测量时空的Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;在拟南芥信号

Xiaohong Zhu; Aaron Taylor; Shenyu Zhang; Dayong Zhang; Ying Feng; Gaimei Liang; Jian-Kang Zhu

doi:10.3791/51945

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摘要

^的 Ca ^{2 +}信号调控植物中不同的生物过程。在这里，我们提出的方法用于监测非生物胁迫诱导的时空钙在拟南芥的细胞，并使用基因编码的^钙指标水母发光蛋白或Case12组织^{2 +}信号。

摘要

发展与环境线索诱发^的 Ca ^{2 +}的波动在植物细胞中。刺激特定的空间-时间^的 Ca ^{2 +}的图案是由发起^的 Ca ^{2 +}信号传导级联的细胞^的 Ca ^{2 +}结合蛋白的检测。但是，我们仍然知之甚少如何刺激产生特定的^钙信号。 à ^钙离子信号的特殊性可能是由于^钙离子通道和/或转运活动的复杂调控响应给定的刺激。识别这些细胞成分和理解它们的功能，关键的是要使用的系统，允许^的 Ca ^{2 +}信号的灵敏和鲁棒记录同时在组织和细胞水平。基因编码的定位到不同的细胞^钙指标都规定了细胞^钙信号活细胞共聚焦成像的平台。在这里，我们描述的指令S为使用两^钙离子检测系统:基于水母发光蛋白FAS（薄膜粘合苗）发光^钙成像和case12基于活细胞共聚焦荧光^钙离子成像。使用FAS系统发光成像提供了一种简单，可靠和灵敏的检测的空间和时间^的 Ca ^{2 +}信号，在组织水平的，同时采用Case12活细胞的共聚焦成像提供同时检测胞质和核^的 Ca ^{2 +}信号中的较高的分辨率。

引言

植物细胞响应该坐标细胞动作经由信令环境。早期的细胞在应对环境刺激信号事件是一个短暂的^钙增加。的图案，或一过性升高签名中游离^的 Ca ^{2 +}浓度的特征在于，其振幅，频率和持续时间。不同的时空^钙签名规范不同的细胞活动^1。特定刺激，如热，冷，盐，干旱，光，或植物激素，可以微调膜本地化^的 Ca ^{2 +}通道和/或转运的时空活性，导致具体^的 Ca ^{2 +}的签名。虽然^钙离子转运都得到很好的特点，鲜为人知的是， ^钙离子通道在植物¹分子的身份和功能。对于突变体遗传筛选具有改变^的 Ca ^{2 +}响应强调刺激可能是一种有效APPRoach用于识别构成^的 Ca ^{2 +}的签名的组件。最近基于几个水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}检测系统已被开发，以促进遗传筛选的^钙响应于病原体攻击和非生物胁迫^2-4信令组件。

水母发光蛋白最早是用于检测钙在植物体内^离子信号在90年代初^5。从那时起，水母发光蛋白已经被定位到不同的细胞区室，如细胞质^5，核^6，叶绿体^7，液泡膜^8，线粒体⁹和基质^10，以及不同的细胞类型中的根来监视特定的Ca ²细胞⁺信号^11。基于水母发光蛋白^钙离子的测量揭示细胞应力刺激人口的空间和时间^的 Ca ^{2 +}的响应。然而，在大多数情况下，单个细胞的^钙离子的反应是unsynchroni捷思在响应组织^4。因此，水母发光蛋白^的 Ca ^{2 +}的记录不一定报告在个体细胞中的^钙信号。近年来，基因编码荧光蛋白（FP）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，如黄色卡默莱昂^（YCS）12和CASEs12 ¹³已被用于研究^的 Ca ^{2 +}具有高亚细胞分辨率的信号。 YCS是荧光共振能量转移（FRET）为基础^的 Ca ^{2 +}的指标，含有CFP和YFP的变体由钙挂钩^{2 +}结合蛋白钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。钙调蛋白发生构象变化，因为它结合^的 Ca ^{2 +，}由此带来的CFP和YFP更加靠近，从而增加了能量转移（FRET增强）。随着时间的荧光共振能量转移的水平，大约为YFP对CFP信号强度的比值计算，反映了细胞内^钙离子动态。几个YC版本已被用于在植物中。 YC3.6为吨argeted到细胞质^14,15，核^16，线粒体^17，和质膜^18，和YC4.6和D4ER被定位到ER ^15,19，和D3cpv被靶向过氧化物酶体^20。转基因植物表达YCS允许不同类型的细胞不同的细胞内^钙离子动态的活细胞成像。例（大概钙 lcium 本身 nsor）是单圆置换荧光蛋白（cpFPs）窝藏钙调蛋白和钙调蛋白结合肽M13。结合后^的 Ca ^{2 +，}情况发生构象变化，从而导致增加的荧光强度。该案例的荧光响应和Ca ^{2 +}浓度之间的相关性使得细胞内^钙离子动力学来进行定量测定。在^钙 -饱和脂肪形式Case12变种12倍的增加荧光。N。 benthiminana植物瞬时EXPRessing Case12或拟南芥稳定表达病例12为材料，研究^钙信号在国防和非生物胁迫^4,21。异步时空^钙离子振荡，细胞应对病原体的攻击，或脱水的压力已经显露了Case12基于^钙离子成像。

在这里，我们提出的组织-和刺激基于水母发光蛋白发光成像特定的CA在拟南芥幼苗^离子动力，并为细胞内的共焦成像与核钙的详细说明，在拟南芥根细胞^离子的动态表达的FAS案例12发光成像可适于分析在完整植物或此处未描述的组织应力诱导^的 Ca ^{2 +}的动态，或筛选诱变的拟南芥属植物种群，对具有改变的应力诱导^的 Ca ^{2 +}信号的突变体。活细胞^的 Ca ^{2 +}成像设置可适于分析钙使用其他^钙指标内的不同亚细胞区室或在不同类型的细胞离子动力。