谷氨酰胺通量成像使用基因编码的传感器

摘要

本文将展示如何利用FRET监测谷氨酰胺动态活细胞。遗传编码的传感器允许生物分子的亚细胞分辨率的实时监控。实验设计，实验设置的技术细节，并考虑后期的实验分析将用于基因编码的谷氨酰胺的传感器进行讨论。

摘要

遗传编码的传感器允许生物分子的亚细胞分辨率的实时监控。一个巨大的品种，例如传感器，生物分子在过去15年中面世，其中一些成为了经常被用在许多实验室不可缺少的工具。

其中一个基因编码传感器的令人兴奋的应用之一是在调查细胞转运过程中使用这些传感器。转运如动力学和底物特异性的属性可以在细胞水平进行调查，为运输活动的细胞类型特异性分析的可能性。在这篇文章中，我们将演示如何转运动力学可以用基因编码的谷氨酰胺传感器为例进行观察。实验设计，实验设置的技术细节，和考虑后的实验分析将进行讨论。

引言

由于技术的显着进步，使考试的转录组和蛋白质组在细胞水平上的，它现在已经很清楚，生物化学和由此产生的通量代谢物和离子是高度细胞类型特异性。例如，在哺乳动物的肝脏，顺序谷氨酰胺降解和合成是同时进行由门静脉周围的细胞和静脉周围的细胞分别，同时消耗过量的氨在后者的^1-3喂养铵到尿素循环在前者的细胞类型。在某些情况下，显著生化异质性被检测，即使在一个单一的"小区类型^"4，5。除了 ​​这样的空间特异性，代谢物和离子的细胞水平是高度动态的（ 例如，信号分子，如Ca ^{2 +，}环 ​​核苷酸）。代谢物和离子的时空模式往往能起到关键作用的信号转导。 Monitoring代谢物和离子的细胞动力学，但是，提出了独特的挑战。在许多情况下，其浓度的变化是快速和短暂的，通过信号转导分子如Ca ^{2 +，}内〜20毫秒的树突棘^6，该衰变的情况举例说明。此外，内部和之间的细胞的生化途径的分隔使得难以用萃取和柱色谱/质谱技术定量代谢物和离子的动力学。

遗传编码的传感器，用于生物分子现在广泛由于高时空分辨率，允许实验者研究短命和/或隔离的分子动力学使用^（7评论^，8）。这些基因编码的传感器大致可以分为两大类;基于强度的传感器和ratiometic传感器。强度为基础的传感器通常由一个结合结构域和一个感orescent蛋白（FPS），以及溶质结合的结合结构域改变的荧光强度。 Ratiometic传感器，在另一方面，往往采取的促进共振能量转移（FRET）2的FP充当FRET对的优势。这些传感器包括一个结合结构域和两个FP的，与溶质结合诱导在2的FP之间的FRET效率的变化。大量的传感器，用于生物学上重要的代谢物和离子已被开发，在过去十年中^8,9。

其中由该基因编码的传感器所提供的令人兴奋的可能性是他们在膜转运过程的高分辨率分析，这在以前是不容易察觉在细胞水平上的使用。遗传编码的传感器便利的运输机制，如底物特异性和pH依赖性^10，11中的分析。此外，在同遗传水库组合OURCES如RNA干扰的库构建的模式生物，它现在可以进行全基​​因组搜索使用基因编码的传感器新颖的运输过程。事实上，利用基因编码的传感器导致的以前未知转运多例^12，13的发现。

最近，我们实验室已经开发出一系列基于FRET的传感器谷氨酰胺。我们已经证明，细胞谷氨酰胺水平可以使用这样的FRET谷氨酰胺传感器¹⁰被可视化。这些传感器由在C-末端glnH的（ 图1）一个FRET供体（mTFP1）插入到细菌谷氨酰胺结合蛋白glnH和FRET受体（金星）的。这些传感器中的FRET效率下降时的谷氨酰胺结合，导致受体/供体的强度比的降低。谷氨酰胺转运过程的精细调节是重要的生物过程，如neurotransmission ^14,15和尿素循环的维持在肝脏^{1，16，17。}

在这里，我们将展示分析运输活动与FRET传感器谷氨酰胺，使用宽场荧光显微镜下建立的方法。这里显示的实验的目的是检测在单个细胞中转运活动，并检查一个瞬时表达转运蛋白的底物特异性。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

1，样品制备

注:在许多情况下灌注实验洗去细胞的显著部分，它可以成为一个令人沮丧的问题。虽然没有必要对所有的细胞系，涂层覆盖玻璃表面用聚-L-赖氨酸（添加0.01％的溶液1.0 ml/25厘米²的表面，孵育> 5分钟，用细胞培养级水洗涤两次，干燥生物安全柜）提高细胞的粘附。同时，要注意使用的细胞系的生物安全水平（BSL）的，并按照批准地方环境健康和安全办公室的标准作业程序。在该实验中，转染的COS7细胞用于由于低内源性谷氨酰胺转运活性（参见图4）。

1. 种子COS7细胞在〜在Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM）70％-80％汇合度+10％宇宙的小牛血清和100 U / ml青霉素/链霉素，无论是在无菌25毫米盖玻片放置在6孔培养菜或8孔玻璃底的幻灯片。在37℃，5％CO _2，100％湿度下24小时。
2. 更换生长培养基，以DMEM +10％宇宙的小牛血清（不含抗生素），根据制造商的方案。成长O / N在_{37℃，5％CO2，100％}湿度。
3. 将每个质粒DNA的0.4毫克编码谷氨酰胺传感器（染pcDNA3.1，携带FLIPQTV3.0传感器在CMV启动子^10）和的mCherry标记ASCT2 ¹⁰至50ml无血清培养基（OPTI-MEM），轻轻混匀。
4. 加入1 ml转染试剂至50ml无血清培养基。在室温下孵育5分钟。
5. 混合含有DNA（步骤1.3）和转染试剂（步骤1.4）的两种溶液并孵育20分钟。
6. 轻轻地加在细胞上的顶端的转染试剂和由摆动腔轻轻混匀。孵育24小时后，在37℃，5％CO _2，100％湿度。
7. 24小时后，更换培养基，以DMEM +10％宇宙小牛血清（CCS）+ 100单位青霉素/链霉素。
8. 细胞成像48-72小时后转染。

2，灌注实验

注意:对于在该实验中使用COS7细胞，灌注介质和腔室保持在室温和环境CO ₂浓度。然而，如果正在使用的电池需要较高的温度和CO ₂浓度控制为生存，加热的显微镜载物台和/或环境室应该被使用。

1. 准备灌注缓冲自动对焦（见材料清单）。附加旋塞至50ml注射器，关闭旋塞然后填写与灌注液。打开水龙头一个短暂的时期，以填补与缓冲活塞的头部空间。
2. 切换的8通道，重力进料灌注系统与灌注铅笔，然后选择在选择功能选项"手动模式"。放置一个废物容器下的灌注铅笔。
3. 手动通过按下相应的数字激活的端口，用10 ml注射器含有水补油管，然后关闭该端口。一旦端口被装满了水，设置包含缓冲区自动对焦灌注系统的端口1-6的注射器，然后打开旋塞。再次打开的端口，以取代水与缓冲管。流速应为约0.8毫升/分钟。
4. 按取消一次灌注控制器返回到"选择功能"菜单。切换到"编辑程序"选项，然后在灌注协议表1所示。保存的灌注程序。
5. 取出来的细胞培养箱中。与灌注缓冲液洗两次，然后将细胞在舞台上。灌注系统连接到室内。如果一个开放室使用，另设泵，去除室内的灌注液。
6. 打开Slidebook软件。开始一个新的幻灯片。
   注意:下面的过程是特定于Slidebook软件，但其他软件如MetaFluor和萨 - 要素也可用于此处所述的成像的类型。理论上实验可以使用允许时间 - 过程成像任何软件来执行，并且图像序列可以被分析后的实验使用软件如ImageJ的（http://rsbweb.nih.gov/ij/）或斐济（呻/ fiji.sc /斐济）。然而，软件，允许的受体/供体比实时监测是非常有用的。
7. 安装滑道到荧光显微镜阶段。发现细胞共表达的传感器和ASCT-mCherry的使用适当的过滤器集（请参阅材料清单）下的"聚焦"功能。通过点击"相机"选项卡和"收益"项下滑动滑动条调节增益。此外，从调节中性密度滤镜下拉菜单中的中性密度滤镜设置。注意:如果过滤器多维数据集不包括眼滤镜，不要用眼睛片，因为肖尔的T波长的激发光对眼睛有害。使用电脑屏幕找到细胞来代替。
8. 获得的细胞图像with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels （过滤器在材料列表中指定）。单击"图像捕捉"，然后在采集窗口，指定将要使用的过滤器。点击"测试"按钮，通过在框中键入所需的曝光时间旁边的过滤器设置来调整曝光时间。注:所有三个通道需要被暴露于相同的长度。当调节摄像参数，取预期的FRET效率的变化和折叠增加考虑:例如，如果预期的FRET效率在实验过程中向上去2倍，摄像参数应调整从而使供体_的前接受器_烯在静息状态下的强度应<可被仪器记录在最大值的50％，从而使信道不会成为在实验过程中达到饱和。从标记细胞信号应至少比背景区域高3倍。
9. 使用该软件区域工具绘制一个地区的利益。可替换地，软件功能来选择上述一定强度的像素都可以使用，然后转换成的区域。要执行此操作，请单击面膜 - 分部，然后移动滑动条来突出显示所需的区域。
10. 选择在拍摄类型框中的"时间流逝"，然后指定时间间隔（10秒在这个实验）和实验时间点。
11. 在一个区域画出一个区域，没有任何荧光细胞。这个区域是用于背景减法。用鼠标右键单击绘制的区域，然后将其设置为背景。注意:在理想情况下，细胞是不吨表达该传感器应作为背景区域占两者的自体荧光和照相机所检测到的背景荧光。如果没有这样的细胞可在视场中，至少在没有细胞的区域应该被用来解释背景荧光。
12. 选项​​ - 在"运行程序选择功能"选择所需的程序。切换到保存的程序（见步骤2.3），然后打的灌注控制器上的ENTER键。现在，这个程序被加载，并且击中任何键将开始灌注。
13. 确保灌注和成像实验开始的同时按一下在同一时间按下灌注控制器上的按键，在拍摄窗口中的"开始"按钮。
    注:建议记录那里的解决方案进行了交流（这可以通过使用"票据"功能，采集选项卡中找到来完成）的时间点。
14. 执行相同的灌注协议USI纳克细胞表达，预计将是饱和的或者未结合的实验条件下的传感器。
    注意:在这里，FLIPQTV3.0_1.5μ，这是在实验条件下饱和的，被用作对照， 图6这样的对照实验是必要的，以确认该FRET效率的变化是由于在基板上的实际变化，而 ​​不是。由于在其它参数，如细胞内pH的变化。

3，后期实验分析

1. 检查如果在实验过程中发生样品漂移。绘制感兴趣区域（ROI）区域S在0时间点拍摄的图像上，然后移动在成像窗口顶部的滑动杆，并检查电池掉出的ROI在后来的实验中拍摄的图像。
2. 如果是的话，那么使用跟踪功能来校正漂移，首先，在细胞周围建立口罩通过选择面膜 - 分类，然后将它指定截止到HIG行hlight区域含有细胞。追踪区域单击面膜 - 粒子跟踪 - 基本粒子跟踪。
3. 必要时重新绘制的ROI和背景区域。
4. 导出的感兴趣区的平均强度比实验的过程。点击统计 - 出口 - 比/慢速拍摄数据。
5. 当底物浓度的FRET效率和量化是没有必要的，画出作为基材的动态代理的强度比（ 供体_前接受器_烯 ，/供体_的前施主_烯 ）的时间过程。以确定细胞内浓度，计算出的最大和最小的比率变化（ 即，在所述基板的饱和和不存在，分别），ΔR _最大 - ΔR _分钟 ，由Δratio（ΔR）与下面的等式的非线性回归:
   ΔR= [S] /（K _D + [S]）×（ΔR _{最大值- ΔR 分钟 ）+△ 分钟
   其中[S]是底物浓度在胞质溶胶中。使用ΔR 最大 -传感器得到ΔR 最小值 ，饱和度（S）在给定的ΔR被计算为
   S =（ΔR - ΔR 分钟 ）/（ΔR 最大 - ΔR 分钟 ）
   S可进一步被转化成使用以下等式的底物浓度[S]:
   S = [S] /（K D + [S]）
   注: 接受器前受体EM信道的强度应同时绘制研究实验条件是否影响受体的直接荧光。}
6. 当基线漂移由于光漂白观察，进行基线校正。要做到这一点，画出供体和受体随着时间的强度（ 图5A）。然后确定用于日的时间点ë基线，根据在灌注系统中的延迟和特定的细胞（ 图5B）的转运活性。
7. 计算多项式拟合最能说明基线。然后，归一化的原始强度从每个时间点与基线（ 图5C）。从标准化的供体和受体的强度计算强度比（ 捐赠_前受体_他们，/捐赠者捐赠者_{除外EM）。}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

典型时程实验示于图2，在这些实验中，FRET谷氨酰胺传感器为8毫米（FLIPQTV3.0_8m， 图2A和2B）和100μM（FlipQTV3.0_100μC和D）的亲和性被共表达以强制性氨基酸器ASCT2 ¹⁸ COS7细胞^10。谷氨酰胺流入被检测作为给体（mTFP1）和受体（金星）（ 图2A和2C）之间的荧光强度比的变化。谷氨酰胺在另一衬底（丙氨酸）的存在下的流出也?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

成像实验的成功取决于几个关键因素。其中一个因素是传感器的使用，如上面所讨论的亲和力。在感兴趣的亚细胞区室中衬底的绝对浓度，但是，常常是未知的。因此，我们建议您尝试多种传感器与交错的亲和力，以找到一个所需的实验条件下效果最好。例如，在我们的情况下，我们转染的COS7细胞中谷氨酰胺传感器，1.5μ，100μ，2分，和8米（ 图3和数据未显示）。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala