Glutamine Flux Imaging Utilisation de capteurs génétiquement codés

Résumé

Cet article va vous montrer comment contrôler la dynamique de la glutamine dans les cellules vivantes en utilisant FRET. Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutées pour les capteurs de glutamine codés génétiquement.

Résumé

Capteurs codés génétiquement permettent un suivi en temps réel de molécules biologiques à une résolution subcellulaire. Une grande variété de ces capteurs pour des molécules biologiques est devenu disponible dans les 15 dernières années, dont certains est devenu un outil indispensable qui sont utilisés en routine dans de nombreux laboratoires.

Une des applications intéressantes de capteurs codés génétiquement est l'utilisation de ces capteurs dans l'étude des processus de transport cellulaires. Propriétés des transporteurs tels que la cinétique et des spécificités de substrat peuvent être étudiés au niveau cellulaire, offrant des possibilités d'analyses spécifiques de type cellulaire des activités de transport. Dans cet article, nous allons démontrer comment la dynamique du transporteur peuvent être observés en utilisant le capteur de glutamine génétiquement codé comme un exemple. Conception expérimentale, les détails techniques des paramètres expérimentaux, et des considérations pour les analyses post-expérimentaux seront discutés.

Introduction

Grâce à des progrès remarquables dans les technologies qui permet l'examen du transcriptome et le protéome au niveau cellulaire, il est devenu clair que la biochimie et le flux résultant des métabolites et des ions sont de type cellulaire spécifique hautement. Par exemple, dans le foie de mammifère, de la dégradation séquentielle de la glutamine et de la synthèse sont effectuées simultanément par les cellules et les cellules périportes périveineux respectivement, l'alimentation ammonium dans le cycle de l'urée dans le premier type de cellule, tout en consommant un excès d'ammoniac dans celui-ci ^3.1. Dans certains cas, l'hétérogénéité biochimique significatif est détecté, même dans une seule "de type cellulaire" ^{4, 5.} En plus d'une telle spécificité spatiale, les niveaux cellulaires de métabolites et des ions sont très dynamiques (par exemple, des molécules telles que Ca ^{2 +} et nucleotides cycliques de signalisation). Les patrons spatiotemporels de métabolites et des ions jouent souvent un rôle crucial dans la transduction du signal. MSUIVI dynamique cellulaire des métabolites et des ions, cependant, poser défi unique. Dans de nombreux cas, le changement dans les concentrations sont rapide et transitoire, comme en témoigne le cas de molécules de signalisation tels que Ca ^{2 +,} qui se désintègre dans ~ 20 ms dans les épines dendritiques ^6. En outre, le cloisonnement des voies biochimiques dans et entre les cellules, il est difficile de quantifier la dynamique des métabolites et des ions en utilisant une extraction et une Chromatographie sur colonne / des techniques de spectrométrie de masse.

Capteurs codés génétiquement pour les molécules biologiques sont maintenant largement utilisés en raison de la résolution spatio-temporelle élevée qui permet à l'expérimentateur d'étudier la dynamique moléculaire de courte durée et / ou compartimentées (revue en ^{7, 8).} Ces capteurs codés génétiquement peuvent être grossièrement divisées en deux catégories; capteurs fondés sur l'intensité et des capteurs ratiometic. Capteurs basées sur l'intensité sont généralement constitués d'un domaine de liaison et une grippeorescent protéine (PF), et la liaison au domaine de liaison soluté modifie l'intensité de fluorescence. Capteurs Ratiometic, d'autre part, profitent souvent de transfert d'énergie par résonance Foster (FRET) entre deux points focaux qui fonctionnent comme une paire de FRET. Ces capteurs sont constitués d'un domaine de liaison et deux points focaux, et le soluté de liaison induit le changement de l'efficacité de FRET entre les deux points focaux. Un grand nombre de capteurs pour les métabolites et des ions biologiquement importantes ont été développées dans la dernière décennie, ^{8, 9.}

Une des possibilités offertes par excitation de ces capteurs codés génétiquement est leur utilisation dans l'analyse à haute résolution du processus de transport de la membrane, ce qui était jusqu'à présent pas facile à détecter au niveau cellulaire. Capteurs codés génétiquement faciliter l'analyse des mécanismes de transport tels que la spécificité du substrat et de la dépendance au pH ^{10, 11.} De plus, en combinaison avec les res génétiquesources comme la bibliothèque de l'ARNi construit pour des organismes modèles, il est désormais possible d'effectuer des recherches sur le génome entier pour de nouveaux procédés de transport à l'aide de capteurs codés génétiquement. En effet, l'utilisation d'organismes génétiquement codé la sonde à la découverte des transporteurs non définies auparavant dans plusieurs cas ^{12, 13.}

Récemment, notre laboratoire a développé une série de capteur à base de FRET pour la glutamine. Nous avons démontré que les niveaux de glutamine cellulaire peuvent être visualisés à l'aide de tels capteurs FRET de glutamine ^10. Ces capteurs sont constitués d'un donneur de FRET (mTFP1) inséré dans une protéine bactérienne liant glnH glutamine, et un accepteur de FRET (venus) à l'extrémité C-terminale de glnH (Figure 1). FRET efficacité de ces capteurs diminuer lors de la liaison de la glutamine, ce qui entraîne la diminution du rapport d'intensité accepteur / donneur. Régulation fine des processus de transport de la glutamine est important dans les processus biologiques tels que neurotransmission ^{14, 15} et le maintien de cycle de l'urée dans le foie ^{1, 16, 17.}

Ici, nous montrons la méthodologie de l'analyse des activités de transport de capteurs FRET pour la glutamine, l'aide d'un grand champ microscope à fluorescence set-up. Le but d'expériences montrées ici sont pour détecter les activités de transporteur dans une seule cellule et pour examiner la spécificité de substrat d'un transporteur exprimé de manière transitoire.

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Protocole

1. Préparation de l'échantillon

Remarque: Dans de nombreux cas expériences de perfusion lavent une partie importante de cellules, ce qui peut devenir un problème frustrant. Bien que n'étant pas nécessaire pour toutes les lignées cellulaires, les surfaces de verre de revêtement de couverture avec la poly-L-lysine (ajouter 1,0 ml pour 25 cm ² de solution à 0,01% de la surface, incuber> 5 min, laver deux fois avec de l'eau de qualité culture cellulaire et sec l'enceinte de sécurité biologique) améliore l'adhérence cellulaire. Aussi, soyez conscient du niveau de biosécurité (BSL) de la lignée cellulaire utilisée, et suivez la procédure d'exploitation standard approuvé par le bureau local de la santé et de la sécurité de l'environnement. Dans cette expérience, les cellules COS7 ont été utilisés en raison de la faible activité de transport de la glutamine endogène (voir figure 4).

1. Graine cellules cos7 à ~ 70-80% de confluence dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) + 10% de sérum de veau cosmique et 100 U / ml de pénicilline / streptomycine, soit sur des lamelles de verre stériles de 25 mm placés dans la culture à 6 puitsplat ou des lames de verre à fond de 8 puits. Incuber à 37 ° C, 5% CO _2, à 100% d'humidité pendant 24 heures.
2. Échanger le milieu de culture DMEM à 10% de sérum de veau cosmique (sans antibiotiques), selon le protocole du fabricant. Cultivez O / N à 37 ° C, 5% de CO ₂ à 100% d'humidité.
3. Ajouter 0,4 mg chacune d'un ADN plasmidique codant pour le capteur de la glutamine (pcDNA3.1, transportant capteur de FLIPQTV3.0 sous promoteur CMV ¹⁰⁾ et le ASCT2 mCherry à étiquette ¹⁰ à 50 ml de milieu sans sérum (Opti-MEM) et mélanger doucement.
4. Ajouter 1 ml de réactif de transfection à 50 ml du milieu sans sérum. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
5. Mélanger les deux solutions contenant de l'ADN (étape 1.3) et un réactif de transfection (étape 1.4) et incuber pendant 20 min.
6. Ajouter délicatement le réactif de transfection sur des cellules et mélanger doucement en faisant basculer la chambre. Incuber pendant 24 heures à 37 ° C, 5% CO _2, à 100% d'humidité.
7. Après 24 h, échanger le milieu de DMEM + 10% de sérum de veau cosmique(CCS) + 100 unités de pénicilline / streptomycine.
8. Les cellules sont imagés 48-72 heures après la transfection.

2. Perfusion Expérience

Remarque: Pour les cellules cos7 utilisées dans cette expérience, les milieux de perfusion et de la chambre ont été maintenus à la température ambiante et la concentration du CO ₂ ambiant. Toutefois, si les cellules utilisées nécessitent une température plus élevée et le CO ₂ de contrôle de la concentration pour la survie, la platine du microscope chauffé et / ou une chambre de l'environnement doivent être utilisés.

1. Préparer la perfusion AF tampon (Voir la liste des matériaux). Attacher les robinets à seringues de 50 ml, fermer les robinets puis les remplir avec les solutions de perfusion. Ouvrir le robinet pendant une brève période pour remplir l'espace de tête dans le robinet avec le tampon.
2. Allumez le 8 canaux, système de perfusion par gravité avec un crayon de perfusion, puis sélectionnez "mode manuel" sous Sélectionnez l'option de fonction. Placez un conteneur à déchets sous le crayon de perfusion.
3. Manuellementactiver les ports en appuyant sur les chiffres correspondants et remplir les tuyaux à l'aide seringue de 10 ml contenant de l'eau, puis fermer le port. Une fois que les ports sont remplis avec de l'eau, mettre les seringues contenant des tampons AF sur le port 1-6 de système de perfusion, puis ouvrez les robinets. Ouvrir les orifices de nouveau pour remplacer l'eau dans le tube avec les tampons. Le débit devrait être d'environ 0,8 ml / min.
4. Appuyez sur annuler, une fois sur le contrôleur de perfusion pour retourner au menu "Select Function". Basculez l'option "Editer un programme", puis tapez dans le protocole de perfusion indiqué dans le tableau 1. Enregistrez le programme de perfusion.
5. Prenez les cellules de l'incubateur. Laver deux fois avec le tampon de perfusion, puis définissez les cellules sur la scène. Connectez le système de perfusion à la chambre. Si une chambre ouverte est utilisée, mettre en place une autre pompe qui élimine la solution de perfusion de la chambre.
6. Ouvrez le logiciel Slidebook. Lancer une nouvelle diapositive.
   Note:procédure suivante est spécifique au logiciel Slidebook, mais d'autres logiciels comme MetaFluor et Nis-élément peut également être utilisé pour le type de formation d'image décrit ici. Théoriquement expériences peuvent être réalisées en utilisant n'importe quel logiciel qui permet l'imagerie temps bien sûr, et les séquences d'images peuvent être analysées après expérimentalement en utilisant un logiciel tel que ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou Fidji (http:/ / fiji.sc / Fidji). Cependant, un logiciel qui permet de surveiller en temps réel des taux accepteur / donneur est très utile.
7. Monter la lame sur la platine du microscope fluorescent. Trouver les cellules co-exprimant le capteur et ASCT-mCherry utilisant des filtres appropriés (voir la liste des matériaux) sous la fonction "FOCUS". Régler le gain en cliquant sur l'onglet "Caméra" et en faisant glisser le curseur sous "gain". En outre, régler le filtre de densité neutre à partir du menu déroulant de filtre de densité neutre. Remarque: Si le cube de filtre ne comprend pas un filtre pour les yeux, ne pas utiliser les yeux morceaux depuis shorT-longueur d'onde de lumière d'excitation est dangereux pour les yeux. Utilisez l'écran de l'ordinateur pour trouver les cellules à la place.
8. Acquérir des images de cellules with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (Filtres sont indiqués dans la liste des matériaux). Cliquez sur "Capture d'image", puis dans la fenêtre d'acquisition, spécifiez les filtres qui vont être utilisés. Cliquez sur le bouton "TEST" pour régler le temps d'exposition en tapant le temps d'exposition souhaité dans la boîte à côté des réglages de filtre. Note: Tous les trois canaux doivent être exposés à la même longueur. Lors du réglage des paramètres d'imagerie, prendre le FRET changement de l'efficacité attendue et multiplication en compte: par exemple, s'il est prévu que l'efficacité de FRET de monter 2 fois au cours de l'expérience, les paramètres d'imagerie doivent être ajustésde sorte que l'intensité du donneur accepteur _{ex em} à l'état de repos doit être <50% de la valeur maximale pouvant être enregistrée par l'instrument, de sorte que le canal ne devienne pas saturé pendant l'expérience. Signal à partir des cellules marquées doit être au moins trois fois supérieure à celle de la région d'arrière-plan.
9. Dessiner une région d'intérêt en utilisant les régions outil dans le logiciel. Alternativement, une fonction logicielle pour sélectionner pixels au-dessus certaine intensité peut être utilisé, et ensuite converti en régions. Pour ce faire, cliquez sur Masque - Segment, puis déplacez la barre coulissante pour mettre en évidence les zones souhaitées.
10. Sélectionnez «laps de temps» dans la boîte de type de capture, puis spécifiez l'intervalle (10 secondes dans cette expérience) et des points de temps pour l'expérience.
11. Dessiner une région dans une zone sans cellules fluorescentes. Cette zone est utilisée pour soustraction de fond. Faites un clic droit de la région dessiné, puis le définir comme un arrière-plan. Note: Idéalement, les cellules qui ne sontT exprimant les capteurs doit être utilisée comme la région d'arrière-plan afin de tenir compte à la fois pour l'autofluorescence et la fluorescence d'arrière-plan détectée par la caméra. En l'absence de telles cellules sont disponibles dans le champ de vision, au moins une région sans les cellules doit être utilisé pour tenir compte de la fluorescence de fond.
12. Sélectionnez le programme souhaité sous "Sélectionner une fonction - Exécuter les programmes" option. Basculer vers le programme enregistré (voir l'étape 2.3), puis appuyez sur ENTRER sur le contrôleur de perfusion. Maintenant, le programme est chargé, et en appuyant sur n'importe quelle touche pour démarrer la perfusion.
13. Assurer la perfusion et l'expérience d'imagerie commencer en même temps en cliquant sur le bouton "Démarrer" dans la fenêtre de capture en même temps que d'appuyer sur une touche sur le contrôleur de perfusion.
    Note: Il est recommandé d'enregistrer le point de temps où les solutions ont été échangés (ce qui peut être fait en utilisant la fonction «NOTES», trouvés dans l'onglet d'acquisition).
14. Effectuez la même perfusion protocole USIng cellules exprimant un capteur qui est prévu pour être saturé ou non lié à la condition expérimentale.
    Remarque: ici, FLIPQTV3.0_1.5μ, qui est saturé dans la condition expérimentale, est utilisé en tant que contrôle, la figure 6 Ces expériences de contrôle sont nécessaires pour confirmer que le changement de l'efficacité de FRET est due à la variation réelle du substrat et non. en raison de la variation des autres paramètres tels que le pH cellulaire.

3. Analyse de post-expérience

1. Examiner si la dérive de l'échantillon a eu lieu au cours de l'expérience. Dessiner des régions d'intérêt (ROI) s sur l'image prise au point de temps 0, puis déplacez la barre coulissante en haut de la fenêtre d'imagerie et de vérifier si les cellules tombent des ROI dans les images prises plus tard dans l'expérience.
2. Si oui, alors utiliser la fonction de suivi pour corriger la dérive d'abord, la création de masques autour des cellules en sélectionnant Masque - Segment, puis faites glisser la ligne qui spécifie le seuil de highlight les régions contenant des cellules. Suivre les régions en cliquant sur Masque - suivi de particules - suivi de particules de base.
3. Redessiner le ROI et la région de fond si nécessaire.
4. Exporter l'intensité moyenne des ROI au cours de l'expérience. Cliquez sur Statistiques - Export - Ratio données / timelapse.
5. Lorsque l'efficacité de FRET et la quantification de la concentration en substrat n'est pas nécessaire, tracer le cours du temps du rapport d'intensité (Donateur _ex accepteur _{de lui,} / donateurs _{ex em} donateurs) comme un proxy de la dynamique du substrat. Pour déterminer la concentration cytosolique, calculer la variation maximale et minimale du rapport (c'est à dire, lors de la saturation et de l'absence de substrat, respectivement), Ar _max - _min Ar, par régression non-linéaire de Δratio (Ar) avec l'équation suivante:
   Ar = [S] / (K + _d [S]) x (Ar _{max - Ar min) + Ar min
   où [S] est la concentration du substrat dans le cytosol. En utilisant les Ar max - AR valeurs min obtenus, la saturation (S) du capteur à Ar donné est calculée comme
   S = (Ar - Ar min) / (Ar max - min Ar)
   S peut en outre être convertie en la concentration de substrat [S] à l'aide de l'équation suivante:
   S = [S] / (K + d [S])
   Remarque: l'intensité du canal de lui accepteur ex accepteur doit être aussi comploté pour examiner si la condition expérimentale influencé la fluorescence de l'accepteur directement.}
6. Quand une dérive de base en raison de la photo-blanchiment est observé, effectuer une correction de base. Pour ce faire, tracer les intensités de donneur et de l'accepteur dans le temps (Figure 5A). Ensuite, identifier les points de temps utilisés pour ee ligne de base, en fonction du retard dans le système de perfusion et l'activité de transport de la cellule particulière (figure 5B).
7. Calculer un raccord polynôme qui décrit le mieux la ligne de base. Ensuite, normaliser l'intensité brute de chaque heure à la ligne de base (figure 5C). Calculer le ratio de l'intensité (Donateur _ex accepteur _{de lui,} / donateurs _{ex em} donateurs) à partir des intensités de donneur et accepteur normalisés.

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Résultats

Temps-cours des expériences typiques sont représentées sur la figure 2. Lors de ces expériences, les capteurs FRET de la glutamine ayant des affinités de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, la figure 2A et 2B) et 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C et D) ont été co-exprimés avec une condition de l'échangeur d'acides aminés ASCT2 ¹⁸ dans des cellules COS7 ^10. Afflux de glutamine est détecté en tant que changement de rapports d'intensité de fluores...

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Discussion

Le succès d'expériences d'imagerie dépend de quelques facteurs essentiels. L'un de ces facteurs est l'affinité de capteurs utilisés, comme discuté ci-dessus. Concentration absolue du substrat dans le compartiment sous-cellulaire d'intérêt, toutefois, est souvent inconnue. Par conséquent, nous vous recommandons d'essayer plusieurs capteurs ayant des affinités quinconce pour trouver celui qui fonctionne le mieux dans la condition expérimentale souhaitée. Par exemple, dans notre cas, nou...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala