プロデュース上皮損傷の解析<em&gt;赤痢アメーバ</em&gt;感染症

要約

赤痢アメーバによるヒト感染はアメーバ、熱帯の国では下痢の主な原因につながる。感染は、細胞 - 細胞接触の開口部と、その結果、下痢、時には肝臓感染症が続くを刺激、腸上皮細胞による病原体の相互作用によって開始される。この記事では、アメーバ症の病因の理解を向上させるために初期の宿主 - 病原体相互作用を評価するためのモデルを提供します。

要約

赤痢アメーバは、人間のアメーバ症の原因物質、下痢や熱帯諸国における肝膿瘍の主要な原因である。感染は、腸上皮細胞と病原体との相互作用によって開始される。この相互作用は、このようなタイトジャンクショ​​ン（TJ）のような細胞間構造の破壊につながる。 TJは、腸管内腔から宿主組織を分離する上皮層のシール性を確保。最近の研究では、寄生タンパク質EhCPADH112によるTJの破壊がEのための前提条件であるという証拠を提供上皮バリア機能障害を伴うアメーバ侵入 。このように、E.中にTJ分解に関与する分子メカニズムの解析アメーバの侵入はアメーバ症の病因の理解を向上させるために最も重要である。この記事では、最初の宿主 - 病原体相互作用の評価と寄生虫の侵入の可能性を可能にする簡単なモデルを提示。分析対象となるパラメータは、Tが含まれransepithelial電気抵抗、上皮表面受容体発現の変化および上皮接合マーカーおよび上皮細胞内寄生生物分子の局在化の局在化との相互作用EhCPADH112。

概要

赤痢アメーバは、人間のアメーバ、炎症や下痢を引き起こす腸の感染症の責任ある単細胞の原生動物である。E.アメーバは毎年5000万個人にまで感染するが、感染者の約10％がアメーバ¹に関連した症状を起こす。感染はEを含む汚染された食物や水の摂取時に起こるアメーバ嚢胞 。腸内で、嚢胞は、大腸ムチンに付着し^、2を増殖するライブ栄養型を生産する。栄養型は通常、便を経由して排泄される嚢胞を形成している。他のケースではまだ未知の理由のために、栄養型は腸管上皮層を破壊し、下層組織に侵入する。最悪のケースでは、それらは血流に入り、肝臓³など他の臓器に影響を与える。

上皮バリアを破ることは入社細胞を維持する上皮性膜貫通構造の破壊を必要とします。上皮細胞連絡先はタイト（TJ）からなる頂端接合部複合体により形成され、接合（AJ）を接着結合、および^4をデスモソームている。ほとんどの頂端接合部は、TJであるため、彼らはEで侮辱し第一関門であるホスト侵入中にアメーバといくつかの他の病原体。 TJは、隣接セルの受容体とホモまたは異種相互作用に関与クローディン、オクルディンおよび接合部接着分子（JAM）のような膜貫通接着受容体で構成されている。それらは、細胞内で上皮にさらなる機械的強度を提供するために、アクチン細胞骨格に接着レセプターを接続する閉鎖帯（ZO）ファミリーの足場分子によって結合される。 TJは、過剰な水および溶質の漏れを防止する、腸管内腔から腸組織をシールするための責任がある。 TJは、寄生虫によって破壊された後にこのように、組織を侵略している。E. （I）TARGにアメーバの接着に関与するもの： アメーバのようないくつかの分子を分泌するらセル^5; （ii）は、例えば、エキソサイトーシスによって宿主細胞の殺傷に関与する膜活性因子^、6,7 amoebaporesと呼ばれるイオンチャネル形成ペプチドを;および（iii）細胞外マトリックスタンパク質を分解し、組織崩壊^を媒介^5,8,9プロテイナーゼ。

一緒にEhCPADH112複合体を形成するシステインプロテアーゼEhCP112及び接着分子EhADH112は、2つのE.あるTJ ¹⁰の分解に大きな役割を果たしているアメーバの病原性タンパク質。ライブ栄養型、それらの総溶解物および分泌された製品は、上皮バリアのTJ複雑で機能障害の分子の変化を誘導する。本研究では、EhCP112とEhADH112は、このようにEを容易に細胞タンパク質の内在化と分解をもたらすオクルディンとクローディン1タンパク質と相互作用することが示されている傍細胞経路を介したアメーバの入り口。

我々のデータは、これらのOF他のグループ^11から17を^強く寄生虫の侵入を可能にする特定宿主-病原体相互作用の必要性を示唆している。これらの相互作用の分子基盤を解明することはアメーバ症の病因のより良い理解のために最も重要である。傍細胞透過性の増大によって特徴付け栄養によるTJの選択的な外乱が、経上皮電気抵抗（TER）の減少によって測定することができる。宿主上皮に向かって寄生タンパク質の移動は、免疫蛍光染色および共焦点レーザー顕微鏡法も可能での直接的な相互作用を示す上皮接合部のマーカーとアメーバの病原性因子の共局在を明らかにすることができる方法によって決定することができる。この記事では、上皮細胞と栄養が、栽培収穫し、宿主 - 病原体相互作用とその結果を検討するために操作する方法を詳細に説明します。

プロトコル

Eの1。確立と維持アメーバ培養

1. （他のすべての汚染の生物の完全無料）無菌的に成長する赤痢アメーバ株のHMLの1×10 ⁵栄養型：InterScan MSSはテフロンライナースクリューキャップ（または使い捨てのT-1×10 ⁶栄養型と¹⁸ 125×16 mm培養チューブのクローンを作成するTYI-S-33培地、3％ダイヤモンドビタミン混合物を補充した（TYIブロス、10％熱不活化成体ウシ血清、0.5 IU / mlペニシリン、および35μgの25フラスコ）にし、15ml（又はT-25フラスコ中の50ml）中/ストレプトマイシン^）19 37℃のインキュベーター内
2. ガラス培養管に取り付けられた栄養を放出する氷水浴中で5〜10分間培養管を冷却することにより、通常、48〜96時間間隔（ 図1）での対数増殖期の間に収穫栄養。
3. CELを分散させるための円錐チューブに文化を転送し、それを数回転倒LS。血球計算板（ノイバウアー室）を使用して、細胞数を決定し、新鮮なTYI-S-33培地を含む培養チューブに接種物を移す。
   1. 長い潜伏期間（〜5日間〜3×10 ⁵細胞）と短い期間のためのより高い番号（〜1日の〜1×10 ⁶細胞）のためにアメーバの低い数字を使用してください。カウント接種材料が望ましいが接種物の推定体積が実現可能であるように、確立された文化が予測可能になる。
   2. 各実験について、細胞数を最適化するために、栄養の量を滴定する。
   3. 不注意による汚染やチューブの破損の場合にはバックアップを持っているパラレル·重複の文化を維持している。
4. キャップチューブしっかりと5°傾いた水平画角で、37℃でそれらをインキュベートする。
5. 文化の過度の成長が多く、溶解した細胞が含まれている可能性があるので、定期的に目視での文化を確認してください。

MDCK培養2。確立と維持

1. （マディンダービーイヌ腎臓）細胞/ 0.08 U（インスリン、ペニシリン（100 IU / ml）を、ストレプトマイシン（100 mg / ml）を補充したDMEM培地10mlの使い捨てT-75フラスコ中でI（高抵抗）型MDCKを成長させるml）と37℃で5％CO _2、95％空気の加湿雰囲気中の10％新生児ウシ血清
2. セルを分割するには、倒立顕微鏡でそれらを確認してください。彼らは〜百分の85から100までコンフルエントのときセルを分割。
3. 無菌フードや文化からメディアを除去する滅菌ガラスパスツールピペットで真空吸引器を使用してください。スクレーピング細胞を回避するために、下の隅から逆さまにフラスコを回して吸引メディア。
4. T-25フラスコの場合にT-75フラスコ（5mL中へ予め温めたPBS（140mMのNaCl、2.7mMのKCl、10mMのNa ₂ HPO _4、1.8mMのKH ₂ PO _4、pH7.4）を10mlのを分与）、静かに細胞を洗浄するために、フラスコを揺する。真空吸引によって、PBSを除去します。血清はトリプシンを阻害するので徹底的な洗浄が必要です。
5. （T-25フラスコに0.5mlのを使用）および穏やかにトリプシンで細胞層を覆うようにフラスコを揺するT-75フラスコ中に0.05％トリプシンを1.5mlの分注する。
6. （正確な時間は、トリプシン活性に依存します）インキュベーター内で5〜10分間インキュベートします。
7. 逆光フラスコを保持することによって細胞の剥離をチェックし、細胞を流すためにしています。 （細胞を四捨五入）細胞剥離はまた、顕微鏡を用いて確認することができる。多くの場合、細胞はフラスコの側への迅速な、優しい平手打ちで速い放出。
8. T-75フラスコ（T-25フラスコのために5ミリリットル）に添加したDMEMの15ミリリットルを追加します。ピペッティング4または5倍に細胞を再懸濁。
9. 細胞を増殖させる、新鮮な補充されたDMEMで細胞懸濁液を1:5に希釈する。セル番号は、血球計数器を用いて、この時点で決定することができるが、特定のアッセイのための特別な形式にセルを分割する場合、これは通常は必要である。

栄養型全溶解の3。準備

1. 立方から栄養を切り離す氷水浴中で5〜10分間チューブを冷却することによりlture管。 4℃で10分間360×gでコニカルチューブと遠心分離機に無菌的に文化を転送慎重に、デカンテーションにより上澄み液を捨て、ペレットを氷冷PBSを追加し、10分間360×gで再び細胞や遠心分離機を分散させるために、チューブを数回転倒。 TYI-S-33培地を完全に除去するために二回、この手順を繰り返します。
2. 血球計数器を使用した栄養型の数を決定します。
3. 溶解は、凍結融解サイクルによって栄養型。 1分間、液体窒素中で氷冷PBSで希釈した栄養体の測定された接種材料（60万栄養個/ ml）を、スナップ凍結。 4℃、激しくボルテックスでサンプルをアンフリーズします。細胞溶解を完了するために、凍結融解を3回繰り返します。
4. 0.02％β-メルカプトエタノールと溶解液中に存在するプロテアーゼをアクティブにします。

栄養型分泌生成物の4。準備

1. ステップ3.2に3.1を実行してください。
2. 決定する血球計数器を使用し、トリパンブルー排除試験^20を適用し、この時点での細胞数及び生存率：
   1. 50ミリリットルコニカルチューブに9×10 ⁶ 3ミリリットルの氷冷PBS中栄養型と転送細胞を希釈する。この懸濁液10μlを取り、0.4％トリパンブルー原液のpH 7.2の1を添加する。
   2. 低倍率での細胞をカウントするためにノイバウアー室を使用してください。
   3. すべての細胞を計数し、細胞が青色色素を取り込んだとデッド考慮しなければならないので、青色細胞の数を分離する。
   4. 細胞の総数により生存細胞の数で割り、100を掛けることによって生存細胞の割合を計算する。
3. 5°傾いた水平画角での2時間37℃でインキュベーターに栄養型懸濁液を含むコニカルチューブに移します。
4. 10分間360×gで分泌される製品、遠心管を収集します。使い捨て無菌注射器を使用し、丁寧にSUを収集pernatant、ペレットからの栄養型とサンプルの汚染を避ける。 0.22μmの酢酸セルロース膜を通して上清を渡すことで、任意の転送細胞を排除する。 β-メルカプトエタノール、0.02％とプロテアーゼをアクティブにします。
5. 死細胞から放出された分子と推定される不必要な汚染を破棄するには、細胞の生存率のために、トリパンブルー排除試験を再適用します。ステップ4.2で得られた細胞の生存と総数は同じである必要があります。そうでない場合には、回収した上清は、分泌タンパク質を含有することができるのみならず、破棄されるべきである。

栄養型、栄養型溶解物または分泌生成物とのMDCK細胞の5。相互作用

1. ライブ栄養型（1:1のMDCK対アメーバ比）でコンフルエントのMDCK細胞単層をインキュベート、栄養型溶解物（MDCK·ツー·アメーバ1:2）または分泌生成物（1のMDCK対アメーバ比：2と30分（ 図2A）、37℃で10）。
2. 非結合分子または栄養型を排除するために、氷冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。

免疫蛍光のためのサンプルの6。準備

1. 24ウェル細胞培養皿の内側に配置滅菌ガラスカバースリップ上で培養MDCK細胞。彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。その後、新鮮なDMEM培地1mlで培地を交換し、より多くの24時間37℃のインキュベーターにプレートを転送する。
2. 真空吸引器と滅菌ガラスパスツールピペットを用いて培地を除去し、各ウェルに暖かい1mlのPBSを加える。 PBSを削除し、新しいPBSでの洗浄を繰り返します。ガラスピペットで井戸の底から細胞を傷が付かないように注意してください。
3. ライブ栄養型（T）、栄養型全溶解（TL）と分泌生成物（SP）：暖かい1mlのPBSで希釈した栄養体のさまざまな条件を追加します。
   1. 2または30分間インキュベーター内で培養プレートを置く。
   2. 1という時間0分、MDCK細胞を大腸菌とインキュベートしていないする必要があります。2の制御条件を準備アメーバだけ暖かい1mlのPBSで;この場合の二次抗体コントロールなどの他の条件は、2または30分間、T、TLやSPとMDCKインキュベートし、一次抗体とのインキュベーションを省略します。
4. 非結合分子または栄養型を排除するために、冷PBSで上皮細胞を5回洗浄します。
5. 修正して、-20℃で30分間、96％エタノール1mlで細胞を透過
6. エタノールを除去し、室温で1mlのPBSで3回洗浄し、迅速に実行します。
7. サンプルの乾燥を避けるために、湿潤チャンバー内の次の手順を実行します。
   1. 閉じられた試料を安全に載置可能なウェットペーパータオルで充填することができる任意の利用可能な箱を使用する。たとえば、空のピペットチップボックスは、この目的を果たす。
   2. 室内に、均等にブロックのパラフィルム層とピペット25μLを配置各カバースリップ用の溶液（0.5％BSA）をING。
   3. 微細鉗子でウェルからカバースリップを取り、注意深く濾紙で縁から過剰な液体を除去し、細胞をブロッキング溶液に対向してブロッキング溶液（0.5％BSA）を含有する液滴にカバースリップを置く。室温で1時間試料をインキュベートする。
8. PBS中の一次抗体の混合物を準備したIgMマウス抗EhCPADH112（Mα-EhCPADH112、1:10希釈）およびIgGウサギ抗ZO-1（Pα-ZO-1、1:100希釈）。
9. 湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。
10. ブロッキング溶液からカバースリップを持ち上げ、濾紙を用いてエッジで余分な液体を乾燥させ、そして抗体溶液に面する細胞と滴にそれらを配置する。 4℃で一晩サンプルをインキュベート
11. 24マルチウェル（上部のセル側）のウェルに各カバースリップを入れて、1mlのPBSを加える。
    1. 非結合分子を除去するために1mlのPBSで5回洗浄する。
12. FITCと結合したヤギ抗IgMマウス（1:100希釈）とTRITC（1:50希釈）に結合されたヤギ抗IgGウサギ：PBS中に蛍光二次抗体の混合物を準備します。
13. 湿度の高いボックスとピペット各カバースリップのための二次抗体溶液25μlにパラフィルムの新鮮なシートを置きます。
14. 6.10のようにサンプルを転送し、蛍光色素の退色を避けるために、暗所で室温で1時間インキュベートする。ステップ6.11.1を繰り返します。
15. 核染色のために、室温で0.05 mMのDAPI溶液200μlで3分間インキュベートし、光から保護します。ステップ6.11.1を繰り返します。
16. 、蛍光色素を節約する5μLVECTAシールドにカバースリップ（細胞を下向き）を配置するために顕微鏡用スライドガラス上にマウントソリューションを退色防止。試料乾燥を避けるためにマニキュアを使用してカバーグラスをシール。
17. 長期保存のために、スライドを保つ-20℃での顕微鏡用スライドボックス
18. zスタックセクションとXZ-面（ 図2A）を介して共焦点顕微鏡による調剤を分析します。

プロテアーゼ阻害剤または特異的な抗体を用いて栄養型の7。インキュベーション

1. 繰り返して3.2に3.1を繰り返します。各実験条件については、4でプロテアーゼ阻害剤（コンプリート1 mMおよび40μg/ mlのE-64）、または20分間^{EhCPADH112（mαEhCPADH112）21}に対して、30μgのモノクローナル抗体（50μlのPBS中に再懸濁）1×10 ⁵栄養型インキュベート℃（ 図2B）。ステップ8.5で説明したように同時インキュベーションアッセイのためにこれらの製剤を使用してください。

経上皮電気抵抗（TER）の8。測定

1. 無菌トランスウェル透過性サポート（0.4μmの孔径）上で培養したMDCK細胞。上部コンパートメントには、細胞懸濁液を100μlを配置し、下部コンパートメント内DMEM培地を600μlを置く。
   1. 定期的に中レベルを確認してください。必要に応じて新鮮な培地を添加することができる。
   2. 彼らは合流点の100パーセントに達するまで倒立顕微鏡上の細胞を検査します。 2〜3日ごとに培地交換。
   3. 細胞接着（必要な場合）を改善するために、細胞懸濁液を添加する前にDME​​Mで37℃で一晩トランスウェルフィルターを平衡化。
2. UV光下で、15分間ずつエタノールに浸漬することによりフード内STX2電極を殺菌した後、滅菌PBS中。 EVOM上皮voltohmmeterに電極を接続し、抵抗モードを選択します。
3. 各トランスウェルの上部コンパートメントから培地を収集し、それらをプールする。このメディア混合液50μlを取り、栄養型懸濁液50μl（PBS中1×10 ⁵栄養型）またはPBSのみ（対照）とそれを組み合わせる。各トランスウェルのために同じような混合物を使用してください。
4. 各トランスウェルcontaininの上室に混合物を添加G MDCK細胞。実験条件は、栄養型（コントロール）することなく、栄養型またはプロテアーゼ阻害剤又はmαEhCPADH112と共にプレインキュベートした栄養体との共培養をMDCK細胞が挙げられる。フィルタによって提供される抵抗を排除するために、培地のみとインキュベートしたトランスウェルを使用しています。各実験条件について少なくとも3トランスウェルを使用しています。
5. すぐに、各トランスウェルにSTX2電極を浸漬することによりTERを測定します。
   1. 長い電極が下部チャンバーの底部に接触し、短い電極は（ 図2（b）参照 ）は、上部区画内の媒体によって覆われていることいることを確認してください。
   2. 毎回垂直に電極を保持するようにしてください。これは、有意に、再現性を改善する。これは、データの変化につながるように移動したり、測定中に電極を傾けることは避けてください。
6. この測定は、初期のTER値を考慮する必要があります。すると、次の中にTERを監視30分。
7. 最終のTER値を計算するために、唯一のフィルタのTER値を減算する。異なる実験からの結果を比較すると、100％（ 図2B）、これらを考慮して、初期値に各データポイントを正規化する。

結果

成功のためのE.アメーバ文化 、二つの重要な条件が満たされなければならない：対数期における無菌状態や収穫を増加します。 Eの以前に、文化アメーバは容易に細菌やtrypanosomatids ²²の特定の種に関連して設立された。しかし、今では、細菌、真菌、原生動物、または後生動物の細胞を代謝しない環境にアメーバの無期限継代培養を意味するこの寄生虫の無菌栽培...

ディスカッション

E.により、上皮感染中インビトロ宿主-病原体相互作用を研究するためにアメーバは、上皮細胞と栄養の両方の老舗の文化と連携することが重要である。例えば、以前は、E.アメーバ培養は通常、細菌やtrypanosomatids ^22,23の特定の種に関連して確立されていた。 Eのが、共培養アメーバ培養宿主細胞で観察された影響がはっきりとameobasに帰するこ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A	IMSS Hospital, Mexico	Without/number	Virulent trophozoites18
TYI broth	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Use at 10% and inactivated to 56 °C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80	In vitro	SR-07	Use at 3%
Penicillin	Lakeside,  Méx.	34564SSA IV	0.5 IU/ml
Streptomycin	Lakeside,  Méx.	75757SSA IV	35 µg/ml
Pyrex 15 ml screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacity 15 ml and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6-Well	Corning-Costar	3516	Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430168	Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium	Gibco	12800-017	Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum	In vitro	S-02	Use at 10%.
Penicillin/Streptomycin mixture	In vitro	A-01	Stock solution 10,000 U/µg/ml
Insulin	AMSA	398MJ94SSA IV	Stock solution 100 IU/ml
Trypsin solution	In vitro	EN-005	0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75 cm2 cell culture flask	Corning-Costar	430720	Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports	Corning-Costar	3470	0.4 µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24-well plate, growth area 0.3 cm2
24-well cell culture dish	Corning-Costar	3524	Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini	Roche	11836 153 001	Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/ml
pαZO-1	Invitrogen	402200	IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112	Homemade antibody	Without/ Number	IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM	Zymed	62-6811	Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L)	Zymed	816114	Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode	World Precision Instrument	102711	Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter	World Precision Instrument	12111	Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber	MEARIENFELD	610610	Hemocytometer
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Without/number	Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Mounting medium for fluorescence
4',6-diamino-2-phenylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA)	US Biological	A-1310	0.5%  final concentration for blocking solution