Mess räumliche und zeitliche Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Signale in Arabidopsis-Pflanzen

Zusammenfassung

Ca2 ⁺ Signalweg reguliert verschiedene biologische Prozesse in Pflanzen. Hier präsentieren wir Ansätze zur Überwachung abiotischen Stress induziert räumliche und zeitliche Ca ^{2 +-Signale} in Arabidopsis Zellen und Geweben unter Verwendung der genetisch codierten Ca2 ^{+-Indikatoren} Aequorin oder Case12.

Zusammenfassung

Entwicklungs-und Umweltreize auslösen Ca ^{2 +} Schwankungen in Pflanzenzellen. Reiz-spezifischen räumlichen-zeitlichen Ca ^{2 +} Muster werden durch zelluläre Ca2 ^+-bindende Proteine, die Ca ^{2 +-Signalkaskaden} initiieren abgetastet. Allerdings wissen wir noch wenig darüber, wie bestimmte Reiz Ca ^{2 +-Signale} erzeugt. Die Spezifität eines Ca ^{2 +-Signal} kann der ausgereiften Regulierung der Aktivitäten von Ca ^{2 +-Kanäle} und / oder Transporteure als Antwort auf einen gegebenen Reiz zurückzuführen. Diese Zellkomponenten zu identifizieren und ihre Funktionen zu verstehen, ist es wichtig, Systeme, die eine empfindliche und stabile Aufnahme der Ca2 ^+-Signale sowohl auf dem Gewebe und zellulärer Ebene zu ermöglichen verwenden. Genetisch kodierte Ca ^{2 +-Indikatoren,} die zu verschiedenen zellulären Kompartimenten richtet sind haben eine Plattform für Live Cell konfokale Bildgebung von zellulären Ca ^{2 +-Signale} zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir Unterrichts für die Verwendung von zwei Erfassungssystemen Ca ^{2 +:} Aequorin basierend FAS (Klebefilm Sämlinge) Ca ^{2 +-Lumineszenz-Bildgebung} und case12 basierend Lebendzell konfokalen Fluoreszenz Ca ^{2 +-Bildgebung.} Lumineszenz-Bildgebung mit der FAS-System bietet eine einfache, robuste und sensitive Detektion der räumlichen und zeitlichen Ca ^{2 +-Signale} in der Gewebeebene, während Live Cell Imaging mit konfokalen Case12 bietet simultane Detektion von zytosolischen und Kern Ca ^{2 +-Signale} mit einer hohen Auflösung.

Einleitung

Die Pflanzenzelle reagiert auf die Umgebung über die Signalisierungszelle Aktionen koordiniert. Ein frühes Zellsignalisierungsereignis als Reaktion auf Umweltreize ist eine vorübergehende Ca ^{2 +} zu erhöhen. Das Muster oder der Signatur einer transienten Zunahme der freien Ca ^{2 +-Konzentration} wird durch seine Amplitude, Frequenz und Dauer ist. Unterschiedliche Raum-Zeit-Ca ^{2 +-Signaturen} regulieren verschiedene Zellaktivitäten ^1. Spezifische Reize, wie Hitze, Kälte, Salz, Trockenheit, Licht oder Pflanzenhormone, kann eine Feinabstimmung des räumlichen und zeitlichen Aktivität des Membran-lokalisierten Ca ^{2 +-Kanäle} und / oder Transporteure, was in bestimmten Ca2 ^{+-Signaturen.} Obwohl Ca ^{2 +-Transporter} sind gut gekennzeichnet, ist nur wenig über die molekularen Identitäten und Funktionen der Ca2 ^+-Kanäle in Pflanzen ¹ bekannt. Genetische-Mutanten mit veränderten Ca ^{2 +} Reaktion auf Reize betonen, kann eine wirksame ca. seinoach für die Identifizierung der Komponenten, die Ca ^{2 +-Signaturen} zu komponieren. Kürzlich mehrere Aequorin basierend Ca ^{2 +} Detektionssysteme entwickelt, die genetischen Screens erleichtern für Ca2 ⁺ Signalkomponenten in Reaktion auf Krankheitserreger angreifen und abiotischen Stress ^2-4.

Äquorin wurde zuerst verwendet, um in den frühen 1990er Jahren ⁵ Ca ^{2 +-Signale} zu erkennen in Pflanzen. Seitdem hat Aequorin zu verschiedenen Zellkompartimenten wie dem Zytoplasma ^5, Kern ^{6, 7,} Chloroplasten, tonoplast ^{8, 9} Mitochondrien und Stroma ¹⁰ sowie an verschiedenen Zelltypen in der Stammzell spezifische Ca ² überwachen gezielt worden ⁺ Signale ^11. Äquorin basierend Ca ^{2 +-Messungen} zeigen, die räumliche und zeitliche Ca2 ⁺ Antwort einer Population von Zellen auf Reize zu betonen. In den meisten Fällen sind jedoch die Ca ^{2 +-Antworten} einzelner Zellen unsynchroniim antwort Gewebe ⁴ zed. Daher Aequorin Ca2 ⁺ Aufnahme nicht unbedingt die Ca ^{2 +-Signal} in einzelnen Zellen zu melden. In den letzten Jahren genetisch kodierte Fluoreszenzprotein (FP) basierenden Ca ^{2 +-Indikatoren,} wie gelb Cameleon (YCS) ¹² und ¹³ CASEs12 verwendet worden, um Ca ^{2 +} studieren Signalisierung mit hoher Auflösung subzellulärer. Ycs sind Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET) basierenden Ca ^{2 +-Indikatoren,} CFP und YFP-Varianten enthalten, durch die Ca ^{2 +} gebunden bindende Protein Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Calmodulin eine Konformationsänderung wie sie Ca ^{2 +} bindet, wodurch bewirkt CFP und YFP näher zusammen, was zu einem erhöhten Energie-Transfer (FRET verstärkt). Die FRET-Level über die Zeit, in etwa dem Verhältnis der an GFP YFP Signalintensitäten berechnet, spiegelt die intrazelluläre Ca ^{2 +} Dynamik. YC mehrere Versionen in Pflanzen verwendet worden. YC3.6 war tin das Cytosol ^{14,15, 16} Kern, Mitochondrien ¹⁷ und ¹⁸ Plasmamembran und YC4.6 und D4ER argeted wurden in die Notaufnahme ^15,19 gezielte und D3cpv wurde den Peroxisomen ²⁰ ausgerichtet. Transgene Pflanzen, die YCS ermöglichen die Live-Cell-Imaging von Ca2 ⁺ Dynamik in verschiedenen zellulären Kompartimenten verschiedener Zelltypen. Fällen (vermutlich Ca lcium se nsor) sind Einzel zirkular permutierten fluoreszierende Proteine ​​(cpFPs) beherbergen eine Calmodulin und Calmodulin-Bindungspeptid M13. Nach der Bindung an Ca ^{2 +,} Koffer unterziehen Konformationsänderungen, die zu einer Erhöhung der Fluoreszenzintensität. Die Korrelation zwischen Fluoreszenzantwort der Fall und Ca ^{2 +-Konzentration} ermöglicht die intrazelluläre Ca2 ⁺ Dynamik quantitativ gemessen werden. Die Case12 Variante hat 12-fach erhöht Fluoreszenz in den Ca ^{2 +} -gesättigtem Formen. N. benthiminana Pflanzen vorübergehend ausdrEssing Case12 oder Arabidopsis-Pflanzen stabil exprimieren Fall 12 wurden verwendet, um Ca2 ^{+-Signalisierung} in der Verteidigung und abiotische Stress ^4,21 studieren. Asynchrone räumliche und zeitliche Ca2 ⁺ Oszillationen in Zellen, die auf Pathogenbefall oder Austrocknung Stress haben mit Case12 basierend Ca ^{2 +-Bildgebung} offenbart worden.

Hier präsentieren wir detaillierte Anweisungen für Aequorin Lumineszenz-Bildgebung von Gewebe-und Reize spezifischen Ca2 ⁺ Dynamik in Arabidopsis-Keimlinge, und für die konfokale Bildgebung von zytosolischen und Kern Ca ^{2 +} Dynamik in Arabidopsis Wurzelzellen, die Fall 12. Lumineszenz-Bildgebung von FAS äußern könnten, die den Stress-induzierten Ca2 ⁺ Dynamik in ganzen Pflanzen oder Gewebe hier nicht beschrieben zu analysieren oder mutagenisierten Arabidopsis Pflanzenpopulationen nach Mutanten mit veränderten Stress induziert Ca2 ^+-Signale zu screenen. Die Lebendzell Ca2 ⁺ Imaging-Setup könnte angepasst Ca analysieren2 + Dynamik innerhalb verschiedener subcelluar Kammern oder in verschiedenen Zelltypen mit anderen Ca ^{2 +-Indikatoren.}

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Protokoll

1. Aequorin Based Ca2 ^{+-Imaging-System} Mit der FAS

1. Bereiten Pflanzgut für Lumineszenz-Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen, Aequorin mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton-100. Säen die Samen steril auf einer quadratischen Platte (10 x 10 cm im Quadrat Petrischale mit Gitter,) mit voller Kraft MS (Murashige und Skoog Basalsalzmischung), 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage (1A).
2. Übertragen Sie die Sämlinge auf einen Film. Ein Klebefilm (1B) auf der Oberseite der 7-10 Tage alten Sämlinge wachsen auf der Platte. Schieben Sie die Folie mit der Hand, um sicherzustellen, dass Keimlinge auf den Film (1C) einzuhalten. Schälen die Folie vorsichtig, so dass die Sämlinge bleiben an der Folie haften (1D und 1E)
3. Bebrüten die Sämlinge mit Cofaktor. Legen Sie die einedhered Sämlinge auf den Platz Platte (10 x 10 cm) mit 15 ml 2 pg / ml h-CTZ (Coelenterazins) in Wasser. Die Sämlinge bei Raumtemperatur inkubiert für 4 h bis über Nacht (1F).
4. Bereiten Sie sich für Lumineszenz-Bildgebung. Nehmen Sie den Film aus der h-CTZ Lösung und schneiden Sie es in der Mitte und bilden zwei Stücke. Legen Sie jedes Stück Film mit Jungpflanzen stehen in zwei verschiedenen Platten. Lassen Sie die Platten im Dunkeln für 5 min.
5. Erwerben Lumineszenz Bilder. Im Dunkeln, legen die beiden Platten nebeneinander auf der Bühne der Lumineszenz-Abbildungssystem (Figur 1G). Erwerben Bilder sofort nach Zugabe von 20 ml Lösung von Stimuli an die Platten gleichzeitig.
6. Analysieren Lumineszenz Bilder. Wählen Sie die gleichen Anzeigebereich für alle Lumineszenz Bilder. Beschneiden die Region of Interest (ROI) und erzeugen die Bilder als JPEG-Dateien (Abbildung 2a). Alternativ exportieren Sie die Bilder als SPE-Format-Dateien und importieren Sie sie in dieImageJ Bildanalyse-Software. Set-Messungen für die Berechnung der mittleren Grauwert der ROI. Wählen Sie die gleiche Größe der ROI-Bereich und messen die mittlere Grau und Darstellung von Daten als Balkendiagramme (Abbildung 2B).

2. Live Cell Imaging konfokale Ca ^{2 +}

1. Bereiten Setzlinge für die konfokale Bildgebung. Sterilisieren Samen von Arabidopsis-Pflanzen case12 ausdrücken mit 10% Bleichlösung, die 0,01% Triton. Aussaat der Samen auf einem sterilen Platte mit Vollkraft MS-Salze, 1% Saccharose und 1,2% Agar. Ort Platten vertikal in einer Wachstumskammer nach einer Schichtung bei 4 ° C für 2 Tage.
2. Setup Imaging Chambers
   1. Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Rutsche und Deckglas (Raum A). Legen Sie ein Stück Watte Wasser eingeweicht, auf der Mitte der Folie. Dann Transfer ein oder zwei 5 Tage alten Keimlingen von der Platte auf die Oberseite des Wasser eingeweicht Watte. Halten Sie kleine Stücke von Ton zu jeder Ecke eines Deckglases, eind Platz Deckglas auf der Oberseite der Setzlinge, um eine Lücke (Kammer) zwischen dem Deckglas und Objektträger (3A, links) zu erstellen. Das eine Ende des Polyethylenschlauch (0,58 mm Durchmesser) auf eine 1 ml-Spritze und das andere Ende des Rohrs unmittelbar angrenzend an die Kammer. Halten Sie den Schlauch mit Klebeband (3A, rechts).
   2. Montieren Sie eine Imaging-Kammer mit einer Plexiglaskammer (Chamber B).
      1. Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett rund zwei Polyethylen-Rohre (0,58 mm Durchmesser), und drücken Sie die beschichteten Rohre in die Kanäle auf jeder Seite der Plexiglaskammer (3B links). Verteilen Sie eine dünne Schicht Silikonfett auf die Oberfläche der Kammer, dass das Rohr Nuten enthält und drücken Sie eine Deckglas in das Fett auf der einen Seite der Kammeröffnung (ausgeschnitten) zu versiegeln.
      2. Übertragen einer 5 Tage alten Keimling von der Platte in die Kammer und setzen Sie ein Stück Watte mit Wasser getränkt auf der Oberseite of des Keimlings. Verbreiten Silikonfett auf die andere Oberfläche der Kammer, und drücken Sie eine andere Deckglas zu versiegeln. Verbinden des Endes eines der Rohre an eine 1 ml Spritze. Lassen Sie das Ende der anderen Röhre offen (3B rechts).
   3. Bereiten Sie eine Imaging-Kammer mit einem Kammerdeckglas (Kammer C). Sterilisieren Kammerdeckglas mit 70% Ethanol und lassen Sie es auf der Motorhaube bis trocken. 0,6 ml oder 0,2 ml Vollkraft MS-Medium mit 1% Saccharose und 0,5% Phytagel in jede Vertiefung einer 2-Kammer oder auch ein 8-Well-Kammer (3C rechts) auf. Sterilisieren Samen und säen die Samen direkt in einem Kammerdeckglas, das eine dünne Schicht klares Gel und lassen Sie sie vertikal für 5 Tage (Abbildung 3C) wachsen.
3. Erwerben Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop. Um Stress Reize, wie Salz, Kälte oder Peroxid gelten, langsam injizieren etwa 200 ul von 150 mM NaCl, Eis-cold Wasser oder 1 mM H ₂ O _2-Lösung in die Kammer (Kammer A oder B) kurz vor der Aufnahme von Bildern oder sanft hinzufügen 500 ul oder 100 ul der Reiz Lösung für die Vertiefung einer 2-oder 8-Well-Kammer-bzw. . Erfassen von Bildern unmittelbar nach der Anwendung des Stimulus-Lösung unter Verwendung eines invertierten Nikon A1R konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit einem 20x Wasserimmersionsobjektiv (numerische Apertur 0.75). Sammeln einer Zeitserie von Bildern bei 4 sec Intervallen mit Anregungs-und Emissionswellenlängen von 488 nm und 500 bis 550 nm und bei einer Pixelauflösung von 512 x 512.
4. Bildanalyse
   Mit Nikon-Elemente wurden ROIs um jede Zelle (oder Fläche) von Interesse gezogen. Gesamtintensität innerhalb jedes ROI wurde im Laufe der Zeit über das Dialogfeld Zeitmessung (ImageJ stattdessen verwendet werden könnten) gemessen. Gesamtintensität Messungen wurden exportiert und in Datagraph verarbeitet. Ca ^{2 +} Spike Amplitude wurde als Spitzenintensität minus Ruhe Intensität, Dauer, wie th definierte Zeit zwischen Initiierung und Abschluss einer Spitze, und Zeit als das Zeitintervall zwischen benachbarten Dorn Spitzen von zwei Spikes. t-test wurde verwendet, um die Mittel zu vergleichen.

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Ergebnisse

Mannit, NaCl und H ₂ O ₂ wurden als Stellvertreter für die Dehydratisierung, Salz und oxidativer Stress Stimuli verwendet wurden. Um zu überprüfen, ob die Schwermetallionen Cu ^{2 +} Synergie mit jeder dieser drei Spannungsreize, verglichen wir die Ca2 ⁺ Antwort auf jeden Stimuli in Gegenwart oder Abwesenheit von Cu ^{2 +.} Wie in 2 gezeigt, zeigte FAS Lumineszenzbildgebung dass Arabidoposis Sämlinge zu Dehydrierung, Salz und oxidativen Stress reagier...

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Diskussion

Wir haben ein FAS-System zur Aufzeichnung der räumlichen-zeitlichen Ca2 ⁺ Antwort von Arabidopsis Keimlingen nachgewiesen. Diese FAS Ca ^{2 +-Aufzeichnungssystem} ist eine einfache, empfindliche und stabile Ansatz zur Messung Ca2 ⁺ Dynamik durch verschiedene Stimuli neben den abiotischen Stressreize, die hier vorgestellt werden ausgelöst, angepasst werden kann. Mit diesem System können wir einfach vergleichen gewebespezifische Reize oder räumlich-zeitliche Dynamik Ca ^{2 +} in d...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm x 10 cm square Petri dish	VWR	60872-310
Adhesive film	VWR	60941-062
Polyethylene tubing	PerkinElmer	9908265
1 ml syringe	VWR	53548-000
Silicone grease	Beckman	335148
2-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155379
8-well chambered cover glass	Nalge Nunc international	155409
Luminescence imaging system	Princeton Instruments	N/A
Inverted confocal laser-scanning microscope	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon A1R
Imaging software	Nikon Instruments Inc.	N/A	Nikon Elements
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 is the newest version
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
All purpose bleach	Any local store	N/A
Triton X-100	Fisher	BP151500
MS salt	Phytotechnology Labs	M524-50L
Sucrose	VWR	BDH8029-12KG
Agar	Sigma	A1296-5KG
Phytagel	Sigma	P8169-1KG