Analyse de l&#39;altération de l&#39;épithélium Produit par<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Maladies infectieuses

Résumé

L'infection humaine par E. histolytica conduit à l'amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction d'agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l'intestin, provoquant l'ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d'une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte-pathogène pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase.

Résumé

Entamoeba histolytica est l'agent causal de l'amibiase humaine, une cause majeure de diarrhée et abcès du foie dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction de l'agent pathogène aux cellules épithéliales de l'intestin. Cette interaction conduit à la rupture des structures intercellulaires tels que les jonctions serrées (TJ). TJ assurer l'étanchéité de la couche epitheliale pour séparer le tissu de l'hôte à partir de lumière de l'intestin. Des études récentes fournissent la preuve que la perturbation de la EhCPADH112 TJ en protéine de parasite est une condition préalable à E. invasion de histolytica qui est accompagné par un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Ainsi, l'analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans TJ démontage pendant E. invasion de histolytica est d'une importance capitale pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase. Cet article présente un modèle simple qui permet l'évaluation des interactions initiales hôte-pathogène et le potentiel d'invasion de parasites. Paramètres à analyser sont trésistance électrique ransepithelial, l'interaction de EhCPADH112 avec les récepteurs de surface épithéliales, changements dans l'expression et la localisation de marqueurs de jonction épithéliales et la localisation des molécules du parasite dans les cellules épithéliales.

Introduction

Entamoeba histolytica est un protozoaire responsable de l'amibiase humaine, une infection intestinale cellule causant l'inflammation et la diarrhée. E. histolytica infecte jusqu'à 50 millions de personnes chaque année, mais seulement 10% des personnes infectées développent les symptômes associés à l'amibiase ^1. L'infection se produit lors de l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés contenant E. kystes histolytica. Dans l'intestin, les kystes produisent trophozoïtes vivants qui adhèrent à côlon mucine et prolifèrent ^2. Trophozoïtes forment habituellement des kystes qui sont excrétés par les selles. Dans d'autres cas et pour des raisons encore inconnues, trophozoïtes briser la couche épithéliale intestinale et envahissent les tissus sous-jacents. Dans le pire des cas, ils entrent dans la circulation sanguine et affectent d'autres organes tels que le foie ^3.

Briser la barrière épithéliale nécessite bouleversement des structures transmembranaires épithéliales qui maintiennent les cellules jointes. Cellules épithélialesdes contacts sont formés par le complexe constitué de jonction étanche apical (TJ), et des jonctions adhérentes (AJ), et des desmosomes ^4. Les jonctions apicales sont plus TJ, et par conséquent, ils sont la première barrière offensé par E. histolytica et d'autres agents pathogènes lors de l'invasion de l'hôte. TJ sont constitués de récepteurs d'adhésion transmembranaires telles que claudines occludine, et des molécules d'adhésion jonctionnelle (JAM) qui s'engagent dans des homo-ou des interactions hétérophiles avec les récepteurs de la cellule voisine. Ils sont liés par voie intracellulaire des molécules d'échafaudage des zonula occludens (ZO) de la famille qui relient les récepteurs d'adhésion à cytosquelette d'actine de fournir un complément de résistance mécanique à l'épithélium. TJ sont responsables de tissu intestinal d'étanchéité à partir de la lumière intestinale, ce qui empêche l'excès d'eau et les fuites de soluté. Ainsi, après TJ sont perturbés par le parasite, les tissus sont envahis. E. histolytica sécrète plusieurs molécules telles que: (i) ceux qui sont impliqués dans l'adhésion des amibes à targET cellules ^5; (Ii) les facteurs de membrane active qui participent à la destruction des cellules hôtes par exocytose, par exemple les peptides formant des canaux-ioniques appelés amoebapores ^6,7; et (iii) des protéinases qui dégradent les protéines de la matrice extracellulaire et la médiation de tissu désintégration ^5,8,9.

La cysteine ​​protease EhCP112 et la molécule d'adhésion EhADH112 que forment ensemble le complexe EhCPADH112 sont deux E. histolytica virulence des protéines qui jouent un rôle majeur dans le démontage de TJ ^10. Trophozoïtes vivants, de leurs lysats totaux et produits sécrétés induisent des changements moléculaires dans la perturbation complexe et fonctionnelle TJ de la barrière épithéliale. Dans cette étude, il est démontré que EhCP112 et EhADH112 interagissent avec occludine et la claudine-1 protéines menant à l'internalisation et la dégradation des protéines cellulaires, facilitant ainsi E. entrée de histolytica par la voie paracellulaire.

Nos données et celles of autres groupes ^11-17 suggèrent fortement la nécessité des interactions hôte-pathogène spécifiques qui permettent l'invasion du parasite. Éclaircir la base moléculaire de ces interactions est d'une importance capitale pour une meilleure compréhension de la pathogenèse amibiase. Perturbation sélective de trophozoites en TJ, caractérisé par augmentation de la perméabilité paracellulaire, peut être mesurée par une diminution de la résistance électrique trans-épithéliale (TER). Le transfert des protéines parasitaires vers l'épithélium de l'hôte peut être déterminé par une coloration par immunofluorescence et microscopie confocale à balayage laser, une méthode qui peut également révéler la co-localisation des facteurs de virulence amibes avec des marqueurs épithéliaux jonctionnels indiquant des interactions directes possibles. Dans cet article, nous décrivons en détail comment les cellules épithéliales et les trophozoïtes sont cultivés, récoltés et manipulés pour examiner les interactions hôte-pathogène et leurs conséquences.

Protocole

1. Mise en place et entretien de E. Cultures histolytica

1. Cultivez axéniquement (entièrement libre de tous les autres organismes contaminants) 1 x 10 ⁵ trophozoïtes de la souche de Entamoeba histolytica HML: IMSS cloner un ¹⁸ en 16 x 125 tubes de culture en mm avec revêtement Téflon capsules à vis en ligne (ou 1 x 10 ⁶ trophozoïtes dans un jetable T- 25 flacon) et 15 ml (ou 50 ml en flacon T-25) de TYI-S-33 moyen (bouillon TYI complété avec 3% d'un mélange de diamant de la vitamine, 10% de sérum de chaleur de bovin adulte inactivé, 0,5 UI / ml de pénicilline et 35 pg / ml de streptomycine) ¹⁹ dans un incubateur à 37 ° C.
2. trophozoites de récolte au cours de la phase de croissance logarithmique habituellement à des intervalles de 48 à 96 hr (figure 1) en refroidissant les tubes de culture pendant 5-10 min dans un bain d'eau glacée pour libérer trophozoites attachés au tube de culture en verre.
3. Transférer la culture dans un tube conique et inverser plusieurs fois pour disperser la cells. Déterminer le nombre de cellules en utilisant un hématimètre (de Neubauer), et transférer un inoculum dans un tube de culture contenant du milieu TYI-S-33 frais.
   1. Utilisez faible nombre de amibes pour de plus longues périodes d'incubation (~ 3 x 10 ⁵ cellules pour ~ 5 jours) et un nombre plus élevé pour des périodes plus courtes (~ 1 x 10 ⁶ cellules pour ~ 1 jour). Alors que inoculum comptés sont souhaitables, cultures établies deviennent prévisibles de sorte que les volumes estimés de inoculums sont réalisables.
   2. Titrer la quantité de trophozoites d'optimiser le nombre de cellules pour chaque expérience.
   3. Maintenir une culture double parallèle d'avoir un back-up en cas de contamination accidentelle ou rupture du tube.
4. tubes de Cap hermétiquement et les incuber à 37 ° C en 5 ° inclinés angle horizontal.
5. Voir les cultures par inspection visuelle régulièrement, depuis une croissance excessive de la culture peut contenir plusieurs cellules lysées.

2. Mise en place et entretien de MDCK Culture

1. Cultivez MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellules de type I (haute résistance) en jetables flacons T-75 avec 10 ml de milieu DMEM complété avec de la pénicilline (100 UI / ml), la streptomycine (100 mg / ml), l'insuline (0,08 U / ml) et 10% de sérum de veau nouveau-né dans une atmosphère humidifiée de 5% _de CO2 et 95% d'air à 37 ° C.
2. Pour diviser les cellules, les vérifier sur un microscope inversé. Fractionner les cellules quand ils sont ~ 85-100% de confluence.
3. Utiliser un aspirateur à vide dans une hotte stérile et d'une pipette Pasteur en verre stérile pour retirer une feuille à partir de la culture. Pour éviter le grattage des cellules, tourner le ballon à l'envers et les médias d'aspiration de l'angle inférieur.
4. Distribuer 10 ml de PBS préchauffé (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7,4) dans un flacon T-75 (5 ml dans le cas d'un flacon T-25 ) et balancer doucement le flacon pour laver les cellules. Retirer du PBS par aspiration sous vide. Lavage approfondie est nécessaire car le sérum inhibe la trypsine.
5. Distribuer 1,5 ml de trypsine à 0,05% dans un flacon T-75 (T-25 pour utilisation flacon 0,5 ml) et doucement basculer le flacon pour couvrir la couche de cellules avec de la trypsine.
6. Incuber pendant 5-10 min dans l'incubateur (heure exacte dépend de l'activité de la trypsine).
7. Vérifiez le détachement des cellules en tenant ballon contre la lumière et rechercher des cellules circulant. détachement cellulaire (cellules arrondies) peut également être contrôlé à l'aide d'un microscope. Souvent, les cellules libèrent plus vite avec un rapide, claque douce sur le côté du ballon.
8. Ajouter 15 ml de DMEM complémenté dans un flacon T-75 (5 ml pour un flacon T-25). Remettre les cellules par aspiration et refoulement 4 ou 5 fois.
9. Pour propager les cellules, diluer la suspension cellulaire à 1:5 avec frais DMEM supplémenté. nombre de cellules peut également être déterminée à ce point à l'aide d'un hémocytomètre mais ce n'est généralement nécessaire que si le fractionnement des cellules dans des formats spéciaux pour certaines analyses.

3. Préparation de Trophozoïte totale Lysats

1. Détachez trophozoïtes de cudes tubes de refroidissement LTURE par le tube pendant 5-10 min dans un bain d'eau glacée. Transférer de manière aseptique la culture dans un tube à centrifuger conique et à 360 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter soigneusement le surnageant par décantation, ajouter du PBS glacé à la pastille, inverser le tube plusieurs fois pour disperser les cellules et centrifuger à nouveau à 360 x g pendant 10 min. Répétez cette étape deux fois pour éliminer toute trace de milieu TYI-S-33.
2. Déterminer le nombre de trophozoïtes utilisant un hématimètre.
3. Lyse trophozoïtes par les cycles de gel-dégel. Snap-geler un inoculum mesurée de trophozoïtes (600 000 trophozoïtes / ml) dilué dans du PBS glacé, dans l'azote liquide pendant 1 min. Libérer l'échantillon à 4 ° C et vortex vigoureusement. Répéter congélation et de décongélation trois fois pour terminer la lyse des cellules.
4. Activer des protéases présentes dans les lysats avec 0,02% de β-mercaptoéthanol.

4. Préparation de trophozoite sécrétées produits

1. Effectuer les étapes 3.1 à 3.2.
2. Déterminernombre de cellules et la viabilité à ce point à l'aide d'un hémocytomètre et l'application d'un test d'exclusion au bleu trypan ^20:
   1. Diluer 9 x 10 ⁶ trophozoites dans 3 ml de PBS glacé et les cellules de transfert dans un tube conique de 50 ml. Prenez 10 pi de cette suspension et ajouter 1 pl de 0,4% solution de bleu trypan stock pH 7,2.
   2. Utilisez une Neubauer à compter les cellules à faible grossissement.
   3. Compter toutes les cellules et séparer le nombre de cellules bleues, puisque les cellules bleues ont pris le colorant et doivent être considérés comme morts.
   4. Calculer le pourcentage de cellules viables en divisant le nombre de cellules viables par le nombre total de cellules et en multipliant par 100.
3. Transférer le tube conique contenant la suspension de trophozoite dans l'incubateur à 37 ° C pendant 2 heures dans un 5 ° inclinés angle horizontal.
4. Pour collecter les produits sécrétés, tubes de centrifugation à 360 g pendant 10 min. Utilisez une seringue jetable et stérile et soigneusement recueillir les supernatant, en évitant la contamination des échantillons avec des trophozoïtes de la pastille. Éliminer toutes les cellules transférées en faisant passer le surnageant à travers une membrane d'acétate de cellulose de 0,22 um. Activer protéases avec 0,02% β-mercaptoéthanol.
5. Pour supprimer la contamination indésirable présumée à des molécules libérées par les cellules mortes, appliquez de nouveau le test d'exclusion au bleu trypan pour la viabilité cellulaire. Viable nombre total de cellules et doit être le même que celui obtenu à l'étape 4.2. Si ce n'est pas le cas, le surnageant recueilli peut non seulement contenir des protéines sécrétées et doit être jeté.

5. Interaction des cellules MDCK avec Trophozoïtes, Trophozoïte Lysats ou sécrétées produits

1. Incuber des monocouches de cellules confluentes MDCK avec trophozoïtes vivants (un ratio MDCK-à-amibe de 1:1), trophozoite lysats (un rapport MDCK-à-amibe de 1:2) ou de produits sécrétés (un ratio MDCK-à-amibe de 1 : 10) à 37 ° C pendant 2 min et 30 (figure 2A).
2. Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS glacé pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoites.

6. Préparation des échantillons pour immunofluorescence

1. Culture des cellules MDCK sur des lamelles de verre stériles placées à l'intérieur d'une boîte de culture cellulaire à 24 puits multiples. Inspecter les cellules sur le microscope inversé jusqu'à ce qu'ils atteignent 100% de confluence. Ensuite, remplacez moyenne avec 1 ml de milieu frais DMEM supplémenté et transférer la plaque à un incubateur à 37 ° C pendant 24 heures de plus.
2. Supprimer le milieu à l'aide d'une trompe à vide et d'une pipette Pasteur en verre stérile et ajouter 1 ml de PBS chaud à chaque puits. Retirer du PBS et répéter le lavage avec du PBS frais. Prendre soin de ne pas racler les cellules à partir du fond du puits à la pipette en verre.
3. Ajouter des conditions différentes de trophozoïtes dilué dans 1 ml de PBS chaud: trophozoïtes vivants (T), lysats totaux trophozoïtes (TL) et de produits sécrétés (SP).
   1. Mettez la plaque de culture dans l'incubateur pendant 2 ou 30 min.
   2. Préparer deux conditions de contrôle: un temps nommé 0 min, où les cellules MDCK doivent être non incubés avec E. histolytica, mais seulement avec 1 ml de PBS chaud; et une autre condition que le contrôle des anticorps secondaires, dans ce cas incuber MDCK avec T, TL ou SP pour 2 ou 30 min et omettre incubation avec des anticorps primaires.
4. Laver les cellules épithéliales cinq fois avec du PBS froid pour éliminer les molécules non liées ou des trophozoïtes.
5. Fixer et perméabiliser les cellules avec 1 ml d'éthanol à 96% pendant 30 min à -20 ° C.
6. Pour éliminer l'éthanol, effectuer trois lavages rapides avec 1 ml de PBS à température ambiante.
7. Effectuez les étapes suivantes dans une chambre humide pour éviter le séchage des échantillons:
   1. Utilisez une boîte plate disponible qui peut être fermé et rempli avec une serviette de papier humide sur lequel les échantillons peuvent être placés en toute sécurité. Par exemple, une boîte de pointe de la pipette vide sert bien cet effet.
   2. Intérieur de la chambre, placer une couche uniforme de Parafilm et pipette 25 ul de blocsolution (0,5% de BSA) tion pour chaque lamelle.
   3. Prendre des lamelles sur les puits avec une pince fine, enlever soigneusement le liquide en excès à partir du bord avec un papier filtre et mis lamelle couvre-objet dans la goutte contenant une solution de blocage (0,5% de BSA) avec les cellules en regard de la solution de blocage. Incuber les échantillons pendant 1 heure à température ambiante.
8. Préparer un mélange d'anticorps primaires dans PBS: souris IgM anti-EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; dilution 1:10) et IgG de lapin anti-ZO-1 (pα-ZO-1; dilution 1:100).
9. Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de solution d'anticorps pour chaque lamelle.
10. Soulever les lamelles couvre-objet à partir de la solution de blocage, sécher tout excès de liquide au niveau des bords à l'aide d'un papier filtre, et les placer dans les gouttes avec les cellules faisant face à la solution d'anticorps. Incuber les échantillons pendant une nuit à 4 ° C.
11. Mettez chaque lamelle dans un puits d'une 24 puits multiples (côté pile sur le dessus) et ajouter 1 ml de PBS.
    1. Lavez cinq fois avec 1 ml de PBS pour éliminer les molécules non liées.
12. Préparer un mélange d'anticorps secondaires fluorescents dans PBS: souris anti-IgM de chèvre couplé au FITC (dilution 1:100) et de chèvre anti-IgG de lapin couplé à TRITC (dilution 1:50).
13. Placer une nouvelle feuille de Parafilm dans la zone humide et pipette 25 ul de la solution d'anticorps secondaire pour chaque lamelle.
14. Transférer les échantillons comme dans l'6,10 et incuber pendant 1 heure à température ambiante dans l'obscurité pour éviter la décoloration des colorants fluorescents. Répétez l'étape 6.11.1.
15. Pour la coloration nucléaire, incuber pendant 3 min avec 200 ul d'une solution 0,05 mM de DAPI à la température ambiante et l'abri de la lumière. Répétez l'étape 6.11.1.
16. Pour conserver les colorants fluorescents, placer les lamelles (cellules vers le bas) dans 5 pi Vecta Bouclier Antifade solution de montage sur des lames de microscope en verre. Sceller les lamelles à l'aide de vernis à ongles pour éviter le séchage de l'échantillon.
17. Pour le stockage à long terme, maintenir les diapositives d'uneBoîte de lame de microscope à -20 ° C.
18. Analyser les préparatifs de la microscopie confocale à travers les sections Z-stack et XZ-avions (figure 2A).

7. Incubation de trophozoïtes avec inhibiteurs de protéase ou des anticorps spécifiques

1. Répétez les étapes 03.01 à 03.02. Pour chaque condition expérimentale, incuber 1 x 10 ⁵ trophozoïtes (remises en suspension dans 50 pl de PBS) avec des inhibiteurs de la protéase (1 mm complètes et 40 pg / ml E-64) ou 30 mg d'anticorps monoclonal contre EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ pendant 20 min à 4 ° C (figure 2B). Utilisez ces préparations pour essais de co-incubation, comme décrit dans l'étape 8.5.

8. Mesures de résistance électrique transépithéliale (TER)

1. Culture des cellules MDCK sur des supports perméables Transwell stériles (0,4 um de taille de pore). Dans le compartiment supérieur, placer 100 pl de suspension cellulaire et dans le compartiment inférieurplacer 600 ul de milieu DMEM supplémenté.
   1. Vérifiez périodiquement le niveau moyen. Du milieu frais peut être ajouté au besoin.
   2. Inspecter les cellules sur un microscope inversé jusqu'à ce qu'ils atteignent 100% de confluence. Changer le milieu tous les 2-3 jours.
   3. Pour améliorer la fixation des cellules (si nécessaire), équilibrer les filtres Transwell pendant une nuit à 37 ° C dans du DMEM avant addition de la suspension cellulaire.
2. Stériliser électrodes de STX2 dans la hotte par immersion dans de l'éthanol et ensuite dans de la PBS stérile pendant 15 min chacune, sous lumière UV. Connecter les électrodes à un épithéliale voltohmmeter EVOM et sélectionner le mode de résistance.
3. Recueillir milieu du compartiment supérieur de chaque puits transversal commun et les. Prenez 50 pi de ce mélange de médias et les combiner avec 50 pi de trophozoïtes suspension (1 x 10 ⁵ trophozoïtes dans PBS) ou avec seulement PBS (contrôle). Utilisez un mélange similaire pour chaque transwell.
4. Ajouter des mélanges à la chambre supérieure de chaque containin transwellg les cellules MDCK. Les conditions expérimentales comprennent les cellules MDCK sans trophozoïtes (contrôle), une co-culture avec des formes végétatives ou trophozoïtes pré-incubées avec les inhibiteurs de protéase ou mαEhCPADH112. Pour éliminer la résistance offerte par les filtres, utiliser transwells incubées avec seulement moyen. Pour chaque condition l'utilisation expérimentale d'au moins trois transwells.
5. Immédiatement, mesurer TER en immergeant les électrodes de STX2 dans chaque transwell.
   1. Faire en sorte que l'électrode ne touche plus le fond de la chambre inférieure et plus courte que l'électrode est recouverte par le compartiment supérieur en moyenne (voir figure 2B).
   2. Assurez-vous de tenir les électrodes perpendiculairement à chaque fois. Cela permettra d'améliorer la reproductibilité, de manière significative. Évitez de déplacer ou incliner l'électrode pendant les mesures, car cela conduira à une variation des données.
6. Cette mesure doit être considérée comme la valeur du TER initiale. Ensuite, suivre le TER au cours de la suivante30 min.
7. Pour calculer la valeur de TER finale, soustraire la valeur du TER de seulement filtres. Pour comparer les résultats de différents essais normaliser chaque point de données pour les valeurs initiales, celles-ci prenant comme 100% (Figure 2B).

Résultats

Pour un succès E. culture histolytica, deux conditions importantes doivent être remplies: la croissance dans des conditions axéniques et récolte en phase logarithmique. Auparavant, les cultures de E. histolytica ont facilement créé en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22. Cependant, de nos jours, il est courant d'avoir la culture axénique de ce parasite qui signifie une sous-culture indéfinie des amibes dans un environnement exempt de...

Discussion

Afin d'étudier in vitro les interactions hôte-pathogène dans lors de l'infection par E. épithéliale histolytica, il est essentiel de travailler avec des cultures bien établies des deux cellules épithéliales et trophozoïtes. Par exemple, autrefois, E. cultures histolytica habituellement avaient été mis en place en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22,23. Cependant, la co-culture de E. cultures...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution