Glutamina Flux imagem usando sensores codificados geneticamente

Resumo

Este artigo irá demonstrar como monitorar a dinâmica de glutamina em células vivas usando FRET. Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos para sensores de glutamina codificados geneticamente.

Resumo

Sensores geneticamente codificados permitir o monitoramento em tempo real de moléculas biológicas em uma resolução subcelular. Uma enorme variedade de tais sensores para moléculas biológicas tornou-se disponível nos últimos 15 anos, algumas das quais se tornaram ferramentas indispensáveis, que são utilizados rotineiramente em muitos laboratórios.

Uma das aplicações interessantes de sensores geneticamente codificados é a utilização destes sensores para investigar os processos de transporte celular. Propriedades de transportadores, tais como a cinética e especificidades de substrato pode ser investigada a um nível celular, oferecendo possibilidades para análises específicas do tipo de célula de actividades de transporte. Neste artigo, vamos demonstrar como a dinâmica do transportador pode ser observado usando sensor de glutamina geneticamente codificado como um exemplo. O delineamento experimental, os detalhes técnicos das configurações experimentais, e considerações para análises pós-experimentais serão discutidos.

Introdução

Devido ao notável progresso em tecnologias que permite o exame do transcriptoma e proteoma em um nível celular, que agora se tornou claro que a bioquímica eo fluxo resultante de metabólitos e íons são altamente celular do tipo específico. Por exemplo, no fígado dos mamíferos, a degradação da glutamina sequencial e síntese são realizadas simultaneamente por células periportais e células perivenosa respectivamente, alimentando de amónio para o ciclo da ureia no primeiro tipo de células, consumindo o excesso de amoníaco no último ^1-3. Em alguns casos, a heterogeneidade bioquímica significativa é detectada até mesmo num único "tipo de célula" ^{4, 5.} Em adição a esta especificidade espacial, os níveis de metabolitos celulares e iões são altamente dinâmico (por exemplo, moléculas de sinalização, tais como Ca ^{2 +} e os nucleótidos cíclicos). Os padrões espaço-temporais de metabólitos e íons muitas vezes desempenham papéis críticos na transdução de sinal. MCOMPANHAMENTO dinâmica celular de metabólitos e íons, no entanto, representam desafio único. Em muitos casos, a alteração nas concentrações são rápida e transiente, exemplificada pelo caso de as moléculas de sinalização, tais como Ca ^{2 +,} que se decompõe no ~ 20 ms em espinhas dendríticas ^6. Além disso, a compartimentação das vias bioquímicas dentro e entre as células, torna difícil de quantificar a dinâmica de metabolitos e iões utilizando extracção e cromatografia em coluna / técnicas de espectrometria de massa.

Sensores codificados geneticamente para moléculas biológicas são agora amplamente utilizados, devido à alta resolução espaço-temporal que permite ao pesquisador a estudar a dinâmica molecular de curta duração e / ou compartimentada (revisada em ^{7, 8).} Estes sensores codificados geneticamente podem ser divididos em duas categorias; Os sensores baseados em intensidade e sensores ratiometic. Os sensores baseados intensidade consistem tipicamente de um domínio de ligação e um gripeproteína orescent (PQ), e a ligação ao domínio de ligação ao soluto muda a intensidade de fluorescência. Sensores Ratiometic, por outro lado, muitas vezes, beneficiar de Transferência de Energia de Ressonância Foster (FRET) entre dois PQ que funcionam como um par de FRET. Estes sensores consistem de um domínio de ligação e dois PQ, e a ligação de soluto induz a alteração na eficiência da TERF entre as duas PQ. Um grande número de sensores para os metabolitos e os iões biologicamente importantes foram desenvolvidos na década passada ^{8, 9.}

Um dos excitante possibilidade oferecida por tais sensores geneticamente codificados é a sua utilização na análise de alta-resolução dos processos de transporte de membrana, o que anteriormente não foi fácil de detectar, ao nível celular. Sensores geneticamente codificados facilitar a análise dos mecanismos de transporte, como a especificidade de substrato e dependência do pH ^{10, 11.} Além disso, em combinação com os res genéticosONTES como a biblioteca de RNAi constrói para organismos modelo, agora é possível realizar pesquisas do genoma para processos de transporte inovadoras utilizando sensores codificados geneticamente. Com efeito, a utilização de microrganismos geneticamente codificado sensor de chumbo para a descoberta de transportadores anteriormente não caracterizadas em vários casos, ^{12, 13.}

Recentemente, o nosso laboratório tem desenvolvido uma série de sensores baseados em FRET para a glutamina. Demonstrámos que os níveis de glutamina celular pode ser visualizada utilizando tais sensores FRET glutamina ^10. Estes sensores consistem de um dador FRET (mTFP1) inserido numa proteína de ligação a glutamina bacteriana glnH, e um aceitador FRET (Vénus) na extremidade C-terminais de glnH (Figura 1). FRET eficiência destes sensores diminuir após a ligação de glutamina, o que resulta na diminuição da relação da intensidade de aceitador / dador. Boa regulação de processos de transporte de glutamina é importante nos processos biológicos, tais como neurotransmissão ^{14, 15} e a manutenção do ciclo da ureia no fígado ^{1, 16, 17.}

Aqui nós mostramos a metodologia de análise de actividades de transporte com sensores Fret para glutamina, usando uma grande-campo microscópio de fluorescência set-up. O objectivo das experiências mostradas aqui são para detectar actividades de transportador numa única célula e para examinar a especificidade do substrato de um transportador transitoriamente expressa.

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Protocolo

1. Exemplo de Preparação

Nota: Em muitos casos, experimentos de perfusão lavar uma parte significativa de células, o que pode se tornar um problema frustrante. Embora não seja necessário para todas as linhas celulares, as superfícies de vidro com tampa de revestimento de poli-L-Lisina (adicionar 1,0 ml/25 ^cm2 de solução de 0,01% para a superfície, incubar> 5 min, lavar duas vezes com água de grau de cultura de células, e seco em a cabine de segurança biológica) aumenta a adesão celular. Além disso, estar ciente do nível de biossegurança (BSL) da linha celular utilizada, e siga o procedimento operacional padrão aprovado pelo escritório local de saúde e segurança ambiental. Neste experimento, as células COS 7 foram utilizadas devido à baixa atividade de transporte de glutamina endógena (veja a Figura 4).

1. As células COS7 semente em ~ 70-80% de confluência em Meio Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro de vitelo cósmica e 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ou em lamelas de vidro estéreis 25 milímetros colocadas na cultura de 6 poçosprato ou 8 poços lâminas com fundo de vidro. Incubar a 37 ° C, 5% de CO _{2, com} 100% de humidade durante 24 horas.
2. Trocar o meio de crescimento para DMEM +10% de soro de vitelo cósmica (sem antibióticos), de acordo com o protocolo do fabricante. Grow O / N a 37 ° C, 5% de CO ₂ a 100% de humidade.
3. Adicionar 0,4 mg de cada ADN de plasmídeo que codifica o sensor de glutamina (pcDNA3.1, carregando o sensor FLIPQTV3.0 sob promotor de CMV ¹⁰⁾ e o ASCT2 mCherry marcado com ¹⁰ a 50 ml de meio isento de soro (meio OPTI-MEM) e misturar suavemente.
4. Adicionar 1 ml de reagente de transfecção de 50 ml de meio isento de soro. Incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
5. Misturar as duas soluções contendo ADN (passo 1.3) e reagente de transfecção (passo 1.4) e incubar durante 20 min.
6. Adicionar cuidadosamente o reagente de transfecção em cima das células e misturar gentilmente pelo balanço da câmara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO _2, com 100% de humidade.
7. Após 24 horas, trocar o meio de DMEM + 10% Cosmic Calf Serum(CCS) + 100 unidades de penicilina / estreptomicina.
8. As células são fotografadas 48-72 horas pós-transfecção.

2. Experiment Perfusão

Nota: Para as células COS7 utilizadas nesta experiência, e os meios de perfusão foram câmara mantida a temperatura ambiente e ambiente concentração de CO _2. No entanto, se as células a ser utilizadas requerem temperatura mais elevada e de CO ₂ de controlo de concentração para a sobrevivência, estágio de microscópio aquecida e / ou uma câmara ambiental deve ser usado.

1. Prepare perfusão AF tampão (Veja a lista de materiais). Anexar torneiras a 50 ml seringas, feche as torneiras depois preenchê-los com as soluções para perfusão. Abrir a torneira de passagem, por um breve período de preencher o espaço de cabeça na torneira com o tampão.
2. Ligue a 8 canais, sistema de perfusão de alimentação por gravidade com um lápis de perfusão, e em seguida, selecione "Modo Manual" em Selecione a opção de função. Coloque um recipiente de resíduos sob o lápis de perfusão.
3. Manualmenteativar as portas, pressionando os números correspondentes e encher os tubos com 10 ml seringa contendo água e feche a porta. Uma vez que os portos estão cheios de água, definir as seringas contendo buffers AF na porta 1-6 de sistema de perfusão e, em seguida, abra as torneiras. Abrir as portas novamente para substituir a água na tubagem, com os tampões. O caudal deve ser de cerca de 0,8 ml / min.
4. Imprensa cancelar uma vez no controlador de perfusão para voltar ao menu "Select Function". Alternar a opção "Edit Program", em seguida, digite o protocolo de perfusão indicado na Tabela 1. Salve o programa de perfusão.
5. Tome as células fora da incubadora. Lavar duas vezes com o tampão de perfusão, e em seguida, defina as células no palco. Ligue o sistema de perfusão para a câmara. Se uma câmara aberta é usada, configurar outra bomba que remove a solução de perfusão da câmara.
6. Abra o software Slidebook. Iniciar um novo slide.
   Nota: Oprocedimento seguinte é específico para o software Slidebook, mas o outro software, como MetaFluor e Nis-elemento também pode ser utilizado para o tipo de imagem descrito aqui. Teoricamente experimentos podem ser realizados utilizando qualquer software que permite imagens curso de tempo, e as sequências de imagens podem ser analisados ​​pós-experimentalmente usando softwares como o ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) ou Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). No entanto, o software que permite o acompanhamento em tempo real da relação doador / receptor é altamente útil.
7. Montar o slide para o palco microscópio fluorescente. Encontrar as células co-expressando o sensor e ASCT-mCherry utilizando filtros adequados (veja a lista de materiais), sob a função "FOCUS". Ajuste o ganho clicando na guia "Câmara" e deslizar a barra deslizante em "ganho". Além disso, ajustar a configuração de filtro de densidade neutra a partir do menu drop-down filtro de densidade neutra. Nota: Se o cubo de filtro não inclui um filtro de olho, não use os pedaços de olho desde shorT-comprimento de onda de luz de excitação é prejudicial para os olhos. Use a tela do computador para encontrar as células em seu lugar.
8. Adquirir imagens de células with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (Filtros são especificados na Lista de Material). Clique em "Captura de Imagem" e, em seguida, na janela de aquisição, especificar os filtros que vão ser usados. Clique no botão "TEST" para ajustar o tempo de exposição, digitando o tempo de exposição desejado na caixa ao lado das configurações do filtro. Nota: Todos os três canais necessitam de ser exposto durante o mesmo período. Ao ajustar os parâmetros de imagem, pegue a variação da eficiência FRET esperado e dobre aumentar em conta: por exemplo, se a eficiência FRET está prevista para ir até 2 vezes durante o experimento, os parâmetros de imagem deve ser ajustadade modo que a intensidade do Dador Aceitador _{ex in} no estado de repouso deve ser <50% do valor máximo que pode ser gravada pelo instrumento, de modo que o canal se torne não saturado durante a experiência. Sinal a partir das células marcadas devem ser, pelo menos, três vezes mais elevada do que na região do fundo.
9. Desenhe uma região de interesse utilizando a ferramenta regiões do software. Alternativamente, uma função de software para seleccionar os pixels acima determinada intensidade pode ser utilizado, e, em seguida, convertido em regiões. Para fazer isso, clique em Mask - Segmento, em seguida, mova a barra deslizante para destacar as áreas desejadas.
10. Selecione "lapso de tempo" na caixa tipo de captura, em seguida, especificar o intervalo (10 seg neste experimento) e pontos de tempo para o experimento.
11. Desenhe uma região em uma área sem quaisquer células fluorescentes. Esta área é usado para subtracção do fundo. Botão direito do mouse na região traçada, em seguida, configurá-lo como um fundo. Nota: Idealmente, as células que não estãot expressando os sensores devem ser utilizados como a região de fundo para ter em conta tanto a autofluorescência e a fluorescência de fundo detectado pela câmara. Na ausência de tais células estão disponíveis no campo de visão, pelo menos, uma região sem as células devem ser usados ​​para explicar a fluorescência de fundo.
12. Selecione o programa desejado em "Select Function - executar programas" opção. Alternar para o programa salva (veja o passo 2.3), e em seguida pressione ENTER no controlador de perfusão. Agora o programa é carregado, e bater qualquer tecla irá iniciar a perfusão.
13. Certifique-se de perfusão e da experiência de imagem começar ao mesmo tempo, clicando no botão "Iniciar" na janela de captura ao mesmo tempo que pressionar uma tecla no controlador de perfusão.
    Nota: Recomenda-se a registrar o ponto no tempo em que as soluções foram trocadas (o que pode ser feito usando o "notas" de função, encontrados dentro do guia de aquisição).
14. Execute o mesmo protocolo de perfusão using células que expressam um sensor que está prevista para ser saturados ou não ligada sob a condição experimental.
    Nota: Aqui, FLIPQTV3.0_1.5μ, que é saturado com a condição experimental, é usado como um controlo, a Figura 6 Tais experiências de controlo são necessários para confirmar que a variação da eficiência de TERF é devido à alteração real no substrato e não. devido à mudança de outros parâmetros tais como pH celular.

3. Análise pós-experimento

1. Examine se a amostra deriva ocorreu durante o experimento. Desenhe regiões de interesse (ROI) é sobre a imagem tirada em timepoint 0, em seguida, mova a barra deslizante na parte superior da janela de imagem e verifique se as células saem das ROIs em imagens tiradas no final do experimento.
2. Se sim, então use a função de rastreamento para corrigir a deriva, em primeiro lugar, a criação de máscaras em torno das células selecionando Mask - Segmento, em seguida, deslize a linha que especifica o ponto de corte para highlight as regiões que contêm as células. Acompanhe as regiões clicando Mask - rastreamento de partículas - rastreamento de partículas Basic.
3. Re-desenhar o ROI e região fundo quando necessário.
4. Exportar a intensidade média das ROI ao longo do curso da experiência. Clique Estatísticas - Exportação - Dados Razão / timelapse.
5. Quando a eficiência de FRET e quantificação da concentração do substrato não é necessário, traçar o curso de tempo da relação da intensidade _(ex Dador Aceitador _in, / Doadores Doadores _{ex in)} como um proxy de a dinâmica do substrato. Para determinar a concentração citosólica, calcular o máximo e o mínimo de alterações proporção (isto é, na ausência de saturação e do substrato, respectivamente), Δr _max - Δr _min, por meio de regressão não-linear de Δratio (Δr) com a seguinte equação:
   Δr = [S] / (K _d + [S]) x (Δr _{max - Δr min) + Δr min
   onde [S] é a concentração do substrato no citosol. Usando os Δr max - mínimo de valores obtidos Δr, saturação (S) do sensor a uma dada Δr é calculado como
   S = (Δr - Δr min) / (Δr max - min Δr)
   S podem ainda ser convertidos em concentração de substrato [S] usando a seguinte equação:
   S = [S] / (K d + [S])
   Nota: a intensidade da Acceptor ex Acceptor canal los deve ser também conspiraram para examinar se a condição experimental influenciado a fluorescência do receptor diretamente.}
6. Quando um desvio da linha de base devido ao foto-branqueamento é observada, realizar uma correção de linha de base. Para fazer isso, traçar as intensidades de doador e receptor ao longo do tempo (Figura 5A). Em seguida, identificar os pontos temporais utilizadas para poe linha de base, de acordo com o atraso no sistema de perfusão e a actividade de transporte da célula em particular (Figura 5B).
7. Calcule um encaixe de polinômio que melhor descreve a linha de base. Em seguida, normalizar a intensidade em bruto de cada ponto de tempo para a linha de base (Figura 5C). Calcular a relação de intensidade (Donor _ex Acceptor _em, / Donor _ex Donor _em) do doador e receptor intensidades normalizadas.

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Resultados

Experiências típicas de curso-tempo estão representados na Figura 2. Nestas experiências, FRET sensores de glutamina com afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A e 2B) e 100 uM (FlipQTV3.0_100 μ C e D) foram co-expressos com uma aplicabilidade ASCT2 permutador de aminoácido ¹⁸ em células COS7 ^10. Influxo de glutamina é detectado como uma alteração em razões de intensidade de fluorescência entre o doador (mTFP1) e o receptor (Vénus)...

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Discussão

O sucesso dos experimentos com imagens depende de alguns fatores críticos. Um desses factores é a afinidade dos sensores utilizados, como discutido acima. Concentração absoluta do substrato no compartimento subcelular de interesse, no entanto, é muitas vezes desconhecida. Portanto, recomendamos tentar vários sensores com afinidades escalonados para encontrar o que funciona melhor sob a condição experimental desejado. Por exemplo, no nosso caso, as células COS7 transfectadas com sensores de glutamina com 1.5μ, ...

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala