Analisi del danno epiteliale Prodotto da<em&gt; Entamoeba histolytica</em&gt; Infezione

Riepilogo

L'infezione umana da Entamoeba histolytica porta ad amebiasi, una delle principali cause di diarrea nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da patogeno con cellule epiteliali intestinali, provocando l'apertura dei contatti cellula-cellula e di conseguenza diarrea, a volte seguita da infezione fegato. Questo articolo fornisce un modello per valutare le interazioni primi ospite-patogeno per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi.

Abstract

Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi umana, una delle principali cause di diarrea e di ascesso epatico nei paesi tropicali. L'infezione è avviata da interazione del patogeno con le cellule epiteliali intestinali. Questa interazione porta alla rottura delle strutture intercellulari come giunzioni strette (TJ). TJ assicurare la chiusura dello strato epiteliale per separare tessuto ospite dal lume intestinale. Recenti studi forniscono prove che la rottura del TJ dalla proteina EhCPADH112 parassita è un prerequisito per E. invasione histolytica che è accompagnato da disfunzione della barriera epiteliale. Pertanto, l'analisi dei meccanismi molecolari coinvolti nella TJ smontaggio durante E. histolytica invasione è di fondamentale importanza per migliorare la nostra comprensione della patogenesi amebiasi. Questo articolo presenta un modello semplice che consente la valutazione delle interazioni iniziali ospite-patogeno e il potenziale parassita invasione. I parametri da analizzare sono transepithelial resistenza elettrica, l'interazione di EhCPADH112 con i recettori di superficie epiteliali, cambiamenti di espressione e la localizzazione di marcatori giunzionale epiteliali e la localizzazione delle molecole del parassita all'interno delle cellule epiteliali.

Introduzione

Entamoeba histolytica è un singolo protozoo responsabile della amebiasi umana, un'infezione intestinale delle cellule causando infiammazione e diarrea. E. histolytica infetta fino a 50 milioni di persone ogni anno, ma solo circa il 10% delle persone infette sviluppano i sintomi associati a amebiasi ^1. L'infezione avviene per ingestione di alimenti contaminati o acqua contenente E. cisti histolytica. Nell'intestino, cisti producono trofozoiti vivi che aderiscono al colon mucina e proliferano ^2. Trofozoiti di solito si formano le cisti che vengono escreti con feci. In altri casi e per ragioni ancora sconosciute, trofozoiti rompere lo strato epiteliale intestinale e invadono i tessuti sottostanti. Nel peggiore dei casi, entrano nel flusso sanguigno e colpiscono altri organi come il fegato ^3.

Rompere la barriera epiteliale richiede interruzione di strutture transmembranal epiteliali che mantengono le cellule unite. Cellule epitelialicontatti sono formati dal complesso giunzionale apicale costituito stretto (TJ) e adherens giunzioni (AJ), e desmosomi ^4. Le giunzioni più apicali sono TJ, e quindi, sono la prima barriera offeso da E. histolytica e di alcuni altri agenti patogeni durante l'invasione host. TJ sono costituiti da recettori di adesione transmembranal come claudine, occludina e molecole di adesione giunzionale (JAM), che si impegnano in interazioni eterofili omo-o con i recettori della cellula vicina. Sono intracellulare vincolati da molecole impalcatura delle occludere zonula (SO) della famiglia che collegano recettori di adesione al citoscheletro di actina per fornire ulteriore resistenza meccanica all'epitelio. TJ sono responsabili per sigillare tessuto intestinale dal lume intestinale, impedendo all'acqua eccessiva e perdita soluto. Così, dopo TJ sono interrotti dal parassita, i tessuti sono invase. E. histolytica secerne diverse molecole quali: (i) quelli coinvolti nella adesione di amebe a targcellule et ^5; (Ii) fattori membrana attiva partecipano uccisione delle cellule ospiti per esocitosi, per esempio, i peptidi che formano canali ionici chiamati amoebapores ^6,7; e (iii) proteinasi che degradano le proteine ​​della matrice extracellulare e mediano tessuto disintegrazione ^5,8,9.

La cisteina proteasi EhCP112 e la molecola di adesione EhADH112 che insieme formano il complesso EhCPADH112 sono due E. histolytica virulenza proteine ​​che svolgono un ruolo importante nello smontaggio di TJ ^10. Trofozoiti vivi, loro lisati totali e prodotti secreti inducono cambiamenti molecolari nel TJ complesso e funzionale disturbo della barriera epiteliale. In questo studio, è dimostrato che EhCP112 e EhADH112 interagiscono con occludina e claudin-1 proteine ​​che portano alla internalizzazione e la degradazione delle proteine ​​cellulari, facilitando così E. ingresso histolytica attraverso la via paracellulare.

I nostri dati e quelli of altri gruppi di ^11-17 suggeriscono con forza la necessità di interazioni ospite-patogeno specifiche che consentono parassita invasione. Svelare le basi molecolari di queste interazioni è della massima importanza per una migliore comprensione della patogenesi amebiasi. Disturbo selettivo di TJ da trofozoiti, caratterizzate da un aumento della permeabilità paracellulare, può essere misurata da una diminuzione della resistenza elettrica transepiteliale (TER). Il trasferimento delle proteine ​​parassite verso epiteli ospitanti può essere determinato da immunofluorescenza e microscopia confocale, un metodo che può anche rivelare co-localizzazione di fattori di virulenza amebe con marcatori epiteliali giunzionale indicano possibili interazioni dirette. In questo articolo, descriviamo in dettaglio come le cellule epiteliali e trofozoiti sono coltivati, raccolti e manipolati per esaminare le interazioni ospite-patogeno e le loro conseguenze.

Protocollo

1. Creazione e mantenimento di E. Culture histolytica

1. Crescere in condizioni asettiche (completamente libero di tutti gli altri organismi contaminanti) 1 x 10 ⁵ trofozoiti di Entamoeba histolytica ceppo HML: IMSS clonare un ¹⁸ a 16 x 125 mm tubi di coltura con teflon tappi a vite marittimo di linea (o 1 x 10 ⁶ trofozoiti in un usa e getta T- 25 beuta) e 15 ml (o 50 ml in T-25 pallone) di TYI-S-33 medio (TYI brodo supplementato con 3% Diamante vitamina miscela, siero inattivato bovino adulto 10% calore, 0,5 UI / ml di penicillina e 35 mg / ml streptomicina) ¹⁹ in un incubatore a 37 ° C.
2. Trofozoiti raccolto durante la fase di crescita logaritmica solito a intervalli 48-96 hr (Figura 1) raffreddando le provette di coltura per 5-10 minuti in un bagno di ghiaccio-acqua per liberare trofozoiti collegato al tubo di vetro cultura.
3. Trasferire la coltura in una provetta conica e capovolgere più volte per disperdere la cells. Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro (camera di Neubauer), e trasferire un inoculo in una provetta di coltura contenente mezzo fresco TYI-S-33.
   1. Utilizzare basso numero di amebe per periodi più lunghi di incubazione (~ 3 x 10 ⁵ cellule per ~ 5 giorni) e un numero più elevato per periodi più brevi (~ 1 x 10 ⁶ cellule per ~ 1 giorno). Mentre inoculi contati sono auspicabili, culture stabiliti diventano prevedibili in modo che i volumi stimati di inoculi sono fattibili.
   2. Titolare l'importo trofozoiti per ottimizzare il numero di cellule per ogni esperimento.
   3. Mantenere una cultura duplicato parallelo di avere un back-up in caso di contaminazione accidentale o del tubo rottura.
4. Tubi tappo e li incubare a 37 ° C in un 5 ° angolo di inclinazione orizzontale.
5. Controllare le culture di ispezione visiva regolarmente, dal momento che una crescita eccessiva della cultura può contenere molte cellule lisate.

2. Creazione e mantenimento di MDCK Cultura

1. Grow MDCK (Madin Darby Canine Kidney) cellule di tipo I (alta resistenza) in monouso T-75 beute da 10 ml di mezzo DMEM supplementato con penicillina (100 UI / ml), streptomicina (100 mg / ml), insulina (0,08 U / ml) e siero di vitello neonato 10% in atmosfera umidificata al 5% di CO ₂ e il 95% aria a 37 ° C.
2. Per dividere le celle, li controlla su un microscopio invertito. Dividere le celle quando sono ~ 85-100% confluenti.
3. Utilizzare un aspiratore a vuoto in una cappa sterile e sterile Pasteur pipetta di vetro per rimuovere il supporto dalla cultura. Per evitare di raschiare le cellule, girare il pallone di testa in giù e mezzi di aspirare dal basso.
4. Pipettare 10 ml di PBS preriscaldata (140 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na ₂ HPO _4, 1,8 mM KH ₂ PO _4, pH 7.4) in un pallone da T-75 (5 ml nel caso di un T-25 pallone ) e rock delicatamente il pallone per lavare le cellule. Rimuovere PBS tramite aspirazione a vuoto. Ampia lavaggio è richiesto dal siero inibisce la tripsina.
5. Pipettare 1,5 ml di 0,05% tripsina in un pallone T-75 (per T-25 pallone di usare 0,5 ml) e agitare delicatamente il pallone per coprire lo strato di cellule con tripsina.
6. Incubare per 5-10 minuti in incubatrice (il tempo esatto dipende dall'attività tripsina).
7. Verificare la presenza di distacco cella tenendo il pallone contro la luce e cercare scorre cellule. Distacco delle cellule (cellule arrotondate) può essere controllato utilizzando un microscopio. Spesso, cellule rilascio veloce con un breve, dolce slap al lato del pallone.
8. Aggiungere 15 ml di DMEM supplementato in un pallone T-75 (5 ml per un pallone T-25). Risospendere le cellule pipettando su e giù 4 o 5 volte.
9. Per propagare le celle, diluire sospensione cellulare 1:5 con fresco INTEGRAZIONI DMEM. Numero di celle può essere determinato anche, a questo punto con un emocitometro, ma questo è di solito necessario solo se dividere le celle in formati speciali per alcuni saggi.

3. Preparazione di Trofozoite totale lisati

1. Staccare trofozoiti da cutubi lture raffreddando la provetta per 5-10 minuti in un bagno di acqua e ghiaccio. Trasferire asetticamente coltura in una provetta conica e centrifugare a 360 xg per 10 min a 4 ° C. Eliminare attentamente il supernatante per decantazione, aggiungere PBS freddo al pellet, invertire la provetta diverse volte per disperdere le cellule e centrifugare di nuovo a 360 xg per 10 min. Ripetere questa operazione due volte per eliminare ogni traccia di Tyi-S-33 di media.
2. Determinare il numero trofozoiti con un emocitometro.
3. Lyse trofozoiti dai cicli di gelo-disgelo. Snap-congelare un inoculo misurata di trofozoiti (600.000 trofozoiti / ml) diluito in PBS freddo, in azoto liquido per 1 min. Sbloccare il campione a 4 ° C e agitare vigorosamente. Ripetere gelo e disgelo 3 volte per completare la lisi cellulare.
4. Attivare proteasi presenti nei lisati con 0,02% β-mercaptoetanolo.

4. Preparazione di Trofozoite secreto Prodotti

1. Eseguire le operazioni 3,1-3,2.
2. Determinarenumero di cellule e vitalità a questo punto con un emocitometro e applicando un test di esclusione del trypan blu ^20:
   1. Diluire 9 x 10 ⁶ trofozoiti in 3 ml di PBS freddo e trasferire le cellule in una provetta conica da 50 ml. Prendere 10 ml di questa sospensione e aggiungere 1 ml di 0,4% trypan blu stock soluzione a pH 7.2.
   2. Utilizzare una camera di Neubauer per contare le cellule a basso ingrandimento.
   3. Contare tutte le cellule e separare il numero di cellule blu, poiché le cellule blu hanno preso il colorante e devono essere considerati morti.
   4. Calcolare la percentuale di cellule vitali dividendo il numero di cellule vitali per il numero totale di cellule e moltiplicando per 100.
3. Trasferire il tubo conico contenente la sospensione trofozoita in incubatore a 37 ° C per 2 ore in un 5 ° angolo di inclinazione orizzontale.
4. Per raccogliere i prodotti secreti, provette da centrifuga a 360 xg per 10 min. Usare una siringa monouso e sterile e raccogliere la su attenzionepernatant, evitando la contaminazione dei campioni con trofozoiti dal pellet. Eliminare tutte le cellule trasferite passando il surnatante attraverso una membrana di acetato di cellulosa 0,22 micron. Attivare proteasi con il 0,02% β-mercaptoetanolo.
5. Per eliminare putativo contaminazione indesiderata con molecole rilasciate dalle cellule morte, riapplicare il test di esclusione del trypan blu per la vitalità cellulare. Numero vitale e totale di celle deve essere lo stesso ottenuto nella fase 4.2. Se questo non è il caso, il supernatante raccolto può non solo contenere proteine ​​secrete e deve essere eliminata.

5. Interazione delle cellule MDCK con Trofozoiti, Trofozoite lisati o secrete Prodotti

1. Incubare confluenti monostrati cellulari MDCK con trofozoiti vivi (un rapporto MDCK-to-ameba 1:1), Trofozoite lisati (un rapporto di MDCK-to-ameba di 1:2) o di prodotti secreti (un rapporto MDCK-to-ameba di 1 : 10) a 37 ° C per 2 min e 30 (Figura 2A).
2. Lavare le cellule epiteliali cinque volte con PBS freddo per eliminare le molecole non legate o trofozoiti.

6. Preparazione dei campioni per immunofluorescenza

1. Cellule Cultura MDCK su vetrini sterili posti all'interno di una piastra di coltura cellulare di 24 multiwell. Ispezionare le celle del microscopio invertito fino a raggiungere il 100% di confluenza. Quindi, sostituire medio di 1 ml di DMEM fresco INTEGRATO medio e trasferire la piastra ad un incubatore a 37 ° C per 24 ore più.
2. Rimuovere il mezzo usando un aspiratore a vuoto e una sterile Pasteur pipetta di vetro e aggiungere 1 ml di PBS caldo a ciascun pozzetto. Rimuovere PBS e ripetere il lavaggio con PBS fresco. Fare attenzione a non raschiare cellule dal fondo del pozzetto con la pipetta di vetro.
3. Aggiungi diverse condizioni di trofozoiti diluito in 1 ml di PBS caldo: trofozoiti vivi (T), lisati totali trofozoita (TL) e prodotti secreti (SP).
   1. Mettere la piastra di coltura in incubatrice per 2 o 30 min.
   2. Preparare due condizioni di controllo: un tempo denominata 0 min, dove le cellule MDCK non devono essere incubate con E. histolytica ma solo con 1 ml di caldo PBS; e un'altra condizione come controllo anticorpi secondari, in questo caso incubare MDCK con T, TL o SP per 2 o 30 min e omettere incubazione con anticorpi primari.
4. Lavare le cellule epiteliali cinque volte con PBS freddo per eliminare le molecole non legate o trofozoiti.
5. Fissare e permeabilize le cellule con 1 ml di etanolo al 96% per 30 minuti a -20 ° C.
6. Per rimuovere l'etanolo, effettuare tre lavaggi rapidi di 1 ml di PBS a temperatura ambiente.
7. Effettuare le seguenti operazioni in una camera umida per evitare l'essiccamento dei campioni:
   1. Utilizzare qualsiasi scatola piatta disponibile che può essere chiuso e riempito con un tovagliolo di carta bagnata in cui i campioni possono essere inseriti in modo sicuro. Ad esempio, una casella di punta della pipetta vuota serve bene a questo scopo.
   2. All'interno della camera, in modo uniforme posizionare uno strato Parafilm e pipetta 25 ml di bloccoing soluzione (0,5% BSA) per ogni vetrino.
   3. Prendere coprioggetto su pozzetti con pinza sottile, rimuovere accuratamente il liquido in eccesso dal bordo con carta da filtro e mettere coprioggetto nella goccia contenente soluzione bloccante (0,5% BSA) con le cellule di fronte la soluzione di saturazione. Incubare i campioni per 1 ora a temperatura ambiente.
8. Preparare una miscela di anticorpi primari in PBS: IgM anti-topo EhCPADH112 (mα-EhCPADH112; 1:10) e IgG di coniglio anti-ZO-1 (pα-ZO-1; diluizione 1:100).
9. Mettere un foglio fresco Parafilm nella casella umida e pipetta 25 ml di soluzione di anticorpi per ogni vetrino.
10. Sollevare i coprioggetti dalla soluzione di blocco, asciugare il liquido in eccesso ai bordi con una carta da filtro, e metterli nelle gocce con le cellule di fronte alla soluzione di anticorpi. Incubare i campioni notte a 4 ° C.
11. Mettere ogni vetrino in un pozzo di 24 multipozzetto (lato cella in alto) e aggiungere 1 ml di PBS.
    1. Lavare cinque volte con 1 ml di PBS per rimuovere le molecole non legate.
12. Preparare una miscela di anticorpi secondari fluorescenti in PBS: topo di capra anti-IgM accoppiato con FITC (diluizione 1:100) e di capra anti-IgG di coniglio accoppiato TRITC (diluizione 1:50).
13. Mettere un foglio fresco Parafilm in area umida e pipetta 25 ml di soluzione di anticorpi secondario per ogni vetrino.
14. Trasferire i campioni in 6.10 e incubare per 1 ora a temperatura ambiente al buio per evitare sbianca dei coloranti fluorescenti. Ripetere passo 6.11.1.
15. Per la colorazione nucleare, incubare per 3 minuti con 200 ml di soluzione DAPI 0,05 mm a temperatura ambiente e proteggere dalla luce. Ripetere passo 6.11.1.
16. Per conservare i coloranti fluorescenti, posizionare i coprioggetti (cellule rivolti verso il basso) in 5 ml Vecta Shield antifade soluzione di montaggio su vetrini per microscopio. Sigillare le coprioggetto utilizzando smalto per evitare l'essiccazione del campione.
17. Per la conservazione a lungo termine, mantenere le diapositive di unabox vetrino da microscopio a -20 ° C.
18. Analizzare preparati mediante microscopia confocale attraverso tratti Z-stack e XZ-piani (Figura 2A).

7. Incubazione di Trofozoiti con inibitori della proteasi o anticorpo specifico

1. Ripetere i passaggi 3,1-3,2. Per ciascuna condizione sperimentale, incubare 1 x 10 ⁵ trofozoiti (risospese in 50 microlitri di PBS) con inibitori della proteasi (1 mM completi e 40 mcg / ml E-64) o 30 mg di anticorpo monoclonale contro EhCPADH112 (mαEhCPADH112) ²¹ per 20 min a 4 ° C (Figura 2B). Utilizzare questi preparativi per saggi di co-incubazione come descritto al punto 8.5.

8. Misura della resistenza elettrica transepiteliale (TER)

1. Cultura cellule MDCK su sterili transwell supporti permeabili (0,4 micron di dimensione dei pori). Nel vano superiore, posizionare 100 microlitri di sospensione cellulare e nel vano inferioreVersare 600 ml di mezzo DMEM integrato.
   1. Controllare il livello medio periodicamente. Mezzo fresco può essere aggiunto come richiesto.
   2. Ispezionare le cellule su un microscopio invertito fino a raggiungere il 100% di confluenza. Cambiare medio ogni 2-3 giorni.
   3. Per migliorare l'adesione delle cellule (se necessario), equilibrare i filtri transwell notte a 37 ° C in DMEM prima dell'aggiunta della sospensione cellulare.
2. Sterilizzare elettrodi stx2 nella cappa per immersione in etanolo e poi in PBS sterile per 15 min ciascuno, sotto luce UV. Collegare gli elettrodi ad un epiteliale voltohmmeter Evom e selezionare la modalità di resistenza.
3. Raccogliere mezzo dal vano superiore di ogni transwell e piscina. Introdurre 50 ml di questa miscela Mezzi e combinarlo con 50 ml di sospensione trofozoiti (1 x 10 ⁵ trofozoiti in PBS) o con solo PBS (controllo). Utilizzare una miscela simile per ogni transwell.
4. Aggiungere miscele verso la camera superiore di ogni contenent transwellg cellule MDCK. Condizioni sperimentali includono cellule MDCK senza trofozoiti (controllo), una co-coltura con trofozoiti o con trofozoiti pre-incubate con inibitori della proteasi o mαEhCPADH112. Per eliminare la resistenza fornita dai filtri, utilizzare transwells incubate con solo mezzo. Per ciascuna condizione sperimentale usare almeno tre transwells.
5. Immediatamente, misurare TER immergendo gli elettrodi stx2 in ogni transwell.
   1. Assicurarsi che l'elettrodo non tocchi il fondo della camera inferiore e che l'elettrodo inferiore è coperta dal fluido nel vano superiore (vedere la Figura 2B).
   2. Assicurati di tenere gli elettrodi perpendicolarmente ogni volta. Ciò permetterà di migliorare la riproducibilità, in modo significativo. Evitare di spostare o inclinare l'elettrodo durante le misurazioni in quanto questo porterà alla variazione dei dati.
6. Questa misura dovrebbe essere considerato il valore iniziale TER. Poi, monitorare il TER durante la seguente30 min.
7. Per calcolare il valore TER finale, sottrarre il valore TER di soli filtri. Per confrontare i risultati di diversi esperimenti di normalizzare ogni punto dati ai valori iniziali, prendendo questi come 100% (Figura 2B).

Risultati

Per un E. successo cultura histolytica, due importanti condizioni devono essere soddisfatte: la crescita in condizioni axeniche e raccolto in fase logaritmica. In precedenza, colture di E. histolytica erano facilmente stabilita in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids ^22. Tuttavia, al giorno d'oggi è comune avere la coltivazione axenic di questo parassita che significa un subcoltivazione indefinito di amebe in un ambiente privo di batteri che metabolizzano...

Discussione

Per studiare in vitro le interazioni ospite-patogeno in corso di infezione da E. epiteliale histolytica, è fondamentale lavorare con le culture consolidate di entrambe le cellule epiteliali e trofozoiti. Ad esempio, in passato, E. culture histolytica erano stati di solito stabiliti in associazione con alcune specie di batteri o trypanosomatids ^22,23. Tuttavia, co-coltivazione di E. culture histolytica è controproducente per lo studio de...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution