에 의해 제작 상피 손상의 분석<em&gt; Entamoeba 아메바</em&gt; 감염

요약

Entamoeba 아메바에 의한 인체 감염은 아메바 증, 열대 국가에서 설사의 주요 원인으로 이어집니다. 감염은 세포 - 세포 연락처 개방 결과적으로 설사, 때때로 간 감염에 의해 다음 도발, 장 상피 세포와 병원체 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이 문서는 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 초기 호스트 병원체 상호 작용을 평가하는 모델을 제공합니다.

초록

Entamoeba의 아메바는 인간의 아메바 증의 원인 물질, 열대 국가에서 설사와 간 농양의 주요 원인이다. 감염은 장 상피 세포와 병원체의 상호 작용에 의해 시작됩니다. 이러한 상호 작용은 꽉 접합 (TJ)로 세포 간 구조의 붕괴로 연결됩니다. TJ는 창자 루멘에서 호스트 조직을 분리하는 상피 층의 밀봉을 보장합니다. 최근의 연구에 기생 단백질 EhCPADH112으로 TJ의 중단이 E.의 전제 조건임을 증거를 제공 상피 장벽 기능 장애를 동반 아메바 침공. 따라서, E. 동안 TJ 분해에 관련된 분자 메커니즘의 분석 아메바 침공은 아메바 증의 발병 기전에 대한 우리의 이해를 개선하기 위해 매우 중요합니다. 이 문서에서는 초기 호스트 병원체 상호 작용의 평가 및 기생충의 침입 가능성을 확인하기 쉬운 모델을 제시한다. 분석 할 매개 변수 T를 포함ransepithelial 전기 저항, 상피 세포 표면 수용체, 표현의 변화와 상피 접합부 마커 및 상피 세포 내 기생충 분자의 현지화 현지화와 EhCPADH112의 상호 작용.

서문

Entamoeba의 아메바는 염증과 설사. E.의 원인이 인간의 아메바 증, 장 감염의 책임있는 단일 셀의 원생 동물이다 아메바는 연간 5000 만 개인에게까지 감염 있지만, 감염된 사람의 약 10 %는 아메바 증 ^1에 관련된 증상을 개발할 수 있습니다. 감염 E를 포함하는 오염 된 음식이나 물을 섭취에 발생 아메바 포낭. 소장에서, 낭종은 결장 점액을 준수하고 ² 증식 라이브 trophozoites을 생산하고 있습니다. Trophozoites은 일반적으로 대변을 통해 배설된다 낭종을 형성한다. 다른 경우 아직 알 수없는 이유로, trophozoites는 장 상피 층을 중단하고 기본 조직을 공격. 최악의 경우에, 그들은 혈류를 입력하고 ³ 간 등의 다른 장기에 영향을 미친다.

상피 장벽을 깨고 합류 세포를 유지 상피 transmembranal 구조의 중단을 요구합니다. 상피 세포연락처 타이트 (TJ)로 구성된 정점 접합부 복합체 형성 및 접합 (AJ)에있는 adherens, ^4를 데즈 모섬 있습니다. 가장 꼭대기 접합 TJ 있으며, 따라서 이들은 E. 의해 상하게 제 베리어 호스트 침입 동안 아메바와 다른 병원균. TJ는 같은 인접 셀의 수용체와 호모 또는 heterophilic 상호 작용에 관여 claudins, occludin 및 접합부 접착 분자 (JAM)로 transmembranal 접착 수용체로 구성되어 있습니다. 그들은 세포 내 상피 세포에 더 기계적 강도를 제공하는 굴지의 골격에 부착 수용체를 연결 (ZO) 가족 zonula의 occludens의 발판 분자에 의해 바인딩됩니다. TJ는 과도한 물과 용질의 누설을 방지, 창자 루멘에서 장 조직을 밀봉 할 책임이 있습니다. TJ는 기생충에 의해 중단 된 후 따라서, 조직은 침략있다. E. (I) TARG에 아메바의 접착에 관련된 사람들 : 아메바 같은 다양한 분자를 분비등의 셀 ^(5); 세포 외 유출에 의해 숙주 세포의 살해에 참여하는 (ⅱ) 막 - 활성 인자, 예를 들어 칭했다 이온 채널 형성 펩티드 ^6,7 amoebapores; 그리고 (iii) 세포 외 매트릭스 단백질을 분해 및 조직 붕괴 ^5,8,9을 중재 단백.

함께 EhCPADH112 착체를 형성 시스테인 프로테아제 EhCP112 및 유착 분자 EhADH112 두 E. 아르 아메바 TJ ^(10)의 분해에 중요한 역할을하는 단백질을 독성. 라이브 trophozoites, 자신의 총 해물과 분비 제품은 상피 장벽의 TJ 복잡하고 기능 장애의 분자 변화를 유도한다. 이 연구에서, EhCP112 및 EhADH112 따라서 E.에게 용이 occludin 내면화하고 세포 단백질의 저하로 이어지는 claudin-1 단백질과 상호 작용하는 것을 알 수있다 세포층의 경로를 통해 아메바 입구.

우리의 데이터와 그 오F 다른 그룹 ^{11-17 강력} 기생충의 침입을 허용 특정 호스트 병원체 상호 작용의 필요성을 제안합니다. 이러한 상호 작용의 분자 기초를 이루는 것은 아메바 증의 발병 기전에 대한 이해를 위해 가장 중요합니다. 증가 된 세포층의 투과성을 특징 trophozoites 의해 TJ의 선택적 교란, transepithelial 전기 저항의 감소 (TER)에 의해 측정 될 수있다. 호스트 상피으로 기생 단백질의 전이는 면역 형광 염색과 공 초점 레이저 현미경도 가능 직접 상호 작용을 나타내는 상피 접합부 마커 아메바 독성 요인의 공동 현지화를 공개 할 수있는 방법으로 측정 할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 상피 세포와 trophozoites가 재배 수확 및 호스트 병원체 상호 작용과 그 영향을 검토하기 위해 조작하는 방법을 자세히 설명합니다.

프로토콜

E. 1. 구축 및 유지 아메바 문화

1. (다른 오염 생물의 전체 무료) axenically 성장 Entamoeba 아메바 균주 HML의 1 × 10 ⁵ trophozoites : IMSS는 테프론 라이너 스크류 캡 (또는있는 일회용 T-1 × 10 ⁶ trophozoites와 ¹⁸ 125 X 16 MM 문화 튜브를 복제 25 플라스크) 15 ㎖ (또는 TYI-S-33 매체의 T-25 플라스크에 50 ㎖) (TYI 국물이 3 % 다이아몬드 비타민 혼합물, 10 %의 열 불 활성화 성인 소 혈청, 0.5 IU / ㎖ 페니실린, 35 μg로 보충 / ㎖, 37 ℃에서 인큐베이터에 스트렙토 마이신) ¹⁹
2. 48-96 시간 간격으로 통상 대수 증식기 유리 배양 관에 부착 trophozoites를 해제 빙수 욕에서 50-10 분 동안 배양 튜브 얌전 순서 (도 1) 동안 수확 trophozoites.
3. 원뿔 튜브에 문화를 전송하고 CEL을 분산하도록 여러 번 반전LS. 혈구 (Neubauer의 챔버)를 사용하여 세포 수를 결정하고 신선한 TYI-S-33의 매체를 포함하는 문화 튜브에 접종을 전송합니다.
   1. 더 이상 부화 기간 (~ 5 일 동안 ~ 3 × 10 ⁵ 세포) 짧은 기간 동안 높은 숫자 (1 ~ 하루 ~ 1 × 10 ⁶ 세포)에 아메바의 낮은 숫자를 사용합니다. 계산 접종이 바람직하지만 접종의 예상 볼륨이 실현되도록 ​​수립 문화가 예측된다.
   2. 각 실험에 대한 세포 수를 최적화하는 trophozoites의 양을 적정한다.
   3. 부주의로 오염이나 튜브 파손의 경우 백업을 가지고 병렬 중복 문화를 유지한다.
4. 캡 튜브는 단단하고 수평 각도를 기울이면 5 °에서 37 ° C에서 그들을 품어.
5. 문화의 과도한 성장이 많은 용해 세포를 포함 할 수 있기 때문에, 정기적으로 육안 검사에 의해 문화를 확인합니다.

MDCK 문화 2. 구축 및 유지

1. (Madin 다비 송곳니 신장) 세포 / 0.08 U (인슐린, 페니실린 (100 IU / ㎖), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖)와 보충 DMEM 매체 10 ㎖로 처분 할 수있는 T-75 플라스크에 I (고 저항)를 입력 MDCK 성장 37 ° C에서 5 % CO _2, 95 % 공기의 가습 분위기 ㎖)과 10 %의 신생아 혈청
2. 셀을 분할하려면, 거꾸로 현미경에 그 (것)들을 검사한다. 그들은 ~ 8​​5-100% 합류 할 때 셀을 분할합니다.
3. 멸균 후드와 문화에서 미디어를 제거하는 멸균 유리 파스퇴르 피펫에 진공 흡입기를 사용합니다. 세포를 긁어 피하려면, 하단 모서리에서 거꾸로 플라스크 대기음 미디어를 켭니다.
4. T-25 플라스크의 경우 (5 ㎖ T-75 플라스크에 데워진 PBS (140 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 1.8 mM의 KH ₂ PO _4, 산도 7.4) 10 ㎖를 분배 ) 부드럽게 세포를 씻어 플라스크 바위. 진공 흡인에 의해 PBS를 제거합니다. 혈청, 트립신을 억제하기 때문에 광범위한 세척이 필요합니다.
5. (T-25 플라스크에 0.5 ㎖를 사용)과 부드럽게 트립신 전지 층을 덮도록 플라스크를 흔들 T-75 플라스크에 0.05 % 트립신 1.5ml의 디스펜스.
6. 인큐베이터에서 5 ~ 10 분 (정확한 시간은 트립신의 활동에 따라 다름)에 품어.
7. 빛에 술병을 들고으로 전지의 분리를 확인하고 세포를 흐르는 찾는다. 세포 분리 (반올림 세포)도 현미경을 사용하여 확인할 수 있습니다. 종종 세포가 플라스크의 측면에 빠르고 부드러운 때리고과 빠른 놓습니다.
8. T-75 플라스크 (T-25 플라스크에 대한 5 ㎖)을 보충 DMEM 15 ML을 추가합니다. 로 pipetting 아래로 4 ~ 5 배 세포를 Resuspend.
9. 세포를 전파하기 위해, 신선한 DMEM 배지와 세포 현탁액 1:5 희석. 세포 수는 혈구 계를 사용하여이 지점에서 결정될 수 있지만, 특정 분석을위한 특별한 형식으로 세포를 분리하는 경우이 보통 단지 필요하다.

Trophozoite 총 해물 3. 준비

1. CU에서 trophozoites를 분리빙수 욕에서 5-10 분 동안 튜브를 얌전 의해 LTURE 튜브. 4 ℃에서 10 분 동안 360 XG에서 원뿔 튜브와 원심 분리기로 문화 무균 이동 조심스럽게, 경사 분리하여 상층 액을 버린다 펠릿에 얼음처럼 차가운 PBS를 추가, 10 분 동안 360 XG에서 다시 세포와 원심 분리기를 분산하기 위해 튜브를 여러 번 반전. TYI-S-33 매체의 모든 흔적을 제거하기 위해 두 번이 단계를 반복합니다.
2. 혈구를 사용하여 trophozoites 번호를 확인합니다.
3. 를 Lyse 동결 해동 사이클에 의해 trophozoites. 1 분 동안 액체 질소에, 얼음처럼 차가운 PBS에 희석 trophozoites의 측정 접종 (60 trophozoites / ㎖)를 스냅 동결. 적극적으로 4 ° C와 소용돌이에서 샘플을 녹여. 세포 용해를 완료하기 위해 동결 융해 3 번 반복합니다.
4. 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올로 용해 액에 존재하는 단백질 분해 효소를 활성화합니다.

Trophozoite 분비 제품 4. 준비

1. 단계 3.2에 3.1를 수행합니다.
2. 결정혈구를 사용하고 트리 판 블루 배제 테스트 ^(20)를 적용하는 시점에서 세포 수 및 생존력 :
   1. 50 ML 원뿔 관에 9 × 10 ⁶ 3 ML 얼음처럼 차가운 PBS에 trophozoites 및 전송 세포를 희석. 현탁액의 10 μl를 타고 0.4 % 트리 판 블루 stock 용액의 pH 7.2의 1 μl를 추가합니다.
   2. 낮은 배율로 세포를 계산하는 Neubauer의 챔버를 사용합니다.
   3. 모든 셀을 계산하고 푸른 세포가 색소를 촬영하고 죽은 것으로 간주해야하기 때문에, 파란색 셀의 수를 구분합니다.
   4. 셀의 전체 개수에 의해 생존 세포의 수를 나누어 100을 곱함으로써 생존 세포의 백분율을 계산한다.
3. 수평 각도를 기울이면 5 °에서 2 시간 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 trophozoite 서스펜션을 포함하는 원뿔 튜브를 전송합니다.
4. 10 분 360 XG에서 분비 된 제품, 원심 분리기 튜브를 수집합니다. 일회용 멸균 주사기를 사용하여 조심스럽게 SU에게 수집맑은 상등, 펠릿으로부터 trophozoites과 시료의 오염을 방지. 0.22 μm의 셀룰로오스 아세테이트 막을 통해 뜨는을 전달하여 어떤 전송 세포를 제거합니다. 0.02 %의 β-머 캅토 에탄올과 단백질 분해 효소를 활성화합니다.
5. 죽은 세포에서 방출 분자와 추정 원하지 않는 오염을 버리고, 세포 생존 능력의 트리 판 블루 배제 시험을 다시 적용합니다. 4.2 단계에서 얻어진 세포의 생존과 총 수는 동일해야합니다. 이 경우가 아니라면, 수집 된 상등액을 포함하는 단백질을 분비 할 수뿐만 아니라 폐기되어야한다.

Trophozoites, Trophozoite 해물 또는 분비 제품과 MDCK 세포의 5. 상호 작용

1. 라이브 trophozoites (1:1의 MDCK - 투 - 아메바 비율)에 합류 MDCK 세포 단일 층을 품어, trophozoite 해물 (MDCK - 투 - 아메바 1:2 비율) 또는 분비 제품 (1 MDCK - 투 - 아메바 비율 : 10) 2 30 분 (그림 2A) 37 ° C에서.
2. 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 얼음처럼 차가운 PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오.

면역 형광 검사를위한 샘플 6. 준비

1. 24 멀티 웰 세포 배양 접시 안에 배치 멸균 유리 커버 슬립에 문화 MDCK 세포. 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 그런 다음, 신선한 보충 DMEM 배지 1 ml의 매체를 대체하고 더 24 시간 동안 37 ° C 배양기에 플레이트를 전송합니다.
2. 진공 흡입기 및 멸균 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 매체를 제거하고 각 웰에 따뜻한 PBS 1 ㎖를 추가합니다. PBS를 제거하고 신선한 PBS로 세척을 반복합니다. 유리 피펫 우물의 바닥에서 세포가 긁히지 않도록주의하십시오.
3. 라이브 trophozoites (T), trophozoite 총 해물 (TL)과 분비 제품 (SP) : 따뜻한 PBS 1 ㎖에 희석 trophozoites의 다른 조건을 추가합니다.
   1. 2 또는 30 분 동안 인큐베이터에서 배양 플레이트를 넣습니다.
   2. MDCK 세포가 E.와 함께 배양해야하는지 하나라는 시간 0 분, 두 개의 제어 조건을 준비 아메바하지만 따뜻한 PBS 1 ㎖와; 이 경우 이차 항체 제어와 같은 다른 조건은 2 또는 30 분 동안 T, TL 또는 SP와 MDCK을 배양하고 기본 항체와 부화를 생략합니다.
4. 언 바운드 분자 또는 trophozoites을 제거하기 위해 차가운​​ PBS와 상피 세포 다섯 번 씻으십시오.
5. 수정 및 C. -20 °에서 30 분 동안 96 % 에탄올 1 ㎖로 세포를 투과
6. 에탄올을 제거하려면, 실온에서 1 ㎖의 PBS로 3 빠른 세척을 수행합니다.
7. 시료의 건조를 방지하기 위해 습한 챔버에서 다음 단계를 수행
   1. 폐쇄 및 샘플을 안전하게 배치 할 수있는 젖은 종이 타월로 가득 수 있습니다 가능한 평면 상자를 사용합니다. 예를 들어, 빈 피펫 팁 상자가 아니라이 목적을 제공합니다.
   2. 챔버 내부에 균일하게 파라 필름 층과 피펫 블록의 25 μl를 배치각 coverslip에 대한 솔루션 (0.5 % BSA)을 주입.
   3. 미세 집게와 우물 밖으로 커버 슬립을 조심스럽게 여과지 가장자리에서 물기를 제거하고 세포가 차단 솔루션을 향 차단 솔루션 (0.5 % BSA)을 포함하는 드롭에 커버 슬립을 넣어. 실온에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다.
8. PBS의 기본 항체의 혼합물을 준비 IgM 항체 마우스 방지 EhCPADH112 (mα-EhCPADH112 1:10 희석)와 IgG의 토끼 반 ZO-1 (Pα-ZO-1, 1:100 희석).
9. 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 항체 용액 25 μL에서 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다.
10. 블로킹 용액으로부터 커버 슬립을 올리고 여과지를 이용하여 에지에서 과도한 액체를 건조하고, 세포가 항체 용액을 향하게 알갱이에 넣지. 4 ℃에서 하룻밤 샘플을 품어
11. (상단에 셀 측) 24 멀티 웰의 우물에 각 coverslip에 넣어 1 ㎖의 PBS를 추가합니다.
    1. 언 바운드 분자를 제거하는 PBS 1 ㎖와 다섯 번 씻으십시오.
12. FITC 결합 염소 항 - 마우스 IgM 항체 (1:100 희석) 및 TRITC (1시 50분 희석)에 결합 된 염소 항 - IgG의 토끼 : PBS의 형광 차 항체의 혼합물을 준비합니다.
13. 습기 상자와 펫 각 coverslip에 대한 이차 항체 용액 25 μL로 파라 필름의 신선한 시트를 놓습니다.
14. 6.10에서와 같이 샘플을 전송하고 형광 염료의 탈색을 방지하기 위해 어둠 속에서 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 6.11.1 단계를 반복합니다.
15. 핵 염색의 경우, 상온에서 0.05 ㎜ DAPI 용액 200 ㎕를 3 분 동안 부화와 빛으로부터 보호합니다. 6.11.1 단계를 반복합니다.
16. 형광 염료를 절약 Vecta 방패 유리 현미경 슬라이드에 장착 솔루션을 antifade 5 μL로 커버 슬립 (세포가 아래로 향하게)을 배치합니다. 샘플 건조를 방지하기 위해 매니큐어를 사용하는 커버 전표를 밀봉.
17. 장기 기억,에 슬라이드를 계속-20 ° C에서 현미경 슬라이드 상자
18. Z-스택 섹션과 XZ-평면 (그림 2A)를 통해 공 초점 현미경으로 준비를 분석합니다.

프로테아제 억제제 또는 특정 항체와 Trophozoites 7. 보육

1. 반복 3.2 3.1 단계를 반복합니다. 각 실험 조건의 경우, 4에서 20 분 동안 단백질 분해 효소 (전체 1 ㎜ 및 40 ㎍ / ㎖의 E-64) 억제제 또는 EhCPADH112 (mαEhCPADH112)에 30 μg의 단일 클론 항체 ⁽²¹⁾ (50 ㎕의 PBS에 재현 탁) 1 × 10 ⁵ trophozoites을 품어 ° C (그림 2B). 단계 8.5에서 설명한대로 공동 배양 분석을 위해 이러한 준비를 사용합니다.

8. Transepithelial 전기 저항의 측정 (TER)

1. 멸균 트랜스 웰 투과 지원 (0.4 μm의 기공 크기)에 문화 MDCK 세포. 상부 구획에서, 100 ㎕의 세포 현탁액 및 하부 구획에 배치보충 DMEM 배지 600 μl를 놓습니다.
   1. 주기적으로 중간 수준을 확인합니다. 필요에 따라 새로운 매체를 추가 할 수 있습니다.
   2. 그들이 합류의 100 %에 도달 할 때까지 거꾸로 현미경의 세포를 검사합니다. 2-3 일마다 중간 변경합니다.
   3. 세포 부착 (필요한 경우)을 개선하기 위해, 세포 현탁액을 추가하기 전에 DMEM에서 37 ° C에서 하룻밤 트랜스 웰 필터를 평형.
2. 에탄올에 침지 후드 STX2 전극을 소독하고 멸균 PBS에서 UV 빛 아래 15 분 각각에 대한. EVOM 상피 voltohmmeter에 전극을 연결하고 저항 모드를 선택합니다.
3. 각 트랜스 웰의 상부 구획에서 매체를 수집하고이를 풀. 이 미디어 혼합물의 50 μl를 타고 trophozoites 현탁액 50 μL (PBS에 1 × 10 ⁵ trophozoites) 또는 만 PBS (대조군)와 결합. 각 트랜스 웰의 유사한 혼합물을 사용합니다.
4. 각 트랜스 웰의 containin의 상부 챔버에 혼합물을 추가G MDCK 세포. 실험 조건은 trophozoites (제어)없이 trophozoites 또는 단백 분해 효소 억제제 또는 mαEhCPADH112 사전 배양 trophozoites와 공동 문화를 MDCK 세포를 포함한다. 필터에 의해 제공되는 저항을 제거하기 위해, 단지 배지로 배양 트랜스 웰을 사용한다. 각 실험 조건은 적어도 세 개의 트랜스 웰하십시오.
5. 즉시, 각 트랜스 웰에 STX2 전극을 찍기 TER을 측정합니다.
   1. 긴 전극이 하부 챔버의 바닥을 만지고 짧은 전극 (그림 2B 참조) 상부 구획 중간에 포함되어 있는지 확인합니다.
   2. 마다 수직으로 전극을 보유해야합니다. 이것은 크게, 재현성을 향상시킬 것입니다. 이 데이터의 변화로 이어질 것으로 이동하거나 측정하는 동안 전극을 기울 마십시오.
6. 이 측정은 초기 TER 값으로 간주해야한다. 그 후, 다음 과정을 모니터링 TER30 분.
7. TER 최종 값을 계산하기 위해, 전용 필터의 TER 값을 뺀다. 다른 실험에서 결과를 비교하려면 100 % (그림 2B)로 다음을 고려하여 초기 값으로 각 데이터 포인트를 정상화.

결과

성공적인 E.에 대한 아메바의 문화는 중요한 두 가지 조건이 충족되어야합니다 로그 단계에서 무균 조건과 수확의 성장. E.의 이전, 문화 아메바는 쉽게 세균이나 trypanosomatids ^22의 특정 종과 공동으로 설립되었다. 그러나, 요즘은 대사 박테리아, 곰팡이, 원생 동물, 또는 후생 동물 세포없는 환경에있는 아메바의 무기한 subcultivati​​on을 의미하는이 기생충의 무?...

토론

E.에 의해 상피 감염 동안 체외 호스트 병원체 상호 작용을 연구하기 위해 아메바, 그것은 상피 세포와 trophozoites 모두의 잘 확립 된 문화와 함께 작동하는 데있어 매우 중요합니다. 예를 들어, 이전의, E. 아메바의 문화는 일반적으로 세균이나 trypanosomatids ^{(22, 23)의} 특정 종과 공동으로 설립했다. E.의 그러나 공동 재배 숙주 세포에서 관찰 된 효과가 명백하?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution