유전자 인코딩 된 센서를 사용 글루타민 유출 영상

Julien Besnard; Sakiko Okumoto

doi:10.3791/51657

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요약

이 문서에서는 FRET을 이용하여 살아있는 세포에서 글루타민의 역학을 모니터링하는 방법을 보여줍니다. 유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석을위한 고려 사항은 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서에 대해 설명한다.

초록

유전자에 의해 코딩 센서는 세포 이하의 해상도에서 생물학적 분자의 실시간 모니터링을 허용한다. 생물학적 분자와 같은 센서의 엄청난 다양성은 많은 실험실에서 일상적으로 사용되는 필수 도구가 된 일부는, 지난 15 년 동안 사용 가능하게되었다.

유전자에 의해 코딩 센서 흥미로운 애플리케이션 중 하나는 셀룰러 전송 프로세스를 조사하고 이러한 센서의 사용이다. 이러한 반응 속도 및 기판 특이성 등의 수송의 속성 수송 활동의 세포 타입 별 분석에 대한 가능성을 제공하는 세포 수준에서 조사 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 수송 역학 예를 들어 유전자에 의해 코딩 글루타민 센서를 사용하여 관찰 할 수있는 방법을 보여줍니다. 실험 설계, 실험 설정의 기술적 인 세부 사항, 사후 실험 분석에 대한 고려 사항이 논의 될 것이다.

서문

때문에 세포 수준에서의 전 사체와 단백체의 검사를 할 수 있습니다 기술의 놀라운 발전으로, 지금은 생화학 및 대사 물질과 이온의 결과 유출이 높은 셀 타입의 특정 분명되고있다. 예를 들어, 포유 동물의 간장에 순차 글루타민 분해 및 합성 후자 ^1-3에 과량의 암모니아를 소비하면서 전 셀 분류 우레아주기 암모늄 수유 각각 문맥 주위 세포와 perivenous 세포에 의해 동시에 수행된다. 일부의 경우, 상당한 이질성 생화학 심지어 단일 "셀 ^{분류"4, 5에서} 검출된다. 이러한 공간적 특이성 이외에, 대사 물질 및 이온의 세포 수준 (예 : 칼슘 ^{2 +} 및시 클릭 뉴클레오티드 같은 신호 분자, 예) 매우 동적이다. 대사와 이온의 시공간 패턴은 종종 신호 전달에 중요한 역할을한다. 엠대사와 이온의 세포 역학을 onitoring 그러나, 독특한 도전을 제기. 많은 경우에있어서 농도 변화는 빠른 과도 같은 돌기 쪽이 ⁶ ~ 20 밀리 초 내에 소멸 칼슘 ^{2 +와} 같은 신호 전달 분자의 경우에 의해 예시된다. 또한, 세포 내와 사이 생화학 적 경로의 구획화 어려운 추출 및 컬럼 크로마토 그래피 / 질량 분석 기술을 이용하여 대사 물질 및 이온의 역학을 정량화 할 수있다.

생물학적 분자 유전자 인코딩 된 센서가 널리 인해 실험이 단명 및 / 또는 구획 된 분자 역학 연구 할 수있는 높은 시공간 해상도로 사용됩니다 ^{(7에서 검토를, 8).} 이들 유전자에 의해 코딩 센서는 크게 2 종류로 나눌 수있다; 강도 기반 센서 및 센서 ratiometic. 강도 기반 센서는 일반적으로 결합 도메인과 독감으로 구성orescent 단백질 (FPS) 및 결합 도메인에 결합하는 용질은 형광 강도를 변경합니다. Ratiometic 센서는 반면에, 종종 FRET 쌍으로서 기능이 FPS 사이 포스터 공명 에너지 전달 (FRET)을 활용. 이러한 센서는 결합 도메인과 두 FPS로 구성하고, 바인딩 용질이 FPS 간의 FRET 효율의 변화를 유도한다. 생물학적으로 중요한 대사 물질 및 이온 용 센서의 다수는 지난 십 ^{(8, 9)에서} 개발되었다.

이러한 유 전적으로 인코딩 된 센서들에 의해 제공되는 흥미로운 가능성 중 하나는 이전에 세포 수준에서 검출하기 쉽지 않았다 막 수송 과정의 고해상도 분석에서의 사용이다. 유전자에 의해 코딩 센서는 기질 특이성하여 pH 의존성 ^{(10, 11)} 등의 반송기구의 분석을 용이하게한다. 또한, 유전 입술과 함께의 RNAi 라이브러리 모델 생물에 대한 생성 ources 같은, 그것은 유전자에 의해 코딩 센서를 사용하여 새로운 전송 프로세스에 대한 게놈 전체 검색을 수행 할 수있게되었습니다. 실제로, 다수의 경우 ^{12, 13} 이전에 uncharacterized 수송의 발견에 유전자 인코딩 센서 리드의 사용.

최근에, 우리의 실험실은 글루타민 FRET 기반 센서의 시리즈를 개발했습니다. 우리는 셀룰러 글루타민 농도는 FRET 글루타민 센서 ^(10)를 이용하여 가시화 될 수 있다는 것을 증명하고있다. 이 센서는 glnH의 C-말단 (그림 1)에서 세균 글루타민 결합 단백질 glnH에 삽입 된 FRET 기증자 (mTFP1) 및 FRET 수용체 (금성)으로 구성되어 있습니다. 이들 센서의 FRET 효율성 셉터 / 도너 강도 비의 감소의 결과로, 글루타민의 결합시 감소. 글루타민 전송 프로세스의 미세 조정은 neurotransm 같은 생물 학적 과정에 중요ission ^{(14), (15)} 및 간 ^{1, 16, 17의} 우레아주기의 유지.

여기서 우리는 광 시야 형광 현미경 셋업을 사용하여, 글루타민 FRET 센서로 전송 활동을 분석하는 방법을 보여준다. 여기에 도시 된 실험의 목표는 하나의 셀에 수송 활동을 검출하고 일시적으로 발현 트랜스 포터의 기질 특이성을 검토한다.

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프로토콜

1. 샘플 준비

주 : 많은 경우 관류 실험 초조 문제가 될 수있는 세포의 상당한 부분을 씻어 흘려. 폴리-L-라이신 모든 세포 라인, 코팅 커버 유리 표면에 (표면에 0.01 % 용액의 1.0 ml/25 cm ^2를 추가 할 필요는 없습니다 만, 세포 배양 등급 물로 2 회 세척> 5 분을 배양하고, 건조 생물 안전 캐비닛) 세포 접착을 향상시킵니다. 또한, 사용되는 세포주의 바이오 안전성 레벨 (BSL)을 인식하고, 지역의 환경 보건 및 안전 사무실에서 승인 한 표준 운영 절차를 따르십시오. 이 실험에서, COS7 세포 (도 4 참조)로 인해 낮은 내인성 글루타민 수송 활성에 사용 하였다.

둘 베코의 수정 이글 중간 (DMEM) 70-80 % 년 자랄 + 10 % 우주의 혈청과 100 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신, 하나 6 자 문화에 배치 멸균 25mm 유리 커버 슬립에 ~에 씨 COS7 세포요리 또는 8 잘 유리 바닥 슬라이드. 37 ° C에서 5 % CO _2, 24 시간 동안 100 % 습도에서 품어.
제조 업체의 프로토콜에 따라, DMEM +10 % 우주의 혈청 (항생제)에 성장 배지를 교환한다. 100 % 습도에서 37 ° C, 5 % CO _2에서 O / N을 성장.
(CMV 프로모터 ^10에서 FLIPQTV3.0 센서를 수행 한 pcDNA3.1) 글루타민 센서와 ^{10 ~} 50 ㎖의 혈청이없는 미디어 (OPTI-MEM) mCherry - 태그 ASCT2를 인코딩 0.4 mg의 플라스미드 DNA를 각각 추가하고 부드럽게 섞는다.
50 ㎖의 혈청이없는 미디어로 형질 전환 시약 1 ㎖를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 품어.
DNA (단계 1.3) 및 형질 전환 시약 (단계 1.4)를 포함하는 두 용액을 혼합하고 20 분 동안 품어.
조심스럽게 세포의 상단에 형질 전환 시약을 추가하고 챔버를 흔들어 가볍게 섞는다. 37 ° C에서 5 % CO _2, 100 % 습도에서 24 시간 동안 배양한다.
24 시간 후, DMEM + 10 %의 우주 송아지 세럼 매체를 교환페니실린 / 스트렙토 마이신 (CCS) + (100)는 유닛.
세포는 48 ~ 72 시간 후 - 형질을 이미지하고 있습니다.

2. 관류 실험

주 :이 실험에서 사용 된 COS7 세포의 경우, 관류 매체와 챔버는 RT로 유지하고 주위 CO ₂ 농도 하였다. 사용되는 세포가 더 높은 온도와 CO ₂ 농도 제어 생존 가열 현미경 스테이지 및 / 또는 환경 챔버를 필요로하는 경우에는, 사용되어야한다.

관류 버퍼 AF를 준비 (재료의 목록을 참조하십시오.) , 50 ㎖ 주사기에 콕 마개를 부착 콕 마개를 닫고 다음 관류 솔루션을 입력합니다. 버퍼 크레인의 머리 공간을 채우기 위해 짧은 기간 동안 코크를 엽니 다.
관류 연필로 8 채널, 중력 공급 관류 시스템에 전환 한 다음 선택 기능 옵션에서 "수동 모드"를 선택합니다. 재관류 연필에서 폐기물 용기를 놓습니다.
수동으로대응하는 숫자를 눌러 포트를 활성화 및 물을 함유하는 10 ㎖ 주사기를 사용하여 호스를 기입하고 포트를 닫는다. 포트가 만수되면 관류 시스템의 포트 1-6에서 버퍼 AF를 함유하는 주사기를 설정하고 스톱 코크를 연다. 버퍼와 튜브에 물을 대체하기 위해 다시 포트를 엽니 다. 유속은 약 0.8 ㎖ / 분이어야한다.
눌러 다시 "기능 선택"메뉴로 이동 관류 컨트롤러에 한 번 취소 할 수 있습니다. "편집 프로그램"옵션으로 전환 한 후 관류 프로토콜은 표 1에 입력합니다. 관류 프로그램을 저장합니다.
인큐베이터 밖으로 세포를 가져 가라. 관류 버퍼로 두 번 세척 한 후 무대에서 세포를 설정합니다. 챔버에 관류 시스템을 연결합니다. 개방 챔버가 사용되는 경우, 챔버로부터 관류 액을 제거하는 또 다른 펌프를 설치했다.
Slidebook 소프트웨어를 엽니 다. 새 슬라이드를 시작합니다.
참고 :다음 절차는 Slidebook 소프트웨어에 고유 있지만, 이러한 MetaFluor 및 니스 요소로 다른 소프트웨어는 여기에 설명 된 영상의 종류에 사용할 수 있습니다. 이론적 실험 시간 코스 이미징을 허용하는 소프트웨어를 사용하여 수행 될 수 있으며, 이미지 시퀀스는 ImageJ에 (http://rsbweb.nih.gov/ij/) 또는 피지와 같은 소프트웨어를 사용하여 후 실험적으로 분석 할 수있다 (http:/ / fiji.sc / 피지). 그러나, 억 셉터 / 도너 비율의 실시간 모니터링을 허용 소프트웨어는 매우 유용하다.
형광 현미경의 무대에 슬라이드를 장착합니다. 적절한 필터 세트를 사용하여 센서와 ASCT - mCherry 공동 발현하는 세포를 찾아 "FOCUS"기능에서 (재료의 목록을 참조하십시오). "카메라"탭을 클릭하고 "이득"에서 슬라이드 막대를 밀어 이득을 조정합니다. 또한, 감광 필터 드롭 다운 메뉴에서 감광 필터 설정을 조정합니다. 참고 : 필터 큐브 아이 필터를 포함하지 않는 경우, 간결시기 눈 조각을 사용하지 않는T 파장의 여기 광은 눈에 해 롭습니다. 대신 세포를 찾기 위해 컴퓨터 화면을 사용합니다.
세포의 이미지를 얻기 with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (필터 재료의 목록에 명시되어있다). "이미지 캡처"를 클릭 한 다음 인수 창에서 사용하고자하는 필터를 지정합니다. 필터 설정 옆에있는 상자에 원하는 노출 시간을 입력하여 노출 시간을 조정하는 "TEST"버튼을 클릭합니다. 주 : 모든 세 개의 채널이 동일한 길이에 대해 노출 될 필요가있다. 촬상 파라미터를 조정하면, 예상 FRET 효율 변화를 가지고 고려 증가 겹 : FRET 효율 실험 중에 2 배 갈 것으로 예상되는 경우, 예를 들어, 영상 파라미터는 조정되어야해당 채널이 실험 기간 동안 포화 상태가되지 않도록 정지 상태에서 기증자 _{전 수락 엠의} 강도는, <악기에 의해 기록 될 수있는 최대 값의 50 % 들도록. 표지화 된 세포에서의 신호는 배경 영역에서보다 적어도 세 배 더 높아야한다.
소프트웨어의 영역 도구를 사용하여 관심 영역을 그립니다. 대안 적으로, 특정 강도 이상 화소를 선택하는 소프트웨어 기능을 이용할 수 있고, 그 다음 영역으로 변환된다. 이렇게하려면 마스크를 클릭 - 세그먼트 다음 원하는 영역을 강조하는 슬라이드 막대를 이동합니다.
캡처 형식 상자에서 "시간 경과"를 선택하고 간격 (이 실험에서는 10 초)하고 실험을위한 시간 지점을 지정합니다.
모든 형광 세포없이 지역의 영역을 그립니다. 이 영역은 배경 빼기에 사용됩니다. 마우스 오른쪽 단추로 그린 영역을 클릭 한 다음 배경으로 설정합니다. 참고 : 더 있습니다 이상적으로, 세포를센서를 발현 t는 자기 형광 및 카메라에 의해 검출 배경 개화 모두 고려하여 배경 영역으로 사용되어야한다. 그러한 세포가 시야에 사용할 수없는 경우 세포가없는 적어도 영역은 배경 형광을 고려하여 사용되어야한다.
옵션 - "실행 프로그램 기능 선택"에서 원하는 프로그램을 선택합니다. 저장된 프로그램 (단계 2.3 참조)로 전환 한 후 관류 컨트롤러에 입력하고 Enter 키를 누르십시오. 이제 프로그램이로드되고, 임의의 키를 타격하는 재관류를 시작합니다.
관류를 확인하고 촬상 실험 관류 컨트롤러 키를 누르는 것과 동시에 캡쳐 윈도우에서 "시작"버튼을 클릭함으로써 동시에 시작한다.
참고 :이 솔루션은 (이것은 인수 탭 내에있는 "주의 사항"기능을 사용하여 수행 할 수 있습니다) 교환 된 평가시기를 기록하는 것이 좋습니다.
같은 관류 프로토콜 USI를 수행실험 조건 하에서, 포화 또는 언 바운드가 될 것으로 예상된다 센서를 발현하는 세포를 겨.
참고 : 여기에, 실험 조건 하에서 포화 FLIPQTV3.0_1.5μ는, 제어, 그림 6과 같이 사용되는 이러한 제어 실험은 FRET 효율의 변화가없는 기판의 실제 변화에 기인하고 있음을 확인하기 위해 필요합니다. 때문에 이러한 세포의 pH와 같은 다른 매개 변수의 변화에.

3. 후 실험 분석

샘플 드리프트는 실험 기간 동안 발생했는지 검사합니다. 관심 영역 (ROI)을 그립니다 평가시기 0에서 찍은 이미지들, 그 이미지 창의 상단에있는 슬라이드 막대를 이동하고 세포 실험에서 나중에 촬영 한 이미지의 ROI를 열외하는지 확인합니다.
그렇다면, 다음 마스크를 선택하여 세포의 주위에 마스크를 만들고, 처음으로 드리프트를 보정하기 위해 추적 기능을 사용하는 경우 - 세그먼트를, 다음 HIG에 컷오프를 지정하는 라인을 밀어영역이 세포를 포함 hlight. 마스크를 클릭하여 영역을 추적 - 입자 추적 - 기본 입자 추적.
필요한 경우 ROI를 다시 그릴과 배경 영역.
실험의 과정을 통해 로아의 평균 강도를 보냅니다. 통계를 클릭합니다 - 수출 - 비율 / 인터벌 데이터.
기질 농도의 FRET 효율과 정량화가 필요없는 경우, 기판의 역학의 프록시 강도 비 (기증자 _{전 수락 엠} / 기증 _{전 기증자 EM)의} 시간 과정을 줄거리. 세포질 농도를 결정하기 위해, 최대 및 (각각 기판의 포화 및 부재에서, 즉,,) 최소한의 비율 변화, ΔR _최대 계산 - 다음과 같은 식에 Δratio (ΔR)의 비선형 회귀 분석에 의한 ΔR의 _분 :
ΔR = [S] / (K _d 개 + [S]) × (ΔR _{최대 - ΔR _분) + ΔR _분
여기서 [S] 세포질에서 기질 농도이다. ΔR _최대 사용 - 주어진 ΔR에서 센서의 ΔR의 _분 얻은 값, 채도 (S)는 다음과 같이 계산됩니다
S는 = (ΔR - ΔR _분) / (ΔR _최대 - ΔR _분)
S는 또한 다음 식을 이용하여 기질 농도 [S]로 전환 될 수있다 :
S = [S] / (K _d 개 + [S])
주 : 수락 _전 수락 _{엠 채널의} 강도도 실험 조건이 직접 수용체의 형광에 영향을 여부를 검사 그릴 수 있어야합니다.}
때문에 사진 표백에 대한베이스 라인 드리프트가 관찰 될 때,베이스 라인 보정을 수행합니다. 이렇게하려면, 시간이 지남에 따라 기증자와 수용체의 농도 (그림 5A)을 플롯. 그런 번째 사용 timepoints 식별E 기준선, 관류 시스템 지연과 특정 셀 (도 5b)의 전송 활동에 따라.
최고의 기준을 설명하는 다항식 피팅을 계산합니다. 그런 다음,베이스 라인 (그림 5C)로 각각 평가시기에서 원시 강도를 정상화. 정규화 된 기증자와 수용체 강도에서 강도 비 (기증자 _{전 수락 엠} / 기증 _{전 기증자 EM)을} 계산합니다.

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결과

전형적인 시간 코스 실험 그림 2에 표시됩니다.이 실험에서, 8 개 mm (FLIPQTV3.0_8m, 그림 2A와 2B) 및 100 μM (FlipQTV3.0_100 μ C 및 D)의 친화력과 글루타민 센서를 FRET와 공동으로 표현했다 COS7 세포 ^(10)의 필수 아미노산 교환기 ASCT2 ^18. 글루타민의 유입은 도너 (mTFP1) 및 억 셉터 (금성) (도 2A 및 2C) 간의 형광 강도 비의 변화로서 검출된다. 다?...

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토론

영상 실험의 성공은 몇 가지 중요한 요소에 따라 달라집니다. 이러한 요인 중 하나는 전술 한 바와 같이, 사용 된 센서의 궁합이다. 또한 세포 내 구획에서 기판의 절대 농도는, 그러나, 종종 알려지지 않았다. 그러므로 우리는 원하는 실험 조건에 따라 가장 적합한을 찾을 수 있도록 지그재그 친화 여러 센서를 시도하는 것이 좋습니다. 예를 들어, 우리의 경우에 우리는 1.5μ 함께 글루타민 센서를 ...

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공개

공개 아무것도 없다.

감사의 말

이 작품은 NIH 교부금 1R21NS064412, NSF 교부금 1,052,048 및 제프리스 기념 트러스트 부여 J-908에 의해 지원되었다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO₂Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO₃, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala

참고문헌

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