JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

عدوى الإنسان عن طريق المتحولة الحالة للنسج يؤدي إلى الأميبية، سببا رئيسيا من أسباب الإسهال في البلدان الاستوائية. وبدأت العدوى عن طريق التفاعلات الممرض مع الخلايا الظهارية في الأمعاء، مما أدى إلى افتتاح اتصالات خلية خلية، وبالتالي الإسهال، يليه في بعض الأحيان عن طريق العدوى الكبد. توفر هذه المقالة نموذج لتقييم مبكر التفاعلات المضيف الممرض لتحسين فهمنا للالأميبية المرضية.

Abstract

المتحولة الحالة للنسج هو العامل المسبب للالأميبية الإنسان، سببا رئيسيا من أسباب الإسهال وخراج الكبد في البلدان الاستوائية. وبدأت العدوى عن طريق التفاعل بين الممرض مع الخلايا الظهارية في الأمعاء. هذا التفاعل يؤدي إلى اختلال الهياكل بين الخلايا مثل منعطفات ضيقة (TJ). TJ ضمان الختم من طبقة الطلائية لفصل الأنسجة المضيف من التجويف الأمعاء. تقديم الدراسات الحديثة أدلة على أن تعطل TJ من البروتين EhCPADH112 الطفيلية هو شرط أساسي لE. غزو ​​نسج أن يترافق ضعف حاجز الظهارية. وبالتالي، فإن تحليل الآليات الجزيئية المشاركة في TJ التفكيك خلال E. غزو ​​نسج هو من أهمية قصوى لتحسين فهمنا للالأميبية المرضية. تقدم هذه المقالة نموذج السهل الذي يسمح للتقييم الأولي التفاعلات المضيف الممرض واحتمال غزو الطفيليات. المعلمات ليتم تحليلها وتشمل رالمقاومة الكهربائية ransepithelial، تفاعل EhCPADH112 مع مستقبلات سطح الظهارية، والتغيرات في التعبير وتوطين علامات صلي الظهارية وتوطين الجزيئات الطفيليات داخل الخلايا الظهارية.

Introduction

المتحولة الحالة للنسج الأوالي هو خلية واحدة مسؤولة من الأميبية الإنسان، عدوى معوية تسبب الالتهاب والإسهال. E. نسج تصيب ما يصل إلى 50 مليون شخص سنويا، ولكن فقط حوالي 10٪ من المصابين تطوير الأعراض المصاحبة لالأميبية 1. تحدث العدوى عند ابتلاع الطعام الملوث أو المياه التي تحتوي على E. الخراجات نسج. في الأمعاء، والخراجات إنتاج النواشط الحية التي تلتزم القولون الميوسين وتتكاثر 2. النواشط عادة ما تشكل الخراجات التي تفرز عن طريق البراز. في حالات أخرى وذلك لأسباب غير معروفة حتى الآن، النواشط كسر الطبقة الظهارية المعوية وغزو الأنسجة الكامنة. في أسوأ الحالات، فإنها تدخل مجرى الدم وتؤثر على أعضاء أخرى مثل الكبد 3.

كسر حاجز الظهارية يتطلب تعطيل هياكل transmembranal الظهارية التي تحافظ على خلايا انضم. الخلايا الظهاريةوتشكل الاتصالات عن طريق مجمع صلي قمية تتألف من ضيق (TJ) والملتصقة تقاطعات (AJ)، وdesmosomes 4. التقاطعات الأكثر القمي هي TJ، وبالتالي، فهي أول حاجز بالإهانة من قبل E. نسج وبعض مسببات الأمراض الأخرى خلال الغزو المضيف. وتتألف TJ مستقبلات الالتصاق transmembranal مثل claudins، occludin وجزيئات الالتصاق صلي (JAM) التي تشارك في التفاعلات متغايرة الحبيبات وطي أو مع مستقبلات الخلية المجاورة. يتم داخل الخلية ملزمة من قبل جزيئات السقالة من النطيقة نطيقة (ZO) الأسرة التي تربط مستقبلات الالتصاق إلى الهيكل الخلوي الأكتين لتوفير مزيد من القوة الميكانيكية للظهارة. TJ هي المسؤولة عن ختم الأنسجة المعوية من التجويف الأمعاء، ومنع تسرب المياه المفرطة والمذاب. وهكذا، بعد تتعطل TJ من الطفيليات، وغزت الأنسجة. E. نسج تفرز العديد من الجزيئات مثل: (ط) المتورطين في التصاق الأميبات لTARGوآخرون خلايا 5؛ (ب) العوامل غشاء النشطة المشاركة في قتل الخلايا المضيفة التي كتبها إيماس، على سبيل المثال الببتيدات المكونة للقناة أيون يطلق amoebapores 6،7؛ و (iii) proteinases التي تتحلل البروتينات المصفوفة خارج الخلية والأنسجة التوسط تفكك 5،8،9.

البروتيني السيستين EhCP112 وجزيء التصاق EhADH112 التي تشكل معا مجمع EhCPADH112 هما E. نسج الفوعة البروتينات التي تلعب دورا رئيسيا في تفكك TJ 10. النواشط الحية، ومجموع لست] ومنتجاتها يفرز لحث على التغيرات الجزيئية في TJ اضطراب معقدة وظيفية من حاجز الظهارية. في هذه الدراسة، تبين أن EhCP112 وEhADH112 التفاعل مع occludin وclaudin-1 البروتينات مما يؤدي إلى استيعاب وتدهور البروتينات الخلايا، مما يسهل E. مدخل للنسج من خلال مسار paracellular.

لدينا البيانات وتلك سو مجموعات أخرى 11-17 تشير بقوة إلى ضرورة التفاعلات المضيف الممرض المحددة التي تسمح غزو الطفيليات. كشف الأساس الجزيئي لهذه التفاعلات أمر في غاية الأهمية من أجل فهم أفضل للالأميبية المرضية. اضطراب انتقائية من قبل TJ النواشط، وتتميز زيادة نفاذية paracellular، يمكن قياس انخفاض في المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER). ونقل البروتينات الطفيلية نحو ظهائر المضيف يمكن تحديده من خلال تلطيخ المناعي ومتحد البؤر المجهري الليزر، وهي طريقة التي يمكن أن تكشف أيضا عن المشاركة في توطين عوامل الفوعة الاميبا مع علامات تشير صلي الظهارية التفاعلات المباشرة ممكن. في هذه المقالة، ونحن تصف بالتفصيل كيف تزرع الخلايا الظهارية والنواشط، تحصد والتلاعب بها لدراسة التفاعلات المضيف الممرض وعواقبها.

Protocol

1. إنشاء وصيانة E. الثقافات نسج

  1. تنمو axenically (خال تماما من جميع الكائنات الأخرى تلويث) 1 × 10 5 النواشط من المتحولة الحالة للنسج سلالة HML: IMSS استنساخ A 18 في 16 × 125 ملم مع ثقافة أنابيب تفلون قبعات بطانة المسمار (أو 1 × 10 6 النواشط في المتاح T- 25 قارورة) و 15 مل (أو 50 مل في T-25 قارورة) من TYI-S-33 المتوسطة (TYI مرق تستكمل مع 3٪ خليط فيتامين الماس، و 10٪ الحرارة المعطل المصل البقري الكبار، 0.5 وحدة دولية / مل البنسلين و 35 ميكروغرام / مل الستربتوميسين) 19 في حاضنة عند 37 درجة مئوية.
  2. النواشط الحصاد خلال مرحلة النمو اللوغاريتمي عادة في 48-96 ساعة فترات (الشكل 1) بواسطة تقشعر لها الأبدان أنابيب الثقافة لمدة 5-10 دقيقة في حمام الماء المثلج للافراج النواشط تعلق على أنبوب الثقافة الزجاج.
  3. نقل الثقافة في أنبوب مخروطي الشكل وعكس ذلك عدة مرات لتفريق سلليرة سورية. تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات (غرفة نيوباور)، ونقل على اللقاح في أنبوب الثقافة التي تحتوي على TYI الطازجة-S-33 متوسطة.
    1. استخدام أعداد قليلة من الأميبا لفترات حضانة أطول (~ 3 × 10 5 خلايا ل~ 5 أيام) وعدد أعلى لفترات أقصر (~ 1 × 10 6 خلايا ل~ 1 اليوم). في حين عد قائح تكون مرغوبة والثقافات التي أنشئت أصبح يمكن التنبؤ بها بحيث كميات تقدر ب قائح مجدية.
    2. عاير كمية النواشط لتحسين أرقام الخلية لكل تجربة.
    3. الحفاظ على الثقافة مكررة موازية لديك نسخة احتياطية في حالة تلوث غير مقصود أو أنبوب الكسر.
  4. أنابيب الغطاء بإحكام واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية في 5 ° إمالة الزاوية الأفقية.
  5. تحقق الثقافات عن طريق التفتيش البصري بانتظام، إذ أن النمو المفرط للثقافة قد تحتوي على العديد من الخلايا هي lysed.

2. إنشاء وصيانة الثقافة MDCK

  1. تنمو MDCK (مدين داربي الناب الكلى) الخلايا النوع الأول (مقاومة عالية) في المتاح T-75 قوارير مع 10 مل من وسائل الاعلام DMEM تستكمل مع البنسلين (100 وحدة دولية / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، الأنسولين (0.08 U / مل) و 10٪ مصل العجل الوليد في جو ترطيب 5٪ CO 2 و 95٪ الهواء في 37 درجة مئوية.
  2. لتقسيم الخلايا، والتحقق منها على مجهر مقلوب. تقسيم الخلايا عندما تكون ~ 85-100٪ متموجة.
  3. استخدام الشافطة فراغ في غطاء العقيمة والمعقمة ماصة باستير الزجاج لإزالة وسائل الإعلام من الثقافة. لتجنب كشط الخلايا، بدوره القارورة رأسا على عقب وسائل الإعلام نضح من الزاوية السفلي.
  4. الاستغناء 10 مل من برنامج تلفزيوني prewarmed (140 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل، 10 ملي نا 2 هبو 4، 1.8 ملي KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 7.4) إلى T-75 قارورة (5 مل في حالة وجود T-25 قارورة ) وصخرة بلطف القارورة لغسل الخلايا. إزالة برنامج تلفزيوني عن طريق الشفط. مطلوب الغسيل واسعة منذ مصل يمنع التربسين.
  5. الاستغناء 1.5 مل من 0.05٪ التربسين إلى T-75 قارورة (لT-25 قارورة استخدام 0.5 مل) وبلطف صخرة قارورة لتغطية طبقة الخلايا مع التربسين.
  6. احتضان لمدة 5-10 دقيقة في الحاضنة (الوقت المحدد يعتمد على النشاط التربسين).
  7. التحقق من وجود مفرزة الخلية من خلال عقد القارورة ضد الضوء والبحث عن الخلايا التي تتدفق. ويمكن أيضا مفرزة خلية (خلايا مدورة) أن يتم التحقق باستخدام المجهر. في كثير من الأحيان، والخلايا الافراج أسرع مع ذلك، لطيف صفعة سريعة إلى جانب القارورة.
  8. إضافة 15 مل من DMEM تستكمل إلى T-75 قارورة (5 مل لT-25 قارورة). الخلايا resuspend pipetting صعودا وهبوطا 4 أو 5 مرات.
  9. لنشر الخلايا، تمييع تعليق خلية 01:05 مع DMEM تستكمل الطازجة. ويمكن أيضا تحديد عدد الخلايا في هذه المرحلة باستخدام عدادة الكريات ولكن هذا عادة ما يكون ضروريا فقط إذا تقسيم الخلايا إلى صيغ خاصة لبعض المقايسات.

3. إعداد أتروفة إجمالي لست]

  1. فصل النواشط من مكعبأنابيب LTURE بواسطة تقشعر لها الأبدان الأنبوب لمدة 5-10 دقيقة في حمام الماء المثلج. نقل جو معقم و مطهر الثقافة في أنبوب مخروطي الشكل والطرد المركزي في 360 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل بعناية طاف عن طريق الترقيد، إضافة PBS الجليد الباردة إلى بيليه، عكس الأنبوب عدة مرات لتفريق الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى في 360 x ج لمدة 10 دقيقة. كرر هذه الخطوة مرتين لإزالة كل آثار TYI-S-33 متوسطة.
  2. تحديد عدد النواشط باستخدام عدادة الكريات.
  3. ليز النواشط قبل تجميد أذاب دورات. الأداة الإضافية تجميد اللقاح يقاس من النواشط (600،000 النواشط / مل) المخفف في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة، في النيتروجين السائل لمدة 1 دقيقة. تجميد العينة في 4 درجات مئوية ودوامة بقوة. تكرار تجميد والذوبان 3 مرات لاستكمال تحلل الخلية.
  4. تنشيط البروتياز الموجودة في لست] مع 0.02٪ β-المركابتويثانول.

4. إعداد أتروفة يفرز المنتجات

  1. تنفيذ الخطوات 3،1-3،2.
  2. حددعدد الخلايا وقدرتها على البقاء في هذه المرحلة باستخدام عدادة الكريات وتطبيق اختبار التريبان الأزرق الاستبعاد 20:
    1. تمييع 9 × 10 6 النواشط في 3 مل PBS الجليد الباردة والخلايا نقل إلى أنبوب 50 مل المخروطية. يستغرق 10 ميكرولتر من هذا التعليق وإضافة 1 ميكرولتر من 0.4٪ التريبان الأزرق محلول المخزون ودرجة الحموضة 7.2.
    2. استخدام غرفة نيوباور لحساب الخلايا في تضخم منخفضة.
    3. حساب كافة الخلايا وفصل عدد من الخلايا الزرقاء، حيث اتخذت خلايا الصبغة الزرقاء حتى ويجب النظر القتلى.
    4. حساب النسبة المئوية للخلايا قابلة للحياة عن طريق قسمة عدد من خلايا قابلة للحياة من العدد الكلي للخلايا وضرب الناتج في 100.
  3. نقل أنبوب مخروطي يحتوي على تعليق أتروفة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 5 ° إمالة الزاوية الأفقية.
  4. لجمع المنتجات يفرز، أنابيب الطرد المركزي في 360 x ج لمدة 10 دقيقة. استخدام الحقنة ومعقمة وبعناية جمع سوpernatant، وتجنب تلوث العينات مع النواشط من بيليه. القضاء على أي خلايا نقل عن طريق تمرير طاف عبر غشاء خلات السليلوز 0.22 ميكرون. تنشيط البروتياز مع 0.02٪ β-المركابتويثانول.
  5. لتجاهل التلوث غير المرغوب فيها المفترضة مع جزيئات أفرج عنه من الخلايا الميتة، إعادة تطبيق الاختبار التريبان الأزرق الاستبعاد لبقاء الخلية. وينبغي أن تكون قابلة للحياة وعدد الكلي للخلايا في نفس حصلت عليه في الخطوة 4.2. إذا لم تكن هذه هي الحالة، طاف جمعها قد لا يحتوي فقط يفرز البروتينات ويجب التخلص منها.

5. التفاعل بين الخلايا MDCK مع النواشط، أتروفة لست] أو يفرز المنتجات

  1. احتضان متموجة الطبقات الوحيدة الخلية MDCK مع النواشط حية (نسبة MDCK إلى الأميبا 1:1)، أتروفة لست] (نسبة MDCK إلى الأميبا من 1:2) أو المنتجات يفرز (نسبة MDCK إلى الأميبا من 1 : 10) عند 37 درجة مئوية لمدة 2 و 30 دقيقة (الشكل 2A).
  2. غسل الخلايا الظهارية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني الجليد الباردة للقضاء على الجزيئات غير منضم أو النواشط.

6. إعداد العينات للالمناعي

  1. خلايا الثقافة MDCK على coverslips الزجاج معقمة وضعها داخل طبق خلية ثقافة 24 multiwell. تفقد الخلايا على المجهر المقلوب حتى تصل إلى 100٪ من التقاء. ثم استبدال المتوسطة مع 1 مل من الطازجة المتوسطة DMEM تستكمل ونقل لوحة لحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة أكثر من ذلك.
  2. إزالة المتوسطة باستخدام الشافطة فراغ ومعقمة الزجاج باستور ماصة وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني الحارة إلى كل بئر. إزالة برنامج تلفزيوني وتكرار غسل مع برنامج تلفزيوني جديد. والحرص على عدم كشط الخلايا من قاع البئر مع ماصة الزجاج.
  3. إضافة شروط مختلفة من النواشط المخفف في 1 مل من برنامج تلفزيوني الحارة: النواشط الحية (T)، ومجموع لست] أتروفة (TL) والمنتجات يفرز (SP).
    1. وضع لوحة الثقافة في الحاضنة لمدة 2 أو 30 دقيقة.
    2. إعداد شرطين التحكم: واحد اسمه الوقت 0 دقيقة، حيث الخلايا MDCK ينبغي أن لا حضنت مع E. نسج ولكن فقط مع 1 مل من برنامج تلفزيوني دافئ؛ وشرط آخر كما تحكم الأجسام المضادة الثانوية، في هذه الحالة احتضان MDCK مع T، TL أو SP لمدة 2 أو 30 دقيقة وحذفت الحضانة مع الأجسام المضادة الأولية.
  4. غسل الخلايا الظهارية خمس مرات مع برنامج تلفزيوني الباردة للقضاء على الجزيئات غير منضم أو النواشط.
  5. إصلاح وpermeabilize الخلايا مع 1 مل من الايثانول 96٪ لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية.
  6. لإزالة الإيثانول، نفذ ثلاثة يغسل سريعة مع 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة.
  7. نفذ الخطوات التالية في غرفة رطبة لتجنب تجفيف العينات:
    1. استخدام أي مربع مسطح المتاحة التي يمكن أن تكون مغلقة ومليئة منشفة ورقية مبللة على عينات التي يمكن وضعها بأمان. على سبيل المثال، يقدم مربع ماصة تلميح فارغ هذا الغرض أيضا.
    2. داخل غرفة، ووضع طبقة بالتساوي Parafilm وماصة 25 ميكرولتر من كتلةالحل (0.5٪ BSA) جي لكل ساترة.
    3. اتخاذ coverslips من الآبار مع ملقط غرامة، وإزالة بعناية السائل الزائد من على حافة مع ورقة الترشيح ووضع ساترة في قطرة تحتوي على عرقلة الحل (0.5٪ BSA) مع الخلايا التي تواجه عرقلة الحل. احتضان العينات لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  8. إعداد مزيج من الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني: الغلوبولين المناعي الماوس المضادة للEhCPADH112 (mα-EhCPADH112؛ تخفيف 1:10) ومفتش أرنب المضادة للZO-1 (pα-ZO-1؛ 1:100 تمييع).
  9. وضع ورقة جديدة من parafilm في مربع الرطبة وماصة 25 ميكرولتر من الأجسام المضادة حل لكل ساترة.
  10. رفع لل coverslips من عرقلة الحل، أي يجف السائل الزائد على حواف باستخدام ورق الترشيح، ووضعها في قطرات مع الخلايا التي تواجه حل الأجسام المضادة. احتضان العينات بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  11. وضع كل ساترة في بئر من 24 multiwell (الجانب الخلية في الأعلى) وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    1. تغسل خمس مرات مع 1 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الجزيئات غير منضم.
  12. إعداد مزيج من الأجسام المضادة الثانوية الفلورية في برنامج تلفزيوني: الماعز الفأر مكافحة الغلوبولين المناعي إلى جانب لFITC (1:100 تمييع) والماعز المضادة للأرنب مفتش جانب لTRITC (1:50 تمييع).
  13. وضع ورقة جديدة من parafilm في مربع الرطبة وماصة 25 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الثانوية لكل ساترة.
  14. نقل العينات كما هو الحال في 6.10 واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام لتجنب التبييض من الأصباغ الفلورية. كرر الخطوة 6.11.1.
  15. لتلطيخ النووية، واحتضان لمدة 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من 0.05 ملي دابي الحل في درجة حرارة الغرفة وبعيدا عن الضوء. كرر الخطوة 6.11.1.
  16. للحفاظ على الأصباغ الفلورية، ومكان لل coverslips (خلايا لأسفل) في 5 ميكرولتر Vecta درع antifade تصاعد الحل على شرائح المجهر الزجاجية. ختم زلات الغطاء باستخدام طلاء الأظافر لتجنب العينة التجفيف.
  17. للتخزين على المدى الطويل، والحفاظ على الشرائح فيمربع شريحة المجهر في -20 درجة مئوية.
  18. تحليل استعدادات المجهري متحد البؤر من خلال أقسام Z-مكدس وXZ-طائرات (الشكل 2A).

7. الحضانة من النواشط مع مثبطات البروتياز أو الجسم المضاد النوعي

  1. كرر الخطوات من 3،1-3،2. لكل حالة تجريبية، واحتضان 1 × 10 5 النواشط (معلق في 50 ميكرولتر PBS) مع مثبطات الأنزيم البروتيني (1 ملم كاملة و 40 ميكروغرام / مل E-64) أو 30 ميكروغرام ريتوكسيماب ضد EhCPADH112 (mαEhCPADH112) 21 لمدة 20 دقيقة على 4 ° C (الشكل 2B). استخدام هذه الاستعدادات لفحوصات شارك في الحضانة كما هو موضح في الخطوة 8.5.

8. قياس المقاومة الكهربائية بطريق الظهارة (TER)

  1. ثقافة خلايا MDCK على transwell الدعم نفاذية العقيمة (0.4 ميكرون حجم المسام). في المقصورة العليا، ووضع 100 ميكرولتر من تعليق الخلوية وانخفاض في المقصورةوضع 600 ميكرولتر من DMEM تستكمل المتوسطة.
    1. تحقق من مستوى المتوسطة بشكل دوري. يمكن إضافة المتوسطة الطازجة كما هو مطلوب.
    2. تفقد الخلايا على مجهر مقلوب حتى تصل إلى 100٪ من التقاء. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام.
    3. لتحسين مرفق الخلية (إذا لزم الأمر)، تتوازن المرشحات transwell بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في DMEM قبل إضافة تعليق الخلية.
  2. تعقيم أقطاب STX2 في غطاء محرك السيارة عن طريق الغمر في الإيثانول ثم في برنامج تلفزيوني العقيمة لمدة 15 دقيقة لكل منهما، تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. ربط الأقطاب إلى الظهارية voltohmmeter EVOM وتحديد وضع المقاومة.
  3. جمع المتوسطة من المقصورة العلوية من كل transwell وبركة لهم. تأخذ 50 ميكرولتر من هذا الخليط وسائل الإعلام ودمجها مع 50 ميكرولتر من النواشط تعليق (1 × 10 5 النواشط في برنامج تلفزيوني)، أو فقط مع برنامج تلفزيوني (السيطرة). استخدام خليط مماثلة لكل transwell.
  4. إضافة مخاليط إلى الغرفة العليا من كل containin transwellز الخلايا MDCK. وتشمل الظروف التجريبية خلايا MDCK دون النواشط (السيطرة)، والثقافة المشتركة مع النواشط أو مع النواشط المحتضنة مسبقا مع مثبطات الأنزيم البروتيني أو mαEhCPADH112. للقضاء على المقاومة التي يوفرها المرشحات، واستخدام transwells حضنت مع المتوسطة فقط. لكل حالة تجريبية استخدام لا يقل عن ثلاثة transwells.
  5. على الفور، وقياس TER عن طريق غمس الأقطاب STX2 في كل transwell.
    1. تأكد من أن القطب يعد يلمس الجزء السفلي من مجلس النواب والتي يتم تغطيتها من قبل القطب أقصر المتوسطة في المقصورة العليا (انظر الشكل 2B).
    2. تأكد من أن يعقد الأقطاب عموديا في كل مرة. سيؤدي ذلك إلى تحسين استنساخ، بشكل كبير. تجنب نقل أو إمالة الكهربائي خلال القياسات لأن هذا سوف يؤدي إلى اختلاف البيانات.
  6. وينبغي النظر في هذا القياس قيمة TER الأولي. ثم، مراقبة TER خلال ما يلي30 دقيقة.
  7. لحساب قيمة TER النهائي، طرح قيمة TER من المرشحات فقط. لمقارنة النتائج من تجارب مختلفة تطبيع كل نقطة البيانات إلى القيم الأولية، مع هذه الى 100٪ (الشكل 2B).

النتائج

لنجاح E. ثقافة نسج، يجب الوفاء شرطين مهمين: النمو في ظروف ممحوضة والحصاد في مرحلة لوغاريتمي. سابقا، ثقافات E. أنشئت نسج بسهولة بالاشتراك مع أنواع معينة من البكتيريا أو trypanosomatids 22. ومع ذلك، في الوقت الحاضر فإنه من الشائع أن يكون زراعة ممحوضة هذا ...

Discussion

من أجل دراسة في المختبر التفاعلات المضيف الممرض خلال العدوى الظهارية بواسطة E. نسج، لا بد من العمل مع الثقافات الراسخة في كل من الخلايا الظهارية والنواشط. على سبيل المثال، سابقا، E. وعادة ما أنشئت الثقافات نسج بالتعاون مع أنواع معينة من البكتيريا أ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A IMSS Hospital, MexicoWithout/numberVirulent trophozoites18 
TYI brothBecton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich		211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879		3.45% BBL Biosate peptone
58 mM glucose
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6.5 mM K2HPO4
16.3 mM ascorbic acid
8.1 mM L-cysteine
0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adultMicrolab , Labs., Mex.SU146Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80In vitroSR-07Use at 3%
Penicillin Lakeside,  Méx.34564SSA IV0.5 IU/ml
Streptomycin Lakeside,  Méx.75757SSA IV35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic capsCorning-Pyrex9826-16X16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-WellCorning-Costar3516Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flaskCorning-Costar430168Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type IAmerican Type Culture CollectionCCL34Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium Gibco 12800-017Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf SerumIn vitroS-02Use at 10%.  
Penicillin/Streptomycin mixture In vitro A-01Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin  AMSA398MJ94SSA IVStock solution 100 IU/ml
Trypsin solution In vitroEN-0050.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flaskCorning-Costar430720Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supportsCorning-Costar34700.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish  Corning-Costar3524Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete MiniRoche11836 153 001Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM 
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)SIGMA-AldrichE3132Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1 Invitrogen402200IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112Homemade antibodyWithout/ NumberIgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgMZymed62-6811Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)Zymed816114Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 ElectrodeWorld Precision Instrument 102711Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeterWorld Precision Instrument 12111Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamberMEARIENFELD610610Hemocytometer 
Leica TCS_SP5_MOLeicaWithout/numberLaser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
VectashieldVector Laboratories, Inc.H-1000Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)SIGMAD-95420.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)US BiologicalA-13100.5%  final concentration for blocking solution

References

  1. Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
  2. Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
  3. Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
  4. Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
  5. Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
  6. Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
  7. Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
  8. Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
  9. Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
  10. Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
  11. Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
  12. Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
  13. Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
  14. Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
  15. Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
  16. Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
  17. Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
  18. Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
  19. Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
  20. Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
  21. Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
  22. Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
  23. Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
  24. Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
  25. Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
  26. Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
  27. Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
  28. Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
  29. Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88 EhCPADH112 MDCK 2

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved