Glutamina Flux Imaging utilizando sensores codificados genéticamente

Resumen

Este artículo le mostrará cómo controlar la dinámica de glutamina en las células vivas mediante FRET. Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos para los sensores de glutamina codificados genéticamente.

Resumen

Sensores codificados genéticamente permiten la monitorización en tiempo real de las moléculas biológicas con una resolución subcelular. Una enorme variedad de tales sensores para moléculas biológicas se hizo disponible en los últimos 15 años, algunos de los cuales se convirtió en herramientas indispensables que se utilizan rutinariamente en muchos laboratorios.

Una de las emocionantes aplicaciones de sensores codificados genéticamente es el uso de estos sensores en la investigación de los procesos de transporte celulares. Propiedades de los transportistas, como la cinética y especificidades de sustrato se pueden investigar a nivel celular, que proporciona posibilidades de análisis específicos de tipo celular de las actividades de transporte. En este artículo, vamos a demostrar cómo la dinámica del transportador se pueden observar utilizando el sensor de glutamina codificado genéticamente como ejemplo. Diseño experimental, detalles técnicos de los parámetros experimentales, y las consideraciones para los análisis post-experimentales serán discutidos.

Introducción

Debido a la notable progreso en tecnologías que permite el examen del transcriptoma y el proteoma a nivel celular, ahora ha quedado claro que la bioquímica y el flujo resultante de los metabolitos y los iones son altamente tipo específico de célula. Por ejemplo, en el hígado de los mamíferos, la degradación y la síntesis de glutamina secuencial se llevan a cabo de forma simultánea por las células periportal y células perivenosos respectivamente, la alimentación de amonio para el ciclo de la urea en el primer tipo de células, mientras que consume el exceso de amoníaco en este último ^1-3. En algunos casos, se detecta heterogeneidad bioquímica significativa incluso en un solo "tipo celular" ^{4, 5.} Además de tales especificidad espacial, los niveles celulares de metabolitos e iones son altamente dinámico (por ejemplo, moléculas de señalización tales como Ca ^{2 +} y nucleótidos cíclicos). Los patrones espacio-temporales de metabolitos e iones a menudo desempeñan un papel crítico en la transducción de señales. MONITOREO dinámica celular de metabolitos e iones, sin embargo, plantean desafío único. En muchos casos, el cambio en las concentraciones son rápida y transitoria, ejemplificada por el caso de moléculas de señalización tales como Ca ^{2 +,} que se desintegra dentro de ~ 20 mseg en las espinas dendríticas ^6. Además, la compartimentación de las rutas bioquímicas dentro y entre las células hace que sea difícil de cuantificar la dinámica de metabolitos e iones usando extracción y cromatografía en columna / técnicas de espectrometría de masas.

Sensores codificados genéticamente para moléculas biológicas son ampliamente utilizados debido a la alta resolución espacio-temporal que permite al experimentador para estudiar la dinámica molecular de corta duración y / o compartimentadas (revisado en ^{7, 8).} Estos sensores codificados genéticamente pueden dividirse en dos categorías; sensores basados ​​en la intensidad y sensores ratiometic. Sensores basados ​​en la intensidad general consisten en un dominio de unión y una gripeproteína orescent (fps), y la unión al dominio de unión soluto cambia la intensidad fluorescente. Sensores Ratiometic, por otro lado, a menudo se aprovechan de Föster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos programas marco que funcionan como un par de FRET. Estos sensores consisten en un dominio de unión y dos programas marco, y la unión soluto induce el cambio en la eficiencia de FRET entre los dos programas marco. Un gran número de sensores para metabolitos e iones biológicamente importantes se han desarrollado en la última década ^{8, 9.}

Una de la excitante posibilidad ofrecida por tales sensores codificados genéticamente es su uso en el análisis de alta resolución de los procesos de transporte de membrana, que anteriormente no era fácil de detectar en el nivel celular. Sensores codificados genéticamente facilitar el análisis de los mecanismos de transporte, tales como especificidad de sustrato y la dependencia de pH ^{10, 11.} Por otra parte, en combinación con la res genéticosuentes como la biblioteca de RNAi construye de organismos modelo, ahora es posible realizar búsquedas en todo el genoma para nuevos procesos de transporte por medio de sensores codificados genéticamente. De hecho, el uso de cable del sensor codificado genéticamente para el descubrimiento de los transportadores de no caracterizados previamente en múltiples casos ^{12, 13.}

Recientemente, nuestro laboratorio ha desarrollado una serie de sensores basados ​​en FRET de glutamina. Hemos demostrado que los niveles de glutamina celular pueden ser visualizados usando tales sensores de glutamina de FRET ^10. Estos sensores constan de un donante de FRET (mTFP1) insertado en una proteína bacteriana de unión glutamina glnH, y un aceptor de FRET (Venus) en el extremo C-terminal de glnH (Figura 1). FRET eficiencia de estos sensores a disminuir tras la unión de glutamina, lo que resulta en la disminución de la relación de intensidad de aceptor / donador. Fine regulación de los procesos de transporte de la glutamina es importante en los procesos biológicos, tales como neurotransmisión ^{14, 15} y el mantenimiento de ciclo de la urea en el hígado ^{1, 16, 17.}

Aquí se presenta la metodología de análisis de las actividades de transporte con sensores FRET para glutamina, usando un campo amplio de fluorescencia microscopio puesta a punto. El objetivo de los experimentos que se muestran aquí son para detectar las actividades del transportador en una sola célula y para examinar la especificidad de sustrato de un transportador expresado transitoriamente.

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Protocolo

1. Preparación de la muestra

Nota: En muchos casos, los experimentos de perfusión verterlo una porción significativa de las células, lo que puede convertirse en un problema frustrante. Aunque no es necesario para todas las líneas celulares, las superficies de vidrio cubierta de recubrimiento con poli-L-lisina (añadir 1,0 ml/25 cm ² de solución de 0,01% de la superficie, incubar> 5 min, se lava dos veces con agua de calidad de cultivo celular, y en seco la cabina de bioseguridad) mejora la adhesión celular. Además, tenga en cuenta el nivel de bioseguridad (BSL) de la línea celular utilizada, y siga el procedimiento operativo estándar aprobado por la oficina local de salud y seguridad ambiental. En este experimento, se utilizaron células Cos-7 debido a la baja actividad de transporte de glutamina endógena (véase la Figura 4).

1. Células COS7 de semillas a ~ 70-80% de confluencia en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) + 10% de suero de ternera cósmica y 100 U / ml de penicilina / estreptomicina, ya sea en cubreobjetos de vidrio 25 mm estériles colocados en el cultivo de 6 pocillosplato o 8 pocillos diapositivas con fondo de cristal. Incubar a 37 ° C, 5% de CO _2, 100% de humedad durante 24 horas.
2. Cambiar el medio de crecimiento a DMEM suero de ternera cósmica 10% (sin antibióticos), de acuerdo con el protocolo del fabricante. Crecer O / N a 37 ° C, 5% de _CO2 a 100% de humedad.
3. Añadir 0,4 mg de cada uno de ADN plásmido que codifica el sensor de glutamina (pcDNA3.1, llevando sensor de FLIPQTV3.0 bajo el promotor de CMV ¹⁰⁾ y la ASCT2 mCherry-etiquetado ¹⁰ a 50 ml de medio libre de suero (OPTI-MEM) y mezclar suavemente.
4. Añadir 1 ml de reactivo de transfección a 50 ml de medio libre de suero. Incubar a TA durante 5 min.
5. Mezclar las dos soluciones que contienen ADN (paso 1.3) y reactivo de transfección (paso 1,4) y se incuba durante 20 min.
6. Añadir suavemente el reactivo de transfección en la parte superior de las células y mezclar suavemente oscilando la cámara. Incubar durante 24 horas a 37 ° C, 5% de CO _2, el 100% de humedad.
7. Después de 24 horas, cambiar el medio a DMEM + 10% de suero de ternera Cósmica(CCS) + 100 unidad de penicilina / estreptomicina.
8. Las células se crean imágenes de 48 a 72 horas después de la transfección.

2. Experimento de perfusión

Nota: Para las células COS7 utilizados en este experimento, los medios de comunicación de perfusión y la cámara se mantuvieron a temperatura ambiente y ambiente concentración de CO _2. Sin embargo, si las células que están siendo utilizados requieren una temperatura más alta y CO ₂ de control de concentración para la supervivencia, platina del microscopio calentado y / o una cámara ambiental debe ser utilizado.

1. Preparar la perfusión AF tampón (Ver Lista de Materiales). Coloque las llaves de paso para jeringas de 50 ml, cierre las llaves de paso y luego llenarlos con las soluciones para infusión. Abrir la llave de paso durante un breve periodo para llenar el espacio de cabeza en la llave de paso con el tampón.
2. Encienda el 8 canales, sistema de perfusión de alimentación por gravedad con un lápiz de perfusión, a continuación, seleccione "Modo Manual" en Seleccione la opción Función. Coloque un recipiente debajo del el lápiz de perfusión.
3. A manoactivar los puertos pulsando los números correspondientes y llenar los tubos utilizando 10 ml jeringa que contiene agua, y luego cerrar el puerto. Una vez que los puertos están llenos de agua, ponga las jeringas que contienen tampones AF en el puerto 1-6 del sistema de perfusión y, a continuación, abrir las llaves de paso. Abrir los puertos de nuevo para reemplazar el agua en la tubería con los tampones. La velocidad de flujo debe estar alrededor de 0,8 ml / min.
4. Pulse cancelar una vez en el controlador de la perfusión para volver al menú "FUNCION". Cambie a la opción "Editar programa", a continuación, escriba en el protocolo de perfusión indica en la Tabla 1. Guarde el programa de perfusión.
5. Tome las células de la incubadora. Lavar dos veces con el tampón de perfusión, a continuación, establezca las células en el escenario. Conecte el sistema de perfusión a la cámara. Si se utiliza una cámara abierta, configure otra bomba que elimina la solución de perfusión de la cámara.
6. Abra el software Slidebook. Iniciar una nueva diapositiva.
   Nota: Lasiguiente procedimiento es específico para el software Slidebook, pero otro software, como MetaFluor y NIS-elemento también se puede utilizar para el tipo de formación de imágenes se describe aquí. Teóricamente experimentos se pueden realizar utilizando cualquier software que permite obtener imágenes del curso del tiempo, y las secuencias de imágenes pueden ser analizados post-experimental utilizando software como ImageJ (http://rsbweb.nih.gov/ij/) o Fiji (http:/ / fiji.sc / Fiji). Sin embargo, el software que permite la supervisión en tiempo real de la relación de aceptor / donante es de gran utilidad.
7. Montar el portaobjetos sobre la platina del microscopio fluorescente. Encuentre las células que expresan co-sensor y ASCT-mCherry utilizando conjuntos de filtros apropiados (véase la lista de materiales) bajo la función "FOCUS". Ajuste la ganancia haciendo clic en la pestaña "Cámara" y arrastrando la barra deslizante debajo de "ganancia". Además, ajuste la configuración del filtro de densidad neutra desde el menú desplegable de filtro de densidad neutra. Nota: Si el cubo de filtro no incluye un filtro de ojo, no utilice las piezas oculares desde shorluz de excitación t-longitud de onda es perjudicial para los ojos. Utilice la pantalla de la computadora para encontrar las células en su lugar.
8. Adquirir imágenes de las células with donor ( mTFP1) _ex donor(mTFP1) _em , donor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _em and acceptor ( mTFP1) _ex acceptor(venus) _{em m} channels (Filtros se especifican en la Lista de Materiales). Haga clic en "Captura de imagen", y luego, en la ventana de adquisición, especifique los filtros que se van a utilizar. Haga clic en el botón "TEST" para ajustar el tiempo de exposición al escribir el tiempo de exposición deseado en la casilla junto a la configuración del filtro. Nota: Todos los tres canales necesitan ser expuestos para la misma longitud. Al ajustar los parámetros de la imagen, tomar el cambio en la eficiencia FRET esperado y doblar a aumentar en cuenta: por ejemplo, si se espera que la eficiencia de FRET a subir de 2 veces durante el experimento, los parámetros de imagen se deben ajustarde manera que la intensidad del Donante Aceptor _{ex em} en el estado de reposo debería ser <50% del valor máximo que se puede grabar por el instrumento, de manera que el canal no se sature durante el experimento. De señal de las células marcadas debe ser al menos tres veces mayor que en la región del fondo.
9. Dibuje una región de interés usando la herramienta de las regiones en el software. Alternativamente, una función de software para seleccionar píxeles por encima de cierta intensidad se puede utilizar, y luego se convierte en regiones. Para ello, haga clic en Máscara - Segmento, luego mueva la barra de desplazamiento para resaltar las áreas deseadas.
10. Seleccione "lapso de tiempo" en el cuadro Tipo de captura, a continuación, especifique el intervalo (10 segundos en este experimento) y puntos de tiempo para el experimento.
11. Dibuje una región en una zona sin presencia de células fluorescentes. Esta área se utiliza para la sustracción de fondo. Haga clic derecho en la región dibujada, y luego configurarlo como fondo. Nota: Lo ideal sería que las células que no sonT que expresan los sensores debe ser utilizado como la región del fondo para tener en cuenta tanto la autofluorescencia y la fluorescencia de fondo detectada por la cámara. Si no hay tales células están disponibles en el campo de visión, por lo menos una región sin las células debe ser utilizado para tener en cuenta la fluorescencia de fondo.
12. Seleccione el programa deseado en "Select Function - Ejecutar programas de" opción. Cambie al programa guardado (vea el paso 2.3), y luego pulsa ENTER en el mando a la perfusión. Ahora el programa se carga, y golpear una tecla comenzará la perfusión.
13. Asegúrese de perfusión y el experimento de imágenes se inicia al mismo tiempo haciendo clic en el botón "Inicio" en la ventana de captura, al mismo tiempo que se pulsa una tecla en el controlador de la perfusión.
    Nota: Se recomienda anotar el punto de tiempo en que se intercambiaron las soluciones (esto se puede hacer uso de "Notas" de función, que se encuentran dentro de la pestaña de la adquisición).
14. Realice el mismo protocolo de perfusión using de células que expresan un sensor que se espera que sea o bien saturado o no unido bajo la condición experimental.
    Nota: Aquí, FLIPQTV3.0_1.5μ, que está saturado bajo la condición experimental, se utiliza como un control, la Figura 6 Tales experimentos de control son necesarios para confirmar que el cambio en la eficiencia de FRET es debido al cambio real en el sustrato y no. debido al cambio en otros parámetros tales como el pH celular.

3. Análisis Post-experimento

1. Examinar si se ha producido la muestra de deriva durante el experimento. Dibuje las regiones de interés (ROI) s en la imagen tomada en punto de tiempo 0, luego mueva la barra de desplazamiento en la parte superior de la ventana de imagen y compruebe si las células se caen de las regiones de interés en las imágenes tomadas posteriormente en el experimento.
2. En caso afirmativo, a continuación, utilizar la función de seguimiento para corregir la deriva, en primer lugar, la creación de máscaras alrededor de las células mediante la selección de la máscara - Segmento, luego deslice la línea que especifica el punto de corte de highlight las regiones que contienen células. Seguimiento de las regiones haciendo clic Máscara - seguimiento de partículas - rastreo de partículas básico.
3. Re-dibujar el rendimiento de la inversión y la región del fondo cuando sea necesario.
4. Exportación de la intensidad media de las regiones de interés en el transcurso del experimento. Haga clic en Estadísticas - Exportaciones - Datos Ratio / timelapse.
5. Cuando la eficiencia de FRET y la cuantificación de la concentración de sustrato no es necesario, trazar el curso temporal de la relación de intensidad (de donantes _ex Aceptador _em, / Donante _ex Donante _em) como un proxy de la dinámica del sustrato. Para determinar la concentración citosólica, calcular la máxima y la mínima relación de cambio (es decir, en la saturación y la ausencia de sustrato, respectivamente),? R _máx -? R _min, mediante regresión no lineal de Δratio (Delta R) con la siguiente ecuación:
   ? R = [S] / (K _d + [S]) x (? R _{max - min? R) +? R min
   donde [S] es la concentración de sustrato en el citosol. Utilizando los? R max - valores? R min obtenidos, la saturación (S) del sensor a una determinada? R se calcula como
   S = (? R -? R min) / (? R max - min? R)
   S además se puede convertir en la concentración de sustrato [S] utilizando la siguiente ecuación:
   S = [S] / (K d + [S])
   Nota: la intensidad de canal em Aceptador ex Aceptador debe ser también traza para examinar si la condición experimental influyó en la fluorescencia del aceptor directamente.}
6. Cuando se observa una deriva de referencia debido a la foto-blanqueo, realizar una corrección de la línea base. Para ello, trazar las intensidades de donante y aceptor en el tiempo (Figura 5A). Luego de identificar los puntos de tiempo utilizados para el the la línea de base, de acuerdo a la demora en el sistema de perfusión y la actividad de transporte de la célula particular (Figura 5B).
7. Calcula un polinomio de ajuste que mejor describe la línea base. Entonces, normalizar la intensidad prima a partir de cada punto de tiempo de la línea de base (Figura 5C). Cálculo de la relación de intensidad (de donantes _ex Aceptador _em, / Donante _ex Donante _em) de los donantes y aceptores de intensidades normalizadas.

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Resultados

Tiempo curso experimentos típicos se representan en la Figura 2. En estos experimentos, FRET sensores de glutamina con afinidades de 8 mM (FLIPQTV3.0_8m, Figura 2A y 2B) y 100 M (FlipQTV3.0_100 μ C y D) fueron co-expresada con un ASCT2 intercambiador de aminoácidos obligatoria ¹⁸ en células COS7 ^10. La afluencia de glutamina se detecta como el cambio en las relaciones de intensidad de fluorescencia entre el donante (mTFP1) y el aceptor (Venus) ...

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Discusión

El éxito de los experimentos de imagen depende de algunos factores críticos. Uno de estos factores es la afinidad de sensores utilizado, como se discutió anteriormente. Concentración absoluta del sustrato en el compartimiento subcelular de interés, sin embargo, es a menudo desconocida. Por lo tanto le recomendamos probar múltiples sensores con afinidades escalonados para encontrar el que funciona mejor bajo la condición experimental deseado. Por ejemplo, en nuestro caso transfectadas las células COS7 con sensore...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inverted fluorescent microscope	Olympus	IX81F-3-5	An equivalent inverted fluorescent microscope from other suppliers would also be appropriate.
Excitation filter (mTFP1)	Omega Optical	3RD450-460	Band width 450-460 nm
Excitation filter (Venus)	Chroma	ET500/20	Band width 490-510 nm
Emission filter (mTFP1)	Chroma	HQ495/30m	Band width 475-505 nm
Emission filter (Venus)	Chroma	ET535/30m	Band width 520-550 nm
Dichroic mirror (FRET channels)	Chroma	470dcxr	Long pass, 470 nm cut off
Dichroic mirror (YFP channel)	Chroma	89002bs	Passes 445-490 nm, 510-560 nm, 590-680 nm
mCherry filter set	Chroma	49008	Excitation 540-580 nm, long pass dichroic with 585 nm cut off, emission filter 595-695 nm
Light source	Olympus	U-LH100L-3-5	LED- or halogen light source that produces stable light intensity, mercury lamps are not recommended
CCD camera	Qimaging	Rolera-MGi EMCCD
Apochromatic fluorescence objective	Olympus
Perfusion system, ValveBank II	AutoMate Scientific	[01-08]	Other perfusion systems that allow fast solution exchange would also work
Laminar-flow chambers	C&L Instruments	VC-MPC-TW	Other larminar-flow chambers would also work.
Chambered slide	Lab-Tek	154534	For open-chamber experiments
Perfusion pump	Thermo Scientific	74-046-12131	For open-chamber experiments
Software supporting ratiometric measurements	Intellegenent Imaging Innovation	Slidebook 5.5
Laminar flow biosafety cabinet	ESCO	LA-3A2
Isotemp CO2 Incubator	Thermo Scientific	13-255-25
Dulbecco's MEM (DMEM)	Hyclone	SH30243.01
Cosmic calf serum	Hyclone	SH3008703
Penicillin/streptomycin	Hyclone	SV30010
Serum-free medium for transfection (OPTI-MEM I)	Invitrogen	31985	Used with Lipofectamine 2000
Poly-L-Lysine solution	Sigma	P4707
25 mm circular glass cover slips	Thermo Scientific	12-545-102	In case VC-MPC-TW is used
Lipofectamine 2000	Invitrogen	11668027	Other transfection reagents can also be used.
Solution A (Hank's buffer)			9.7 g HANK salt (Sigma H1387), 0.35 g NaHCO3, 5.96 g HEPES to 1 L, pH adjusted to 7.35 with NaOH
Solution B			Solution A + 0.04 mM Gln
Solution C			Solution A + 0.2 mM Gln
Solution D			Solution A + 1 mM Gln
Solution E			Solution A + 5 mM Gln
Solution F			Solution A + 5 mM Ala