Medición Espacial y Temporal Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Las señales en plantas de Arabidopsis

Resumen

La señalización de Ca2 ⁺ regula diversos procesos biológicos en las plantas. Aquí presentamos los enfoques para el control de estrés abiótico inducida espacial y temporal Ca ^{2 +} señales en las células y tejidos que usan las codificados genéticamente Ca ^{2 +} indicadores Aequorina o Case12 Arabidopsis.

Resumen

Señales de desarrollo y ambientales inducen Ca ^{2 +} fluctuaciones en las células vegetales. Espacio-temporales de Ca ^{2 +-patrones} de estímulo específico son detectados por las proteínas de unión a Ca ^{2 +} celulares que inician Ca ^{2 +} cascadas de señalización. Sin embargo, todavía sabemos poco sobre cómo estímulo señales específicas Ca ^{2 +} se generan. La especificidad de una señal de Ca2 ⁺ puede atribuirse a la regulación sofisticada de las actividades de los canales y / o transportadores de Ca ^{2 +} en respuesta a un estímulo dado. Para identificar estos componentes celulares y entender sus funciones, es crucial usar sistemas que permiten una grabación sensible y robusta de señales de Ca ^{2 +,} tanto en el tejido y niveles celulares. Genéticamente codificados Ca ^{2 +} indicadores que están dirigidos a diferentes compartimentos celulares han proporcionado una plataforma para la célula viva imagen confocal de celulares Ca ^{2 +} señales. Aquí se describe la instruccións para el uso de dos sistemas de detección de Ca ^{2 +:} Aequorina basa FAS (adhesivo de película) plántulas luminiscencia Ca ^{2 +} de imágenes y basado case12 de fluorescencia confocal de células vivas Ca ^{2 +} de imágenes. De imágenes de luminiscencia usando el sistema FAS ofrece una detección simple, robusto y sensible de espaciales y temporales Ca ^{2 +} señales a nivel de los tejidos, mientras que la célula viva imagen confocal utilizando Case12 ofrece detección simultánea de citosólicas y nucleares Ca ^{2 +} señales con una resolución alta.

Introducción

La célula de la planta responde al medio ambiente a través de señalización que coordina las acciones celulares. Un evento de señalización temprana de la célula en respuesta a estímulos del medio ambiente es un aumento transitorio de Ca ^{2 +.} El patrón, o la firma de un aumento transitorio en la concentración de Ca2 ⁺ libre se caracteriza por su amplitud, frecuencia, y duración. Firmas Ca ^{2 +} espacio-temporales diferentes regulan diferentes actividades celulares ^1. Estímulos específicos, como el calor, el frío, la sal, la sequía, la luz o las hormonas vegetales, pueden afinar la actividad espacio-temporal de Ca ^{2 +} canales de membrana localizada y / o transportistas, lo que resulta en específicos de Ca ^{2 +} firmas. Aunque Ca ^{2 +} transportistas han sido bien caracterizado, se sabe poco sobre las identidades moleculares y las funciones de los canales de Ca ^{2 +} en las plantas ^1. Pantallas genéticos para mutantes con alteración de Ca ^{2 +} respuesta al estrés estímulos pueden ser un apr efectivaoach para la identificación de los componentes que componen las firmas de Ca ^{2 +.} Ca ^{2 +} sistemas de detección Recientemente basa varios Aequorina han sido desarrollados para facilitar las pantallas de genética para el Ca ^{2 +} señalización componentes en respuesta al ataque de patógenos y estrés abiótico ^2-4.

Aequorina fue utilizado por primera vez para detectar Ca ^{2 +} señales en plantas a principios de 1990 ^5. Desde entonces, la Aequorina se ha dirigido a diferentes compartimentos celulares, tales como el citoplasma ^5, el núcleo ^{6, 7} cloroplastos, tonoplasto ^{8, 9} mitocondrias, y el estroma ^10, así como a diferentes tipos de células en la raíz para supervisar celda específica Ca ^{2 +} señales ^11. Mediciones de Ca ^{2 +} basado Aequorina revelan la espacial y temporal Ca ^{2 +} respuesta de una población de células para estresar estímulos. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las respuestas de la Ca ^{2 +} de las células individuales son unsynchronizado en el tejido de responder ^4. Por lo tanto, la grabación Aequorina Ca ^{2 +} no informa necesariamente la señal de Ca ^{2 +} en las células individuales. En los últimos años, la proteína fluorescente codificada genéticamente (FP) a base de Ca ^{2 +} indicadores, como cameleon amarilla (YCs) ¹² y CASEs12 ¹³ se han utilizado para estudiar Ca ^{2 +} señalización con alta resolución subcelular. YCs son la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) a base de Ca ^{2 +} indicadores, que contiene PPC y YFP variantes vínculo del Ca ^{2 + vinculante} calmodulina proteína y péptido de unión a calmodulina-M13. La calmodulina sufre un cambio conformacional ya que se une a Ca ^{2 +,} con lo que trae PPC y YFP más cerca juntos, resultando en una mayor transferencia de energía (FRET mejorada). El nivel de FRET con el tiempo, más o menos calculado como la relación de las intensidades de señal de YFP PPC, refleja la dinámica intracelular de Ca ^{2 +.} Varias versiones TA se han utilizado en las plantas. YC3.6 era targeted al citosol ^14,15, el núcleo ^{16, 17} mitocondrias y membrana plasmática ^18, y YC4.6 y D4ER fueron atacados a Urgencias ^15,19, y D3cpv fue dirigido a los peroxisomas ^20. Las plantas transgénicas que expresan YCs permiten la formación de imágenes en vivo de células de Ca ^{2 +} dinámica dentro de los diferentes compartimentos celulares de diferentes tipos de células. Casos (presumiblemente Ca lcium sí Nsor) son proteínas individuales circularmente permutados fluorescentes (CPFPS) albergan una calmodulina y el péptido de unión a calmodulina-M13. Tras la unión a Ca ^{2 +,} CASEs sufren cambios conformacionales, llevando a un aumento de la intensidad de fluorescencia. La correlación entre la respuesta de fluorescencia del CASE y concentración de Ca2 ⁺ intracelular ^de Ca ^{2 +} permite la dinámica que se deben medir cuantitativamente. La variante Case12 ha 12 veces mayor fluorescencia en la Ca ^{2 +} formas saturados. N. plantas benthiminana transitoriamente expresser Case12 o plantas de Arabidopsis que expresan establemente caso 12 se utilizaron para estudiar Ca ^{2 +} señalización en defensa y abióticos de estrés ^4,21. Asíncrono espacial y temporal de Ca ^{2 +} oscilaciones en células que responden al ataque de patógenos, o al estrés deshidratación han sido reveladas con basado Case12 Ca ^{2 +} de imágenes.

A continuación, presentamos las instrucciones detalladas para Aequorina imágenes luminiscencia basada de tejidos y estímulos específicos de Ca ^{2 +} en la dinámica de plántulas de Arabidopsis, y de imagen confocal de citosólicas y Ca ^{2 +} dinámica nuclear en células de la raíz de Arabidopsis que expresan Caso 12. luminiscencia imágenes de FAS podría ser adaptado para analizar el estrés inducido por la dinámica de Ca2 ⁺ en las plantas o tejidos que no se describen aquí intactos, o para cribar poblaciones de plantas de Arabidopsis mutagenizadas para mutantes con el estrés alterada inducida por Ca ^{2 +} señales. La configuración de imágenes de células vivas Ca2 ⁺ podría adaptarse para analizar Ca2 + dinámicas dentro de diferentes compartimentos subcelular o en diferentes tipos de células utilizando otros indicadores de Ca ^{2 +.}

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Protocolo

1. Aequorina Based Ca ^{2 +} Imaging Uso del sistema FAS

1. Preparar plántulas para imágenes de luminiscencia. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan Aequorina con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton-100. Siembre las semillas estériles en un plato cuadrado (10 x 10 cm cuadrados caja de Petri con rejilla,) que contiene toda su fuerza MS (Murashige y Skoog Basal Sal Mezcla), 1% de sacarosa y 1,2% de agar. Colocar las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días (Figura 1A).
2. Transferir las plántulas sobre una película. Colocar una película adhesiva (Figura 1B) en la parte superior de 7-10 días de edad plántulas que crecen en la placa. Empuje suavemente la película con la mano para asegurarse de que las plántulas se adhieren a la película (Figura 1C). Pelar la película con cuidado para que las plántulas permanecen adheridos a la película (Figura 1D y 1E)
3. Se incuban las plántulas con cofactor. Colocar la unaplántulas dhered sobre la placa cuadrada (10 x 10 cm) que contiene 15 ml de 2 mg / ml h-CTZ (coelenterazina) en agua. Incubar las plantas de semillero a temperatura ambiente durante 4 horas a toda la noche (Figura 1F).
4. Preparar para la imagen de luminiscencia. Tome la película fuera de la solución h-CTZ y cortar por la mitad, formando dos piezas. Coloque cada pieza de película con plántulas cara arriba en dos placas diferentes. Deje las placas en la oscuridad durante 5 min.
5. Adquirir imágenes de luminiscencia. En la oscuridad, colocar las dos placas junto a la otra en la etapa del sistema de imágenes de luminiscencia (Figura 1G). Adquirir imágenes inmediatamente después de la adición de 20 ml de solución de estímulos a las placas de forma simultánea.
6. Analizar imágenes de luminiscencia. Elija el mismo rango de visualización para todas las imágenes de luminiscencia. Recortar la región de interés (ROI) y generar las imágenes como archivos JPEG (Figura 2A). Alternativamente, exportar las imágenes como archivos de formato SPE e importarlos en elImageJ software de análisis de imagen. Medidas de ajuste para el cálculo del valor medio gris del ROI. Seleccione el mismo tamaño del área de retorno de la inversión y medir los datos de grises y presentes medios como gráficos de barras (Figura 2B).

2. vivo Cell Confocal Ca ^{2 +} Imaging

1. Preparar plántulas para la imagen confocal. Esterilizar semillas de plantas de Arabidopsis que expresan case12 con una solución de lejía al 10% que contiene 0,01% de Triton. Siembre las semillas estériles en una placa que contiene la fuerza completa sales MS, sacarosa al 1%, y 1,2% de agar. Coloque las placas verticalmente en una cámara de crecimiento después de la estratificación a 4 ° C durante 2 días.
2. Cámaras de imagen de instalación
   1. Montar una cámara de imágenes usando un portaobjetos y cubreobjetos (Sala A). Coloque un trozo de lana de algodón empapado de agua en el medio de la corredera. A continuación, traslado de uno o dos 5 días plántulas de la placa en la parte superior del agua empapada lana de algodón. Se adhieren pequeños trozos de arcilla a cada esquina de un cubreobjetos, unad lugar cubreobjetos en la parte superior de las plantas de semillero para crear un espacio (cámara) entre el cubreobjetos y portaobjetos (Figura 3A, panel izquierdo). Conectar un extremo del tubo de polietileno (0,58 mm de diámetro) a una jeringa de 1 ml y colocar el otro extremo del tubo inmediatamente adyacente a la cámara. Sostenga el tubo en su lugar con cinta (Figura 3A, panel derecho).
   2. Montar una cámara de imágenes utilizando una cámara de plexiglás (Sala B).
      1. Extender una capa fina de grasa de silicona alrededor de dos tubos de polietileno (0,58 mm de diámetro) y presione los tubos revestidos en los canales a cada lado de la cámara de plexiglass (Figura 3B panel de la izquierda). Extender una capa fina de grasa de silicona sobre la superficie de la cámara que contiene las ranuras del tubo y presione un cubreobjetos en la grasa para sellar un lado de la abertura de la cámara (cortadas).
      2. Transferir una antigua planta de semillero cinco días a partir de la placa en la cámara y coloque un trozo de algodón empapado con agua en la parte superior of la plántula. Extienda la grasa de silicona sobre la otra superficie de la cámara, y presione otro cubreobjetos en la parte superior para sellar. Conectar el extremo de uno de los tubos a una jeringa de 1 ml. Deje el extremo del otro tubo (panel de la derecha Figura 3B) abierta.
   3. Preparar una cámara de imágenes utilizando una cubierta de vidrio cámaras (Cámara C). Esterilizar el cristal de la cubierta de cámaras con etanol al 70% y se deja en el capó hasta que se seque. Añadir 0,6 ml o 0,2 ml de fuerza completa medio MS que contenía 1% de sacarosa y 0,5% de fitagel en cada pocillo de una cámara de 2 pocillos o una cámara de 8 pocillos (panel de la derecha Figura 3C), respectivamente. Esterilizar semillas y sembrar las semillas directamente en una cubierta de vidrio cámaras que contiene una fina capa de gel transparente y dejarlos crecer verticalmente durante 5 días (Figura 3C).
3. Adquirir imágenes utilizando un microscopio confocal. Para aplicar estímulos de estrés, como la sal, el frío o peróxido, inyectar lentamente alrededor de 200 l de NaCl 150 mM, hielo-cold agua o 1 mM H ₂ O ₂ solución en la cámara (Cámara A o B) justo antes de la adquisición de imágenes, o agregar suavemente 500 l o 100 l de solución de estímulo para el pozo de una cámara de 2 o de 8 pocillos, respectivamente . Capturar imágenes inmediatamente después de aplicar la solución de estímulo utilizando un microscopio confocal Nikon A1R de escaneo láser invertida con un lente de inmersión en agua 20X (apertura numérica 0,75). Reúne una serie temporal de imágenes a intervalos de 4 segundos con longitudes de onda de excitación y emisión de 488 nm y 500-550 nm, respectivamente, y con una resolución de píxel de 512 x 512.
4. Análisis de Imagen
   Usando Nikon Elements, ROIs fueron elaboradas alrededor de cada celda (o área) de interés. Intensidad total dentro de cada ROI se mide en el tiempo utilizando el cuadro de diálogo Medición del tiempo (ImageJ se podría utilizar en su lugar). Mediciones totales de intensidad fueron exportados y tratados en Datagraph. Ca ^{2 +} amplitud pico se define como la intensidad máxima de menos intensidad de descanso, la duración como ªtiempo e entre el inicio y la finalización de un pico, y el período como el intervalo de tiempo entre los picos pico adyacentes de dos picos. t-test fue utilizado para comparar las medias.

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Resultados

Manitol, NaCl y H ₂ O ₂ se utilizaron como indicadores de la deshidratación, la sal y el estrés oxidativo estímulos, respectivamente. Para comprobar si el ion de metal pesado Cu ^{2 +} sinergia con cualquiera de estos tres estímulos de estrés, se comparó la Ca ^{2 +} respuesta a cada uno de los estímulos en la presencia o ausencia de Cu ^{2 +.} Como se muestra en la Figura 2, las imágenes de luminiscencia FAS reveló que las plantas de semillero Arab...

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Discusión

Hemos demostrado un sistema FAS para el registro de la espacio-temporal Ca ^{2 +} respuesta de plántulas de Arabidopsis. Este sistema de grabación FAS ^{2 +} Ca proporciona un enfoque sencillo, sensible y robusto que se podría adaptar para medir la dinámica de Ca ^{2 +} desencadenadas por diversos estímulos, además de los estímulos de estrés abióticos que se presentan aquí. El uso de este sistema, podemos comparar fácilmente tejido o específicos estímulos espaciales-temporales ^d...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG