Анализ ущерба эпителиальных Продюсеры<em&gt; Entamoeba гистолитика</em&gt; Инфекция

Резюме

Инфекции человека на Entamoeba гистолитика приводит к амебиаза, одной из основных причин диареи в тропических странах. Инфекция инициируется патогена взаимодействия с эпителиальных клеток кишечника, провоцируя открытие межклеточных контактов и, следовательно, понос, иногда с последующим инфекции печени. Эта статья представляет собой модель для оценки ранние хост-патогенных взаимодействия для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза.

Аннотация

Entamoeba гистолитика является возбудителем человеческого амебиаза, одной из основных причин диареи и печеночной абсцесса в тропических странах. Заражение инициируется взаимодействием возбудителя с эпителиальных клеток кишечника. Это взаимодействие приводит к нарушению межклеточных структур, таких как плотных контактов (TJ). TJ обеспечить герметизацию эпителиального слоя, чтобы отделить ткани хозяина от просвета кишечника. Недавние исследования свидетельствуют, что нарушение TJ паразитной EhCPADH112 белка является необходимым условием для Е. гистолитика вторжение, которое сопровождается эпителиального барьера дисфункции. Таким образом, анализ молекулярных механизмов, вовлеченных в TJ разборки во E. гистолитика вторжение имеет первостепенное значение для улучшения нашего понимания амебиаза патогенеза. В данной статье представлен простой модель, которая позволяет оценку начальных хост-патогенных взаимодействий и паразит вторжения потенциал. Параметры, которые будут проанализированы включают тransepithelial электрическое сопротивление, взаимодействие EhCPADH112 с эпителиальных поверхностных рецепторов, изменения в экспрессии и локализации эпителиальных соединительных маркеров и локализации молекул паразита внутри эпителиальных клеток.

Введение

Entamoeba гистолитика является одним простейшим ответственность человеческой амебиаза, кишечной инфекции клеток вызывая воспаление и диарею. E. гистолитика заражает до 50 млн. человек в год, но только около 10% инфицированных людей развивается симптомы, связанные с амебиаза ^1. Заражение происходит при употреблении зараженной пищи или воды, содержащее Е. гистолитика кисты. В кишечнике, кисты производят живые трофозоиты, которые придерживаются толстой кишки муцина и размножаться ^2. Трофозоиты обычно образуют цисты, которые выводятся из организма через стул. В других случаях и для еще неизвестным причинам, трофозоиты сломать кишечного эпителиального слоя и вторгнуться подлежащих тканей. В худшем случае, они входят в кровь и влияют на другие органы, такие как печень ^3.

Разорвать эпителиальный барьер требуется разрушение эпителиальных transmembranal структур, которые поддерживают клетки присоединились. Эпителиальных клетокконтакты образованы апикальной соединительного комплекса, состоящего из жесткой (TJ) и слипчивых соединений (AJ), и десмосомы ^4. Наиболее вершинные узлы: TJ, и поэтому они являются первым барьером оскорблена Е. гистолитика и некоторые другие патогены во время пребывания вторжения. TJ состоят из transmembranal рецепторов адгезии, таких как клаудины, occludin и соединительных молекул адгезии (джем), которые участвуют в гомо-или гетерофильных взаимодействий с рецепторами соседней камере. Они внутри клетки связаны молекул лесов этих блокатора малой зоны (ZO) семьи, которые соединяют адгезионные рецепторы к цитоскелета предоставить дополнительную механическую прочность эпителия. TJ ответственны за герметизации кишечной ткани из просвета кишечника, предотвращая чрезмерную утечку воды и растворенного вещества. Таким образом, после TJ нарушается паразитом, ткани вторглись. Е. гистолитика выделяет несколько молекул, таких как: (I), кто участвует в адгезии амеб в ТаргET клетки ^5; (II) мембранные-активные факторы, участвующие в гибели клеток-хозяев по экзоцитоза, например ионного канала формирования пептиды названы amoebapores ^6,7; и (III) протеиназы, унижающие белки внеклеточного матрикса и опосредуют ткани распада ^5,8,9.

Цистеин протеазы EhCP112 и молекулы адгезии EhADH112, что вместе образуют комплекс EhCPADH112 два Е. гистолитика вирулентности белки, которые играют важную роль в разборки TJ ^10. Текущие трофозоиты, их всего лизаты и секретируется продукты индуцируют молекулярные изменения в TJ сложной и функционального нарушения эпителиального барьера. В этом исследовании, было показано, что EhCP112 и EhADH112 взаимодействовать с occludin и Claudin-1 белков, приводящих к интернализации и деградации клеточных белков, способствуя тем самым E. вход гистолитика через парацеллюлярной пути.

Наши данные и те, ое другие группы ^11-17 настоятельно рекомендуем необходимость конкретных принимающих-патоген взаимодействий, которые позволяют паразита вторжение. Раскрытие молекулярную основу этих взаимодействий имеет первостепенное значение для лучшего понимания амебиаза патогенеза. Селективный нарушение TJ по трофозоитов, характеризующихся повышенной проницаемостью парацеллюлярной, может быть измерена путем уменьшения трансэпителиального электрического сопротивления (TER). Перенос паразитных белков к хост-эпителии может быть определена путем иммунофлуоресценции окрашивание и конфокальной лазерной микроскопии, методом, который также может выявить совместную локализацию амебы факторов вирулентности с эпителиальными соединительных маркеры, указывающие на возможные прямые взаимодействий. В этой статье мы подробно описывают, как эпителиальные клетки и трофозоиты культивируются, собирают и манипулировать, чтобы изучить хост-патогенных взаимодействий и их последствия.

протокол

1. Установление и поддержание Е. гистолитика Культуры

1. Расти axenically (полностью свободного от всех других загрязняющих организмов) 1 х 10 ⁵ трофозоиты гистолитика штамма Entamoeba Hml: ИМСС клонировать ¹⁸ в 16 х 125 мм культуры трубы с тефлоновый винтовых колпачков (или 1 х 10 ⁶ трофозоиты в одноразовые Т- 25 колбы) и 15 мл (или 50 мл в Т-25 колбу) из Tyi-S-33 среды (Tyi в бульоне с добавлением 3% Алмазный витаминной смеси, 10% инактивированной нагреванием сыворотки взрослого быка, 0,5 МЕ / мл пенициллина и 35 мкг / мл стрептомицина) ¹⁹ в инкубаторе при 37 ° С
2. Урожай трофозоиты во время логарифмической фазе роста обычно на 48-96 час интервалами (рис. 1) путем охлаждения агаровые пробирки в течение 5-10 мин в ледяной бане, чтобы освободить трофозоиты прикрепленные к стеклянной пробирку.
3. Перевести культуру в конической трубе и инвертировать его несколько раз, чтобы разогнать CELлевая сторона Определение количества клеток с помощью гемоцитометра (Neubauer камеры) и передать инокулята в культуральную пробирку, содержащую свежий Tyi-S-33 среды.
   1. Используйте небольшое число амеб на более длительные периоды инкубации (~ 3 х 10 ⁵ клеток на ~ 5 дней) и более высоким номером на более короткие периоды (~ 1 х 10 ⁶ клеток для ~ 1 день). В то время как рассчитывали посевной желательны, установленные культуры становятся предсказуемыми, так что по оценкам объемы посевного материала вполне осуществимы.
   2. Titrate количество трофозоитов для оптимизации количества клеток для каждого эксперимента.
   3. Поддерживать параллельный дубликат культуру, чтобы иметь резервную копию в случае непреднамеренного загрязнения или трубки поломки.
4. Cap трубы плотно и инкубировать их при 37 ° С в течение 5 ° наклонных горизонтального угла.
5. Проверка культур путем визуального осмотра регулярно, так как чрезмерный рост культуры может содержать много лизированных клеток.

2. Установление и поддержание МДСК культуры

1. Grow MDCK (Madin Darby Canine Kidney) клеток типа I (высокое сопротивление) в одноразовых T-75 колбах с 10 мл DMEM среде с пенициллином (100 МЕ / мл), стрептомицин (100 мг / мл), инсулин (0,08 U / мл) и 10% новорожденных сыворотки теленка в увлажненной атмосфере 5% СО ₂ и 95% воздуха при 37 ° С
2. Чтобы разделить клетки, проверить их на инвертированный микроскоп. Сплит клетки, когда они ~ 85-100% сливной.
3. С помощью вакуумного аспиратора в стерильной капот и стерильной пипетки Пастера стекло, чтобы удалить носитель из культуры. Чтобы избежать соскоб клеток, включите колбу с ног на голову и аспирации массовой информации в нижнем углу.
4. Внесите 10 мл предварительно нагретого PBS (140 мМ NaCl, 2,7 мМ KCl, 10 мМ Na ₂ HPO _4, 1,8 мМ KH ₂ PO _4, рН 7,4) в Т-75 колбу (5 мл в случае Т-25 колбу ) и осторожно встряхнуть флакон, чтобы промыть клетки. Удалить PBS вакуумной аспирации. Обширная стиральная требуется, так как сыворотка ингибирует трипсин.
5. Разлить 1,5 мл 0,05% трипсина в Т-75 колбу (на Т-25 колбу используют 0,5 мл) и осторожно раскачивать колбу, чтобы покрыть клеточный слой с трипсином.
6. Инкубировать в течение 5-10 мин в инкубаторе (точное время зависит от активности трипсина).
7. Проверьте для открепления клеток путем проведения колбу против света и отыскать течет клетки. Сотовый отряд (закругленные клетки) также могут быть проверены с помощью микроскопа. Часто клетки выделяют быстрее, с быстрым, мягким шлепком в сторону колбы.
8. Добавить 15 дополненной мл DMEM с Т-75 колбу (5 мл для T-25 колбу). Ресуспендируют клеток с помощью пипетки вверх и вниз 4 или 5 раз.
9. Для распространения клеток, развести клеточной суспензии 1:05 со свежим дополнен DMEM. Число клеток может быть определена в этой точке с помощью гемоцитометра но это обычно необходимо только, если разбиение ячеек в специальные форматы для некоторых анализов.

3. Подготовка трофозоита лизате

1. Снять трофозоиты от у.е.lture трубы охлаждением трубку в течение 5-10 мин в ледяной бане. Передача культуры асептически в коническую пробирку и центрифугируют при 360 х г в течение 10 мин при 4 ° С. Осторожно отбросить супернатант путем декантации, добавить ледяной PBS к осадку, инвертировать трубки несколько раз, чтобы диспергировать клетки и центрифуги снова при 360 х г в течение 10 мин. Повторите этот шаг дважды, чтобы удалить все следы Tyi-S-33 среды.
2. Определение количества трофозоиты помощью гемоцитометра.
3. Lyse трофозоиты по циклов замораживания-оттаивания. Snap-заморозить отмеренное затравтку трофозоитов (600000 трофозоиты / мл) разводят в ледяной PBS, в жидком азоте в течение 1 мин. Разморозить образца при 4 ° С и вихря энергично. Повторите замораживать и размораживать 3 раза, чтобы завершить лизиса клеток.
4. Активация протеаз, присутствующих в лизатах с 0,02% β-меркаптоэтанола.

4. Подготовка трофозоита секретируется Товаров

1. Выполните шаги 3,1 до 3,2.
2. Определятьчисло клеток и жизнеспособность в этой точке с помощью гемоцитометра и применения трипанового синего тест ^20:
   1. Развести 9 х 10 ⁶ трофозоиты в 3 мл ледяной PBS и передачи клеток в 50 мл коническую трубку. Возьмите 10 мкл этой суспензии и добавить 1 мкл 0,4% трипанового синий исходного раствора рН 7,2.
   2. Используйте камеру Нейбауера для подсчета клеток при малом увеличении.
   3. Подсчет всех ячеек и отделить количество синих клеток, так как синие клетки взяли на себя краску и должны рассматриваться мертвым.
   4. Вычислить процент жизнеспособных клеток путем деления количества жизнеспособных клеток на общее количество клеток и умножением на 100.
3. Передача коническую трубку, содержащую трофозоита суспензии в инкубаторе при 37 ° С в течение 2 часов в 5 ° наклонных горизонтального угла.
4. Для сбора, выделяемые продукты, центрифужные пробирки при 360 мкг в течение 10 мин. Используйте одноразовые и стерильные шприцы и тщательно собирать Суpernatant, избегая загрязнения образцов с трофозоитов от осадка. Устранить любые переданные клетки пропусканием супернатанта через ацетат целлюлозы 0,22 мкм мембрану. Активация протеаз с 0,02% β-меркаптоэтанола.
5. Чтобы отменить предполагаемый нежелательного загрязнения с молекулами, освобожденных из мертвых клеток, повторно применить трипановый тест синий исключения для жизнеспособности клеток. Жизнеспособных и общее число клеток должно быть таким же, полученного на стадии 4.2. Если это не так, то собирали супернатант может содержать не только секретируемые белки и должен быть отброшен.

5. Взаимодействие MDCK клеток с трофозоиты, трофозоита лизатов или секретируемые продукты

1. Выдержите сливной монослоев MDCK клеток с живыми трофозоитов (соотношение MDCK к амебы 1:1), трофозоита лизаты (соотношение MDCK к амебы 1:2) или секретируемые продукты (соотношение MDCK к амебы из 1 : 10) при 37 ° С в течение 2 и 30 мин (рис. 2а).
2. Промыть эпителиальных клеток пять раз охлажденным на льду PBS, чтобы устранить несвязанных молекул или трофозоиты.

6. Получение образцов для иммунофлуоресценции

1. Культура MDCK клетки на стерильные стеклянные покровные размещенных в 24-многоямного клеточной культуры блюдо. Проверьте ячейки на инвертированный микроскоп, пока они не достигают 100% от слияния. Затем заменить носитель с 1 мл свежей среды DMEM, дополненной и передавать пластину в инкубаторе 37 ° C в течение 24 часов более.
2. Снимите среду с помощью вакуумного аспиратора и стерильный стекло пипетки Пастера и добавить 1 мл теплой PBS в каждую лунку. Удалить PBS и повторить мытье с пресной PBS. Будьте осторожны, не царапать клетки со дна колодца с стеклянной пипетки.
3. Добавить различные условия трофозоитов разбавленных в 1 мл теплой PBS: В прямом эфире трофозоиты (T), трофозоита лизате (TL) и выделяемые продукты (SP).
   1. Поставьте культуры пластину в инкубаторе в течение 2 или 30 мин.
   2. Приготовьте два условия управления: один по имени времени 0 мин, где MDCK клетки должны быть не инкубировали с Е. гистолитика но только с 1 мл теплой PBS; и еще одно условие как контроль вторичных антител, в этом случае инкубировать с MDCK T, TL или SP в течение 2 или 30 мин и опустить инкубацию с первичными антителами.
4. Вымойте эпителиальных клеток в пять раз с холодной PBS устранить несвязанных молекул или трофозоиты.
5. Fix и клетки проницаемыми 1 мл 96% этанола в течение 30 мин при -20 ° С
6. Для удаления этанола, выполните три быстрых промывок по 1 мл PBS при комнатной температуре.
7. Выполните следующие действия во влажной камере, чтобы избежать высыхания образцов:
   1. Использовать все имеющиеся плоскую коробку, которая может быть закрыта и наполненный влажным бумажным полотенцем, на котором образцы могут быть безопасно помещен. Например, пустая коробка пипетки служит этой цели хорошо.
   2. Внутри камеры, равномерно разместить парафином слой и пипетки 25 мкл блокеING раствор (0,5% BSA) для каждого покровное.
   3. Возьмем покровные из скважин с тонким пинцетом, осторожно удалить лишнюю жидкость от края через фильтровальную бумагу и положить покровное в каплю, содержащую блокирующий раствор (0,5% BSA) с клетки перед блокирующим раствором. Инкубируйте образцы в течение 1 ч при комнатной температуре.
8. Приготовить смесь из первичных антител в PBS: IgM мыши анти-EhCPADH112 (Ма-EhCPADH112; разведение 1:10) и IgG кролика против ZO-1 (Ра-ЗО-1; разбавление 1:100).
9. Поместите чистый лист парафильмом во влажном поле и пипетки 25 мкл антител решение для каждого покровное.
10. Поднимите покровные от блокирующим раствором, высушить лишнюю жидкость по краям с помощью фильтровальной бумаги, и поместить их в капли с клетки сталкиваются раствор антител. Инкубируйте образцы в течение ночи при 4 ° С.
11. Положите каждый покровное в лунку 24-многоямного (стороне клеточной сверху) и добавить 1 мл PBS.
    1. Вымойте пять раз 1 мл PBS для удаления несвязанных молекул.
12. Приготовить смесь из флуоресцентных вторичных антител в PBS: козий анти-IgM мыши, соединенный с FITC (разбавление 1:100) и козьего анти-IgG кролика, соединенный с TRITC (разведение 1:50).
13. Поместите чистый лист Parafilm в влажной камере и пипеткой 25 мкл вторичных антител решение для каждого покровное.
14. Передача образцов как в 6,10 и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте, чтобы избежать отбеливания флуоресцентных красителей. Повторите шаг 6.11.1.
15. Для ядерного окрашивания, инкубировать в течение 3 мин с 200 мкл 0,05 мМ раствора DAPI при комнатной температуре и защите от света. Повторите шаг 6.11.1.
16. Для экономии флуоресцентные красители, разместить покровные (клетки лицевой стороной вниз) в 5 мкл Vecta Щит antifade монтажный раствор на предметные стекла микроскопа. Уплотнение крышки скользит с помощью лака для ногтей, чтобы избежать сушки образца.
17. Для длительного хранения, держать слайдов вмикроскопа окно при -20 ° С.
18. Анализ препараты от конфокальной микроскопии по разделам Z-Stack и XZ-плоскостей (рис. 2А).

7. Инкубация трофозоиты с ингибиторов протеазы или специфических антител

1. Повторите шаги 3,1 до 3,2. Для каждой экспериментальной условии, инкубировать 1 × 10 ⁵ (трофозоиты ресуспендировали в 50 мкл PBS) с ингибиторами протеазы (1 мМ полным и 40 мкг / мл E-64) или 30 мкг моноклонального антитела против EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ течение 20 мин при 4 ° C (фиг. 2В). Используйте эти препараты для совместной инкубации анализов, как описано в шаге 8.5.

8. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TER)

1. Культура MDCK клеток на стерильных Transwell проницаемых опор (размер пор 0,4 мкм). В верхнем отделении, поместите 100 мкл суспензии клеток и в нижнем отделенииразместить 600 мкл DMEM, дополненной среде.
   1. Периодически проверяйте уровень среднего. Свежую среду могут быть добавлены при необходимости.
   2. Проверьте ячейки на инвертированный микроскоп, пока они не достигают 100% от слияния. Изменение средней каждые 2-3 дня.
   3. Чтобы улучшить прикрепление клеток (при необходимости), уравновешивания Transwell фильтры в течение ночи при 37 ° С в среде DMEM перед добавлением суспензии клеток.
2. Стерилизовать Stx2 электроды в капюшоне погружением в этаноле, а затем в стерильной PBS в течение 15 мин каждый, под ультрафиолетовым светом. Подключите электроды к эпителиального voltohmmeter EVOM и выберите режим сопротивления.
3. Сбор среды из верхней камеры каждого Transwell и объединить их. Возьмите 50 мкл этого медиа смеси и объединить его с 50 мкл трофозоиты подвески (1 х 10 ⁵ трофозоиты в PBS) или только с PBS (контроль). С помощью аналогичной смеси для каждого Transwell.
4. Добавить смеси в верхнюю палату каждого Transwell containinг в MDCK клетки. Экспериментальные условия включают MDCK клетки, не трофозоитов (контроль), cо-культуру с трофозоитов или с трофозоитов преинкубировали с ингибиторами протеазы или mαEhCPADH112. Чтобы исключить стойкость, обеспечиваемую фильтры, использовать transwells инкубированные только с среды. Для каждой экспериментальной условием использования по крайней мере три transwells.
5. Сразу же, измерить TER путем погружения Stx2 электроды в каждом Transwell.
   1. Убедитесь, что чем дольше электрод касается нижней части нижней камеры и, что более короткий электрод покрыт среды в верхней камере (см. фиг.2В).
   2. Убедитесь в том, чтобы держать электроды перпендикулярно каждый раз. Это позволит улучшить воспроизводимость, значительно. Избегайте перемещения или наклона электрода в процессе измерений, так как это приведет к изменению данных.
6. Это измерение следует рассматривать начальное значение TER. Тогда, следить за ТЭР в течение следующих30 мин.
7. Для расчета окончательного значения TER, вычтите значение тер только фильтров. Для сравнения результатов из разных экспериментов нормализовать каждую точку данных на начальные значения, принимая их как 100% (рис. 2В).

Результаты

Для успешного Е. гистолитика культура, два важных условия должны быть выполнены: рост аксенными условий и урожая в логарифмической фазе. Ранее культуры Е. гистолитика были легко установить в сотрудничестве с некоторыми видами бактерий или trypanosomatids ^22. Тем не менее, в наст?...

Обсуждение

Для изучения в пробирке хост-патогенных взаимодействий во время эпителиальной инфекции E. гистолитика, очень важно работать с хорошо известными культурами обеих эпителиальных клеток и трофозоитов. Например, ранее, Е. гистолитика культуры были, как правило, были созданы в...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution