Misurazione spaziale e temporale Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Segnali in Arabidopsis Piante

Riepilogo

Segnalazione Ca ^{2 +} regola diversi processi biologici nelle piante. Qui vi presentiamo approcci per il monitoraggio di stress abiotico indotto Ca spaziale e temporale ²⁺ segnali nelle cellule e tessuti utilizzando le geneticamente codificati Ca ^{2 +} indicatori aequorina o Case12 Arabidopsis.

Abstract

Spunti di sviluppo e ambientali inducono Ca ^{2 +} fluttuazioni di cellule vegetali. Specifica-Stimolo spazio-temporali Ca ^{2 +} modelli vengono rilevati da Ca ^{2 +} legame proteine ​​cellulari che avviano Ca cascate di segnalazione ^{2 +.} Tuttavia, sappiamo ancora poco su come i segnali di stimolo specifico Ca ^{2 +} sono generati. La specificità di un segnale Ca ^{2 +} può essere attribuito al sofisticato regolamentazione delle attività di Ca ^{2 +} canali e / o trasportatori in risposta ad un dato stimolo. Per identificare questi componenti cellulari e capire le loro funzioni, è fondamentale utilizzare sistemi che permettono una registrazione sensibile e robusto di segnali Ca2 ⁺ sia a livello tissutale e cellulare. Geneticamente codificati Ca ^{2 +} indicatori che sono indirizzate ai vari compartimenti cellulari hanno fornito una piattaforma per cellule in vivo confocale di cellulari Ca ^{2 +} segnali. Qui si descrive l'istruziones per l'utilizzo di due sistemi di rilevamento Ca ^{2 +:} aequorina basa FAS (film piantine adesivi) luminescenza Ca ^{2 +} di imaging e case12 a base di cellule dal vivo confocale Ca ^{2 +} imaging. Di imaging luminescenza utilizzando il sistema FAS fornisce un rilevamento semplice, robusta e sensibile spaziali e temporali Ca ^{2 +} segnali a livello dei tessuti, mentre cellule vive di imaging confocale utilizzando Case12 fornisce rilevamento simultaneo di citosoliche e nucleari Ca ^{2 +} segnali ad alta risoluzione.

Introduzione

La cellula vegetale risponde all'ambiente via di segnalazione che coordina le azioni delle cellule. Una cella all'inizio di segnalazione evento in risposta a stimoli ambientali è un transitorio aumento di Ca ^{2 +.} Il modello, o la firma di un aumento transitorio della concentrazione di Ca ^{2 +} libero si caratterizza per la sua ampiezza, frequenza e durata. Firme Ca ^{2 +} spazio-temporali distinti regolano diverse attività cellulari ^1. Stimoli specifici, come il caldo, il freddo, il sale, la siccità, la luce, o ormoni vegetali, possono ottimizzare l'attività spazio-temporale della membrana localizzata Ca ^{2 +}

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Protocollo

1 aequorina Based Imaging Ca ^{2 +} Uso del sistema FAS

1. Preparare piantine per l'imaging luminescenza. Sterilizzare semi di piante di Arabidopsis esprimenti aequorina con una soluzione di candeggina al 10% contenente 0,01% Triton-100. Seminare i semi sterili su un piatto quadrato (10 x 10 centimetri piatto quadrato Petri con griglia,) contenenti piena forza MS (Murashige e Skoog basale Sale Miscela), 1% di saccarosio, e il 1,2% agar. Piastre Inserire verticalmente in una camera di crescita dopo stratificazione a 4 ° C per 2 giorni (Figura 1A).
2. Trasferire le piantine su un film. Inserire un film adesivo (Figura....

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Risultati

Mannitolo, NaCl e H ₂ O ₂ sono stati utilizzati come proxy per gli stimoli disidratazione, il sale e lo stress ossidativo, rispettivamente. Per controllare se lo ione metallo pesante Cu ^{2 +} sinergia con qualsiasi di questi tre stimoli di stress, abbiamo confrontato il Ca ^{2 +} risposta ad ogni stimolo in presenza o assenza di Cu ^{2 +.} Come mostrato in Figura 2, FAS di imaging luminescenza rivelato che piantine Arabidoposis risposto diversamente a disid.......

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Discussione

Abbiamo dimostrato un sistema FAS per la registrazione del spazio-temporale Ca ^{2 +} risposta di piantine di Arabidopsis. Questo ²⁺ sistema di registrazione FAS Ca offre un approccio semplice, sensibile e robusto che può essere adattato per misurare Ca ^{2 +} dinamiche innescate da vari stimoli, oltre agli stimoli di stress abiotici che vengono presentati qui. Utilizzando questo sistema, siamo in grado di confrontare facilmente tessutale o stimoli specifici spazio-temporali Ca ^{2 +}.......

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG