه. في كثير من الحالات التغير في تركيزات هي سريعة وعابرة، والتي تجسدت في حالة إشارة الجزيئات مثل كا ^{2 +،} والذي يضمحل داخل ~ 20 ميللي ثانية في العمود الفقري شجيري ^6. بالإضافة إلى ذلك، تجزئة المسارات البيوكيميائية داخل وبين خلايا يجعل من الصعب تحديد ديناميات الأيضية والأيونات باستخدام استخراج والعمود اللوني / تقنيات قياس الطيف الكتلي.

وتستخدم الآن على نطاق واسع أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا للجزيئات البيولوجية نظرا لدقة الزمانية المكانية العالية التي يسمح للمجرب لدراسة الديناميات الجزيئية قصيرة الأجل و / أو مجزأة (مراجعة في ^{7 و 8).} يمكن تقريبا أن تقسم هذه المجسات المشفرة وراثيا إلى فئتين؛ أجهزة الاستشعار القائم على كثافة وأجهزة الاستشعار ratiometic. تتكون أجهزة الاستشعار القائم على كثافة عادة من مجال ملزمة والانفلونزاorescent البروتين (FPS)، والمذاب ملزم إلى المجال ملزمة بتغيير شدة الفلورسنت. أجهزة الاستشعار Ratiometic، من ناحية أخرى، وغالبا ما تستفيد من نقل الطاقة الرنين فوستر (الحنق) بين اثنين من ضباط التي تعمل كزوج الحنق. تتكون هذه المجسات من مجال ملزمة واثنين من ضباط، والمذاب ملزم الحث على التغيير في الكفاءة الحنق بين ضباط اثنين. وقد تم تطوير عدد كبير من أجهزة الاستشعار لنواتج الأيض المهمة بيولوجيا والأيونات في العقد الماضي ^{8، 9.}

واحدة من إمكانية إثارة مثل أجهزة الاستشعار التي تقدمها المشفرة وراثيا هو استخدامها في تحليل عالية الدقة من عمليات النقل الغشاء، التي كانت في السابق ليس من السهل للكشف على المستوى الخلوي. أجهزة الاستشعار المرمزة وراثيا تسهيل تحليل آليات النقل مثل الركيزة خصوصية ودرجة الحموضة الاعتماد ^{10، 11.} علاوة على ذلك، في تركيبة مع الدقة الوراثيةources مثل مكتبة رني يبني للكائنات النموذج، أصبح من الممكن الآن لإجراء عمليات تفتيش على نطاق الجينوم لعمليات النقل باستخدام أجهزة استشعار الرواية المرمزة وراثيا. في الواقع، واستخدام المشفرة وراثيا الرصاص استشعار لاكتشاف نقل uncharacterized سابقا في حالات متعددة ^{12 و 13.}

في الآونة الأخيرة، وقد وضعت مختبرنا سلسلة من أجهزة الاستشعار القائمة على الحنق لالجلوتامين. لقد أثبتنا أن مستويات الجلوتامين الخلوية يمكن تصور استخدام مثل أجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين ^10. تتكون هذه المجسات من المانحين الحنق (mTFP1) إدراجها في البروتين البكتيري الجلوتامين ملزمة glnH، ومتقبل الحنق (فينوس) في C-تيرميني من glnH (الشكل 1). الحنق كفاءة هذه المجسات على خفض ملزم من الجلوتامين، مما أدى إلى انخفاض نسبة كثافة متقبل / المانحة. تنظيم عمليات النقل غرامة الجلوتامين مهم في العمليات البيولوجية مثل neurotransmission ¹⁴ و ¹⁵ و الحفاظ على دورة اليوريا في الكبد ^{1، 16، 17.}

نحن هنا تظهر منهجية تحليل أنشطة النقل مع أجهزة الاستشعار عن الحنق الجلوتامين، وذلك باستخدام المجهر مضان واسعة المجال انشاء. الهدف من التجارب المعروضة هنا هي للكشف عن أنشطة نقل في خلية واحدة ودراسة الركيزة خصوصية لنقل أعرب عابر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. إعداد نموذج

ملاحظة: في كثير من الحالات التجارب نضح يغسل جزءا كبيرا من الخلايا، التي يمكن أن تصبح مسألة محبطة. على الرغم من أن ليس من الضروري لجميع خطوط الخلايا، الواجهات الزجاجية غطاء طلاء مع بولي-L-يسين (إضافة 1.0 سم ² ml/25 من الحل 0.01٪ إلى السطح، واحتضان> 5 دقائق، ويغسل مرتين مع المياه خلية ثقافة الصف، وجاف في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية) يعزز التصاق الخلية. أيضا، يكون على بينة من مستوى السلامة الأحيائية (BSL) من خط الخلية المستخدمة، واتباع إجراءات التشغيل القياسية المعتمدة من قبل مكتب الصحة والسلامة البيئية المحلية. في هذه التجربة، واستخدمت خلايا cos7 بسبب انخفاض نشاط النقل الجلوتامين الذاتية (انظر الشكل 4).

1. خلايا cos7 البذور في ~ 70-80٪ confluency في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) + 10٪ مصل العجل الكونية و 100 U / مل البنسلين / الستربتوميسين، إما على العقيمة coverslips الزجاج 25 ملم وضعت في ثقافة 6 جيداطبق أو 8 جيدا الشرائح الزجاجية القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _{2، و} 100٪ الرطوبة لمدة 24 ساعة.
2. تبادل المتوسطة النمو DMEM +10٪ مصل العجل الكونية (أي المضادات الحيوية)، وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. تنمو O / N عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ في 100٪ الرطوبة.
3. إضافة 0.4 ملغ كل من الحمض النووي البلازميد ترميز أجهزة الاستشعار الجلوتامين (pcDNA3.1، تحمل أجهزة الاستشعار FLIPQTV3.0 تحت CMV المروج ¹⁰⁾ وASCT2 mCherry الموسومة ^10-50 مل مصل خالية سائل الإعلام (OPTI-MEM) والمزيج بلطف.
4. إضافة 1 مل من كاشف ترنسفكأيشن إلى 50 مل وسائل الإعلام الحرة المصل. احتضان عند RT لمدة 5 دقائق.
5. مزيج من الحلين التي تحتوي على الحمض النووي (الخطوة 1.3) وكاشف ترنسفكأيشن (الخطوة 1.4)، واحتضان لمدة 20 دقيقة.
6. بلطف إضافة كاشف ترنسفكأيشن على الجزء العلوي من الخلايا والمزيج بلطف بواسطة هزاز الغرفة. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO _2، و 100٪ الرطوبة.
7. بعد 24 ساعة، تبادل المتوسط ​​إلى DMEM + 10٪ مصل العجل الكونية(CCS) + 100 وحدة من البنسلين / الستربتوميسين.
8. يتم تصوير الخلايا 48-72 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

2. التجربة الإرواء

ملاحظة: للحصول على خلايا cos7 المستخدمة في هذه التجربة، تم الاحتفاظ بها وسائل الإعلام ونضح غرفة على RT والمحيط CO ₂ التركيز. ومع ذلك، إذا كانت الخلايا المستخدمة تتطلب أعلى درجات الحرارة وثاني أكسيد الكربون ₂ تركيز الرقابة من أجل البقاء، ساخنة المرحلة المجهر و / أو غرفة البيئية التي ينبغي استخدامها.

1. إعداد نضح عازلة AF (انظر قائمة المواد). نعلق الصمامات إلى 50 مل المحاقن، وإغلاق الصمامات ثم ملئها الحلول نضح. فتح محبس لفترة وجيزة لملء مساحة الرأس في محبس مع المخزن المؤقت.
2. التبديل على 8 قنوات، والجاذبية تغذية نظام الارواء مع قلم رصاص التروية، ثم حدد "وضع دليل" تحت تحديد الخيار وظيفة. وضع حاوية النفايات تحت قلم نضح.
3. يدوياتفعيل الموانئ عن طريق الضغط على الأرقام المقابلة وملء الأنابيب باستخدام 10 مل حقنة تحتوي على الماء، ومن ثم إغلاق المنفذ. مرة واحدة تمتلئ الموانئ مع الماء، وتعيين الحقن التي تحتوي على مخازن AF على المنفذ 1-6 من نظام التروية، ومن ثم فتح الصمامات. فتح المنافذ مرة أخرى لتحل محل المياه في الأنابيب مع المخازن المؤقتة. وينبغي أن يكون معدل تدفق حوالي 0.8 مل / دقيقة.
4. الصحافة بإلغاء مرة واحدة على وحدة تحكم نضح العودة إلى القائمة "تحديد دالة". تبديل إلى "تحرير برنامج" خيار، ثم اكتب في بروتوكول أشار نضح في الجدول 1. حفظ البرنامج الارواء.
5. تأخذ الخلايا من الحاضنة. يغسل مرتين مع العازلة التروية، ثم قم بتعيين الخلايا على المسرح. ربط نظام نضح إلى غرفة. إذا تم استخدام غرفة مفتوحة، وإنشاء مضخة أخرى أن يزيل الحل نضح من الغرفة.
6. فتح برنامج Slidebook. بدء شريحة جديدة.
   ملاحظة:الإجراء التالي هو محددة لبرنامج Slidebook، ولكن يمكن أيضا برامج أخرى مثل MetaFluor ونيس، العنصر استخدامها لنوع من التصوير وصفها هنا. نظريا التجارب لا يمكن أن يؤديها استخدام أي من البرامج التي تتيح التصوير الوقت بالطبع، وتسلسلات الصور يمكن تحليلها بعد تجريبيا باستخدام برنامج مثل يماغيج (http://rsbweb.nih.gov/ij/) أو فيجي (http:// على / fiji.sc / فيجي). ومع ذلك، والبرمجيات التي تسمح للرصد في الوقت الحقيقي من نسبة متقبل / المانحة مفيد للغاية.
7. جبل الشريحة على خشبة المسرح المجهر الفلورسنت. العثور على خلايا المشترك، معربا عن أجهزة الاستشعار وASCT-mCherry باستخدام مجموعات التصفية المناسب (انظر قائمة المواد) تحت وظيفة "FOCUS". ضبط مكاسب بالنقر على "كاميرا" التبويب وانزلاق شريط الانزلاق تحت عنوان "مكاسب". أيضا، وضبط الإعداد مرشح كثافة محايدة من محايد مرشح الكثافة القائمة المنسدلة. ملاحظة: إذا لم المكعب التصفية تشمل عامل تصفية العين، لا تستخدم قطعة العين منذ الشورتي الطول الموجي ضوء الإثارة هو ضار للعيون. استخدام شاشة الكمبيوتر للعثور على الخلايا بدلا من ذلك.
8. الحصول على صور من الخلايا with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (يتم تحديد المرشحات في قائمة المواد). انقر فوق "التقاط صورة"، ثم في إطار اقتناء وتحديد المرشحات التي سوف يتم استخدامها. انقر فوق الزر "اختبار" لضبط الوقت التعرض عن طريق كتابة وقت التعرض المطلوب في المربع بجانب إعدادات التصفية. ملاحظة: جميع القنوات الثلاث بحاجة إلى أن يتعرض لنفس الطول. عند ضبط المعلمات التصوير، واتخاذ الحنق التغيير الكفاءة المتوقعة وأضعاف زيادة في الاعتبار: على سبيل المثال، إذا كان من المتوقع كفاءة الحنق لترتفع 2 أضعاف خلال التجربة، ينبغي تعديل المعلمات التصويرلذا يجب أن تكون شدة _م القابل _{السابقين} المانحة في حالة الراحة <50٪ من القيمة القصوى التي يمكن تسجيلها من قبل الصك، حتى لا تصبح هذه القناة المشبعة أثناء التجربة. وينبغي أن يكون إشارة من الخلايا المسمى على الأقل أعلى ثلاث مرات من تلك التي في المنطقة الخلفية.
9. رسم المنطقة ذات الاهتمام باستخدام أداة المناطق في البرنامج. بدلا من ذلك، وهي وظيفة البرنامج لتحديد بكسل أعلاه كثافة معينة يمكن استخدامها، ومن ثم تحويلها إلى المناطق. للقيام بذلك، انقر فوق قناع - الجزء، ثم حرك شريط انزلاق لتسليط الضوء على المناطق المطلوب.
10. حدد "الفاصل الزمني" في مربع نوع إمساك، ثم حدد الفاصل الزمني (10 ثانية في هذه التجربة) والنقاط الزمنية للتجربة.
11. رسم المنطقة في منطقة دون أية خلايا الفلورسنت. ويستخدم هذا المجال لطرح الخلفية. الحق فوق منطقة تعادل ومن ثم تعيينها كخلفية. ملاحظة: من الناحية المثالية، الخلايا التي توجدر معربا عن أجهزة استشعار يجب أن تستخدم المنطقة الخلفية لحساب كل من تألق ذاتي والإزهار خلفية الكشف عنها بواسطة الكاميرا. إذا لم تتوافر مثل هذه الخلايا في مجال الرأي، على الأقل في المنطقة دون الخلايا ينبغي أن تستخدم لحساب مضان الخلفية.
12. حدد البرنامج المطلوب تحت عنوان "اختر وظيفة - برامج تشغيل" الخيار. تبديل لبرنامج حفظ (راجع الخطوة 2.3)، ثم ضرب على وحدة تحكم ENTER الارواء. الآن يتم تحميل البرنامج، وسوف تصل إلى أي مفتاح بدء الارواء.
13. ضمان نضح وتجربة التصوير يبدأ في نفس الوقت عن طريق النقر على زر "ابدأ" في التقاط نافذة في نفس الوقت الضغط على مفتاح على وحدة تحكم الارواء.
    ملاحظة: من المستحسن لتسجيل timepoint حيث تم تبادل الحلول (وهذا يمكن أن يتم ذلك باستخدام "ملاحظات" وظيفة، وجدت ضمن علامة التبويب الاستحواذ).
14. أداء نضح نفس البروتوكول باليودنانوغرام الخلايا معربا عن جهاز استشعار أنه من المتوقع أن تكون إما مشبعة أو غير منضم تحت شرط التجريبية.
    ملاحظة: هنا، FLIPQTV3.0_1.5μ، الذي المشبعة تحت حالة تجريبية، ويستخدم كعنصر تحكم، الشكل 6 هذه التجارب السيطرة ضرورية لتأكيد أن هذا هو بسبب التغير الفعلي في الركيزة التغيير الكفاءة والحنق لا. بسبب التغير في العوامل الأخرى مثل درجة الحموضة الخلوية.

3. تحليل ما بعد التجربة

1. فحص عينة إذا حدث الانجراف أثناء التجربة. رسم المناطق ذات الاهتمام (ROI) ليالي على الصورة التي اتخذت في timepoint 0، ثم حرك شريط انزلاق في الجزء العلوي من النافذة التصوير ومعرفة ما اذا كان الخلايا تسقط من رويس في الصور التي التقطت في وقت لاحق في التجربة.
2. إذا كانت الإجابة بنعم، ثم استخدم وظيفة تتبع لتصحيح الانحراف من جانب أول، وخلق أقنعة حول الخلايا عن طريق تحديد قناع - الجزء، ثم حرك الخط الذي يحدد لقطع HIGhlight المناطق التي تحتوي على الخلايا. تتبع المناطق بالضغط قناع - تتبع الجسيمات - تتبع الجسيمات الأساسية.
3. إعادة رسم رويس والمنطقة الخلفية عند الضرورة.
4. تصدير كثافة متوسط ​​رويس على مدى التجربة. انقر الاحصائيات - تصدير - البيانات / نسبة timelapse.
5. عندما الكفاءة الحنق والكمي لتركيز الركيزة ليست ضرورية، رسم مدار الساعة من نسبة كثافة _(بحكم المانحة _م والقابل، / _{م السابقين} المانحة المانحة) كوكيل لديناميات الركيزة. لتحديد تركيز عصاري خلوي، وحساب الحد الأقصى والحد الأدنى من التغيير النسبة (أي في تشبع وغياب الركيزة، على التوالي)، Δr _ماكس - Δr _دقيقة، من خلال الانحدار غير الخطية من Δratio (Δr) مع المعادلة التالية:
   Δr = [S] / (K + _د [S]) × (Δr ماكس - Δr _دقيقة) + Δr _دقيقة
   حيث [S] هو تركيز الركيزة في العصارة الخلوية. ويتم احتساب القيم Δr _دقيقة تم الحصول عليها، والتشبع (S) من أجهزة الاستشعار في Δr على النحو - باستخدام Δr _ماكس
   S = (Δr - Δr _دقيقة) / (Δr _ماكس - _دقيقة Δr)
   S يمكن تحويلها إلى مزيد من تركيز الركيزة [S] باستخدام المعادلة التالية:
   S = [S] / (K + _د [S])
   ملاحظة: يجب أن تكون كثافة القابل _{السابقين} القابل قناة _م تآمر أيضا لفحص ما إذا كانت حالة تجريبية أثرت في مضان من متقبل مباشرة.
6. عندما لوحظ الانجراف خط الأساس بسبب الصورة تبيض، إجراء تصحيح خط الأساس. للقيام بذلك، رسم شدة المانحة ومتقبل على مر الزمن (الشكل 5A). ثم تحديد timepoints المستخدمة في اله الأساسية، وفقا للتأخير في نظام الارواء ونشاط النقل معينة الخلية (الشكل 5B).
7. حساب المناسب polynominal التي تصف أفضل خط الأساس. ثم، وتطبيع كثافة الخام من كل timepoint إلى خط الأساس (الشكل 5C). حساب نسبة كثافة _(بحكم المانحة _م والقابل، / _{م السابقين} المانحة المانحة) من شدة المانحة ومتقبل تطبيع.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

يتم تمثيل نموذجي التجارب الوقت بالطبع في الشكل 2. في هذه التجارب، وأجهزة الاستشعار الحنق الجلوتامين مع الانتماءات من 8 ملي (FLIPQTV3.0_8m، الشكل 2A و 2B) و 100 ميكرومتر (FlipQTV3.0_100 μ C و D) والتعاون مع أعربت واجبة مبادل الأحماض الأمينية في خلايا ASCT2 ¹⁸ ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

نجاح تجارب التصوير يعتمد على عدد قليل من العوامل الهامة. واحد من هذه العوامل هو تقارب من أجهزة الاستشعار المستخدمة، كما نوقش أعلاه. التركيز المطلق من الركيزة في مقصورة التحت خلوية من الفائدة، ومع ذلك، غالبا ما يكون غير معروف. لذا نوصي تحاول أجهزة استشعار متعددة متداخ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala