قياس المكانية والزمانية كاليفورنيا<sup&gt; 2+</sup&gt; إشارات في النباتات نبات الأرابيدوبسيس

Xiaohong Zhu; Aaron Taylor; Shenyu Zhang; Dayong Zhang; Ying Feng; Gaimei Liang; Jian-Kang Zhu

doi:10.3791/51945

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

كاليفورنيا ²⁺ إشارات تنظم العمليات البيولوجية المختلفة في النباتات. هنا نقدم النهج لرصد يسببها الإجهاد اللاحيوي الكالسيوم المكاني والزماني ²⁺ الإشارات في الخلايا والأنسجة باستخدام المشفرة وراثيا الكالسيوم ²⁺ مؤشرات Aequorin أو Case12 نبات الأرابيدوبسيس.

Abstract

العظة الإنمائية والبيئية تحفز الكالسيوم ²⁺ التقلبات في الخلايا النباتية. ومست المكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ أنماط التحفيز محددة من الكالسيوم ²⁺ ملزم البروتينات الخلوية التي تبدأ الكالسيوم ²⁺ يشير شلالات. ومع ذلك، ما زلنا لا نعرف إلا القليل حول كيفية التحفيز تتولد إشارات الكالسيوم معين ^2+. ويمكن أن يعزى خصوصية إشارة الكالسيوم ²⁺ لتنظيم متطورة لأنشطة قنوات الكالسيوم ²⁺ و / أو الناقلين في استجابة لحافز معين. لتحديد هذه المكونات الخلوية وفهم وظائفها، لا بد من استخدام الأنظمة التي تسمح تسجيل حساسة وقوية من إشارات الكالسيوم ²⁺ في كل من الأنسجة الخلوية والمستويات. وقد وفرت المشفرة وراثيا الكالسيوم ²⁺ المؤشرات التي تستهدف مقصورات الخلوية المختلفة منبرا للخلية الحية التصوير متحد البؤر الخلوية من الكالسيوم ²⁺ الإشارات. نحن هنا وصف التعليمق لاستخدام اثنين من الكالسيوم ²⁺ أنظمة الكشف: aequorin FAS (فيلم الشتلات لاصق) التلألؤ الكالسيوم ²⁺ التصوير وcase12 استنادا الخلية الحية متحد البؤر مضان الكالسيوم ²⁺ التصوير القائم. التصوير التلألؤ باستخدام نظام FAS يوفر الكشف بسيطة وقوية وحساسة من المكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ إشارات على مستوى الأنسجة، في حين أن الخلية الحية التصوير متحد البؤر باستخدام Case12 يتيح الكشف المتزامن للعصاري خلوي والكالسيوم النووية ²⁺ إشارات بدقة عالية.

Introduction

في الخلية النباتية وتستجيب للبيئة عن طريق الإشارات التي تنسق أعمال الخلية. خلية مبكرة يشير الحدث في الاستجابة للمؤثرات البيئية هي عابرة زيادة الكالسيوم ^2+. يتميز نمط، أو التوقيع على زيادة عابرة في حر تركيز الكالسيوم في ²⁺ من السعة، والتردد، والمدة. المكانية والزمانية التوقيعات الكالسيوم ²⁺ متميزة تنظم الأنشطة الخلوية المختلفة ^1. محفزات معينة، مثل الحرارة والبرودة، والملح، والجفاف، والضوء، أو الهرمونات النباتية، قد صقل النشاط المكانية والزمانية من المترجمة الغشاء قنوات الكالسيوم ²⁺ و / أو النقل، مما أدى محددة كا ²⁺ التوقيعات. على الرغم من الكالسيوم ²⁺ النقل اتسمت أيضا، لا يعرف إلا القليل عن الهويات الجزيئية وظائف قنوات الكالسيوم ²⁺ في النباتات ^1. شاشات الجينية للالمسوخ مع تغيير كا ²⁺ ردا على التأكيد على المحفزات قد تكون فعالة approach لتحديد المكونات التي تؤلف التوقيعات الكالسيوم ^2+. وقد وضعت كا ²⁺ أنظمة الكشف مؤخرا العديد Aequorin استنادا التي تسهل شاشات الجينية للكا ²⁺ يشير مكونات ردا على مهاجمة مسببات الأمراض والإجهاد اللاحيوي ^2-4.

وقد استخدم Aequorin أول من كشف الكالسيوم ²⁺ إشارات في النباتات في وقت مبكر 1990s ^5. منذ ذلك الحين، تم استهداف Aequorin إلى مقصورات الخلوية المختلفة، مثل السيتوبلازم ^5، نواة ^{6، 7} البلاستيدات الخضراء، tonoplast ^{8، 9} الميتوكوندريا، ^و10 سدى، فضلا عن أنواع مختلفة من الخلايا في جذر لمراقبة خلية معينة كا ^{2 +} إشارات ^11. تكشف القياسات الكالسيوم Aequorin استنادا ²⁺ والمكانية والزمانية الكالسيوم ²⁺ استجابة من مجموعة من الخلايا التأكيد على المحفزات. ومع ذلك، في معظم الحالات، ردود ²⁺ الكالسيوم من الخلايا واحدة هي unsynchroniزيد في الأنسجة الاستجابة ^4. لذا، وتسجيل Aequorin الكالسيوم ²⁺ لا تفيد بالضرورة إشارة ²⁺ الكالسيوم في الخلايا الفردية. في السنوات الأخيرة، المشفرة وراثيا بروتين فلوري (FP) القائم على الكالسيوم ²⁺ المؤشرات، مثل كمليون الأصفر (YCS) ¹² و ¹³ CASEs12 استخدمت لدراسة كا ²⁺ يشير لقرار التحت خلوية عالية. YCS هي مضان نقل الطاقة الرنين (الحنق) القائم على الكالسيوم ²⁺ المؤشرات، التي تحتوي على CFP YFP والمتغيرات التي ترتبط كا ²⁺ -binding كالمودولين البروتين والببتيد كالمودولين ملزم M13. كالمودولين تخضع لعملية تغيير متعلق بتكوين جزئي كما يرتبط الكالسيوم ^2+، مما يجلب CFP YFP وأقرب معا، مما يؤدي إلى زيادة نقل الطاقة (تعزيز الحنق). مستوى الحنق على مر الزمن، وتحسب تقريبا كنسبة من YFP إلى CFP شدة إشارة، يعكس الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ ديناميات. وقد استخدمت العديد من إصدارات البطاقة الصفراء في النباتات. كان YC3.6 رargeted إلى العصارة الخلوية ^{14،15، 16} النواة، الميتوكوندريا ^17، وغشاء البلازما ^18، وYC4.6 وD4ER استهدفت ER إلى ^15،19، واستهدف D3cpv إلى peroxisomes ^20. النباتات المعدلة وراثيا معربا عن YCS تسمح التصوير الخلية الحية من الكالسيوم ²⁺ ديناميات داخل مقصورات الخلوية المختلفة من أنواع مختلفة من الخلايا. الحالات (ويفترض الكالسيوم lcium حد ذاته nsor) هي بروتينات واحدة دائري مبدل الفلورسنت (cpFPs) بايواء وكالمودولين ملزم كالمودولين الببتيد M13. على الربط إلى الكالسيوم ^2+، وحالات تخضع التغييرات متعلق بتكوين، مما يؤدي إلى زيادة كثافة مضان. العلاقة بين استجابة مضان كيس والكالسيوم تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ²⁺ يسمح ²⁺ ديناميات المراد قياسها كميا. البديل Case12 تمت زيادة 12 أضعاف في مضان أشكال -saturated الكالسيوم ^2+. N. النباتات benthiminana عابر EXPRاستخدمت essing Case12 أو النباتات نبات الأرابيدوبسيس التعبير عن ثابت 12 حالة لدراسة كا ²⁺ الإشارات في الدفاع والضغط ^4،21 أحيائية. وقد كشف غير المتزامن الكالسيوم المكاني والزماني ²⁺ التذبذبات في خلايا الاستجابة للهجوم الممرض، أو للإجهاد الجفاف مع Case12 مقرها كاليفورنيا ²⁺ التصوير.

هنا، نقدم تعليمات مفصلة لAequorin التصوير التلألؤ على أساس من نسيجيا والمحفزات محدد الكالسيوم ²⁺ ديناميكية في شتلات نبات الأرابيدوبسيس، والتصوير متحد البؤر من عصاري خلوي والكالسيوم النووي ²⁺ ديناميكية في الخلايا الجذرية نبات الأرابيدوبسيس التي تعبر عن حالة 12. التلألؤ التصوير FAS يمكن تكييفها لتحليل الإجهاد الناجم عن الكالسيوم ²⁺ ديناميكية في النباتات أو الأنسجة غير الوارد وصفها هنا سليمة، أو لفحص mutagenized السكان نبات نبات الأرابيدوبسيس لالمسوخ مع الإجهاد الناجم غيرت الكالسيوم ²⁺ الإشارات. يمكن أن تتكيف الخلية الحية الكالسيوم ²⁺ الإعداد التصوير لتحليل الكالسيوم2+ ديناميات داخل مقصورات subcelluar مختلفة أو في أنواع مختلفة من الخلايا الأخرى باستخدام المؤشرات الكالسيوم ^2+.