حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي في الثديية الدهون وسادة من الفئران لدراسة نمو الأورام.

Summary

السرطان مرض معقد يتأثر الأنسجة المحيطة للورم، وكذلك المؤيد المحلية والمضادة للالتهابات وسطاء. لذلك، ونماذج حقن المتعامدة التغاير، بدلا من نماذج تحت الجلد قد تكون مفيدة لدراسة تطور سرطان بطريقة يحاكي أفضل علم الأمراض البشرية.

Abstract

يمكن دراسة نمو سرطان الثدي في الفئران باستخدام مجموعة كبيرة من النماذج. التلاعب الجيني للخلايا سرطان الثدي يمكن أن توفر نظرة ثاقبة وظائف البروتينات المشاركة في التقدم أنكجنيك أو مساعدة لاكتشاف المكثفات الورم جديدة. وبالإضافة إلى ذلك، حقن الخلايا السرطانية في الفئران مع الأنماط الجينية المختلفة قد توفير فهم أفضل لأهمية المقصورة اللحمية. قد يكون العديد من النماذج مفيدة للتحقيق في جوانب معينة من تطور المرض ولكن لا ألخص عملية السرطانية بأكملها. في المقابل، خلايا سرطان الثدي engraftment إلى لوحة الدهون الثديية من الفئران أفضل يلخص موقع للمرض وجود مقصورة انسجة سليمة وبالتالي يحاكي أفضل مرض سرطاني البشري. في هذه المقالة، نحن تصف كيفية زرع خلايا سرطان الثدي في الفئران orthotopically وشرح كيفية جمع الأنسجة لتحليل: 14px؛ خط الطول: 28px؛ "> ورم الوسط والانبثاث إلى أعضاء بعيدة عن طريق هذا النموذج، العديد من الجوانب (النمو، والأوعية الدموية، والانبثاث) من السرطان يمكن تحقيق ذلك ببساطة عن طريق توفير البيئة المناسبة لخلايا الورم في النمو.

Introduction

السرطان مرض معقد جدا التي كانت تخضع لدراسات لأكثر من قرون. سرطان الثدي هو نوع السرطان الأكثر شيوعا. يحدث في الغالب في الإناث ولكن قد يحدث أيضا بشكل متقطع في الذكور ^27. وينجم هذا المرض أساسا عن فقدان آلية السيطرة انقسام الخلايا الحكم والذي بدوره يؤدي إلى نمو لا حصر له من الخلايا في الجسم. يمكن أن يكون سبب هذه الأعطال من قبل عدة آليات: أولا، الخلايا السليمة تحتاج إشارات نمو من الخلايا المحيطة بها من أجل تتكاثر الخلايا السرطانية في حين تجعل عوامل النمو الخاصة بها وتزيد من التعبير عن مستقبلات عوامل النمو وبالتالي الحصول على أعلى معدل التكاثري ^1؛ الثانية، الخلايا السرطانية هي أقل عرضة للإشارات مكافحة التكاثري ^8؛ ثالثا، لتحقيق التوازن في عدد الخلايا في مطلوب أيضا وفاة خلية من خلايا الجسم. ومع ذلك، الخلايا السرطانية الهروب من موت الخلايا المبرمج، وصفته موت الخلايا المبرمج ^14؛ الرابع، وخلايا تلتزم مصفوفات خارج الخليةمن أجل البقاء على قيد الحياة ولكن الخلايا السرطانية يمكن أن تنمو من دون الحاجة إلى التعلق وتظهر مقاومة anoikis ^19. الخامس وتفعيل التيلوميراز تلتف تقصير التيلومير ويمنع الشيخوخة تنسخي ^21؛ أخيرا وليس آخرا، تخطي مراقبة الجودة DNA التالية النتائج الانقسام في المحتوى الجيني تغير ^15،16. من أجل تحديد الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم التي تلعب دورا في هذا الانتشار المحررة من القيود التنظيمية، والتجارب نمو الورم في الفئران هي الحاسمة.

نمو الورم الرئيسي عموما ليست السبب الرئيسي للوفاة. هجرة الخلايا السرطانية من الموقع الأساسي إلى موقع ثانوي، يطلق ورم خبيث، هو السبب الرئيسي للوفاة في معظم مرضى السرطان ^22. ورم خبيث ينطوي غزو الخلايا السرطانية، دخول الوعاء، والسفر من خلال الدورة الدموية، وتجنب المناعة الهجوم، التسرب والنمو في الموقع الثانوي. الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) هو عملية أساسية فيورم خبيث وينطوي على التبديل في ملامح التعبير الجيني العائد الخلايا مع ارتفاع الحركة والغازية، والتي هي بمستلزمات للخلية نقيلي ^12. ولما كانت عملية السرطانية هي حصيلة مجموعة من الإجراءات المختلفة، بما في ذلك التفاعلات المتبادلة بين الخلايا السرطانية والخلايا اللحمية والخلايا المؤيدة والمضادة للالتهابات، وهو نهج في المختبر بالسرطان في كثير من الأحيان لا توفر رؤية كاملة في عملية السرطانية. وبالمثل، والعلاجات المضادة للسرطان تؤثر على الأوعية الدموية السرطانية يمكن في كثير من الأحيان لا يتم دراستها في المختبر، وبالتالي فإن استخدام الجسم الحي في النهج أمر لا مفر منه.

لدراسة تطور سرطان الثدي، وقد وضعت الطرق التجريبية المختلفة. النموذج الأكثر استخداما هو الحقن تحت الجلد من خلايا سرطان الثدي في الفئران ^5. في هذا الإعداد التجريبية، يجوز للمحقق تقديم مجموعة واسعة من التعديلات على خط خلية من خيار في المختبر (أيupregulation، downregulation من البروتينات) وحقن الخلايا تحت الجلد. على الرغم من أن هذه الطريقة هي واضحة وعملية حقن بسيطة دون الحاجة إلى إجراء عمليات جراحية على الفئران، الموقع الذي يتم حقن الورم لا يمثل البيئة الورم الثديية المحلية وغياب هذه البيئة قد يؤدي إلى الإصابة بسرطان الثدي الذي يختلف عن تلك التي لوحظت في علم الأمراض البشرية. ثانيا، تستخدم فئران معدلة وراثيا في كثير من الأحيان كأداة في الجسم الحي لدراسة تطور سرطان الثدي. في هذا النموذج، هو الدافع وراء الجين الورمي (أي PyMT، نوي) التعبير من قبل المروج محدد الأنسجة الثديية مما أدى إلى تشكيل عفوية ورم الثدي الصورة. هذا الإعداد التجريبية مفيد لدراسة جوانب العلاج من هذا المرض عن طريق حقن المخدرات أو الأجسام المضادة أثناء التحقق من حجم الورم في الوقت المناسب ^3. ومع ذلك، تربية هذه الفئران مع سلالات الفئران الأخرى ناقصة أو تحور في الجينات في المصالح ويمكن أيضا إعطاء الإضافيةights في دور البروتينات المختلفة في نمو الورم الثدي ^24. الجانب السلبي من هذا النموذج هو أنه عرضة للتفاوت في حجم الورم والعدد. وعلاوة على ذلك، فإن مستوى التعبير التحوير يعتمد على موقع التكامل في الجينوم، ويمكن أن تتغير من سلالة الماوس واحد إلى ⁴ آخر. في هذا النموذج، والتعبير عن التحوير يمكن أن يتحقق من قبل جميع الخلايا الظهارية مع الأصل بينما في الأمراض التي تصيب البشر، فقط جزء من السكان من الخلايا التعبير عن الجين الورمي أو downregulate مستويات الكابتة للورم ^26. لدراسة ورم خبيث، ويمكن أيضا أن حقن خلايا سرطان الثدي عن طريق الوريد (نموذج يسمى ورم خبيث تجريبي) ^25. ومع ذلك، فإن هذا النهج يلخص فقط عملية المنتشر جزئيا. انها تلتف شرط للخلايا السرطانية لغزو وintravasate، ويبدأ من النقطة التي الخلايا السرطانية هي بسهولة الموجودة في التداول.

في عملنا، ونحن استخدام حقن مثليأيون نموذج لدراسة تورط الجينات في المصالح في تطور سرطان الثدي ^13. نحن بإفراط عن البروتين في خلايا سرطان الثدي البشرية وضخها إلى لوحة الدهون الثديية من NOD / غاما SCID (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران. هذه الطريقة هو مفيد من نواح عديدة: فهو يسمح التغيرات الجينية السريعة جدا ومتنوعة في خط الخلية حقن، فإنه يغطي كامل عملية تطور سرطان الثدي من نمو الورم الرئيسي لورم خبيث في المواقع ذات الصلة مرضي، وأنه يوفر أيضا نموذج تجريبي جيد لدراسة تأثير العلاجات العلاجية في مراحل مبكرة أو متأخرة من المرض. وبالإضافة إلى ذلك، وذلك باستخدام هذا النموذج يمكن لأحد أن التحقيق في دور انسجة مقابل السرطان البروتينات المشتقة من خلية في تطور المرض باستخدام الفئران المعدلة وراثيا أو الخلايا. وعلى الرغم من الحقن تحت الجلد هي أسهل لأداء، ونماذج مثلي تؤدي إلى نشوء الخلايا السرطانية أكثر السكان مكون للأورام وأكثر النقيلي. وهكذا، والنتائج التي تم الحصول عليها عن طريق الحقن تحت الجلدالصورة قد تكون إما كاذبة أو سلبي إيجابية كاذبة ^6،17 تشجيع استخدام نماذج مثلي لدراسة نمو الورم.

Protocol

وتمت الموافقة على التجارب على الحيوانات من قبل لجنة الرفق بالحيوان من المركز الطبي لجامعة لايدن (LUMC).

1. إعداد الخلايا، أدوات والفئران

1. وقبل يوم من العملية، ويحلق في NOD / SCID جاما (مجموعة موردي المواد النووية) الفئران من الحلمة الرابعة إلى خط الوسط ووزن الفئران للتحقق من أن جميع الفئران لها أوزان مقاربا.
2. الأوتوكلاف مقص، واثنين من ملاقط واثنين من ملقط البعوض على التوالي (الشكل 1A).
3. في يوم العملية، وغسل غدية الثدي الإنسان (MDA-MB-231) الخلايا التي سوف يتم حقنه مرة واحدة مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، ودرجة الحموضة 7.4 ويعرض للتريبسين الخلايا. إخماد التربسين وذلك بإضافة 10 مل تحتوي على المصل DMEM وسائل الاعلام على أعلى من الخلايا. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 1،200 دورة في الدقيقة لمدة 7 دقائق على RT لإزالة المصل عن طريق إعادة التعليق الخلايا إما في برنامج تلفزيوني أو في وسائل الإعلام دون المصل. أجهزة الطرد المركزي لهم مرة أخرى لإزالة آثار مصل تماما. resuspend الخلايا في برنامج تلفزيوني أووسائل الاعلام.
4. عدد الخلايا مع عدادة الكريات وحساب كمية من الخلايا. استخدام 500000 خلية / الماوس في عدم أكثر من 150 ميكرولتر. اختياري لبرنامج تلفزيوني أو وسائل الإعلام، resuspend الخلايا في matrigel.
   ملاحظة: تحديد كمية الخلايا اعتمادا على نوع من الخلايا المستخدمة.
5. وضع الخلايا في أنابيب microcentrifuge معقمة والاحتفاظ بها على الجليد.
6. ملء واحدة 50 مل مخروطي أنبوب الطرد المركزي مع 35 مل من PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 وآخر 50ML المخروطية أنبوب الطرد المركزي مع 70٪ من الإيثانول. نقع قطعة قطن في كل أنبوب.

2. حقن مثلي

1. إجراء الجراحة في غطاء العقيمة للحفاظ على جو معقم. تخدير الماوس عن طريق الحقن تحت الجلد Xylazin / الكيتامين مزيج بجرعة 10MG / كغ، و 100 ملغم / كغم من وزن الجسم على التوالي. إصلاح الماوس على وسادة التدفئة. تأكيد نجاح التخدير بسبب عدم وجود رد فعل حتى أخمص القدمين قرصة.
   ملاحظة: إذا كان أحد ليست مألوفة جدا مع العمليات الجراحية وجراحة قد يستغرق وقتا أطول. رتبالتخدير جرعة وفقا لذلك.
2. تطبيق مرهم للعين على العيون من الفئران، لمنع العينين من الجفاف.
3. تنظيف المنطقة حلق باستخدام قطعة من القطن مغموسة إلى إيثانول أعدت في الخطوة 1.6. بالتناوب الدعك باستخدام بتدين والكحول ثلاث مرات بطريقة دائرية الدورية بعيدا عن موقع شق المخطط يجب أن يتم تنفيذ. بدلا من ذلك، استخدم حامل الأيون كمطهر.
4. إجراء شق صغير بين الحلمة الرابعة وخط الوسط مع مقص وجعل جيب عن طريق إدخال مسحة القطن مبللة PBS الرقم الهيدروجيني 7.4.
5. استخدام الملقط لفضح لوحة الدهون الثديية. مراقبة لوحة الدهون التي كتبها لونه أبيض.
6. ضغط لوحة الدهون مع منتاش آخرين من قاعدتها. من خلال ذلك، كشف تماما لوحة الدهون (الشكل 1B) لإجراء الحقن بسهولة.
7. تجانس الخليط خلية pipetting صعودا وهبوطا. نضح بلطف 50 ميكرولتر من تعليق خلية في حقنة الأنسولين ويحقنلوحة الدهون الثديية من خلال عقد الإبرة أفقيا. تأكيد حقن ناجحة عن طريق التحقق من تورم لوحة الدهون.
8. الافراج عن لوحة الدهون بلطف.
9. خياطة شق باستخدام برنامج تشغيل الإبرة. جعل ثلاث رميات من خلال تحويل خياطة حول السائق الإبرة في اتجاه عقارب الساعة، عكس عقارب الساعة واتجاه عقارب الساعة. وينبغي أن تستخدم وهما عقدة في خياطة الجروح.
   ملاحظة: تأكد من أن عقدة ضيقة خلاف الفئران يمكن أن تفتح الغرز.
10. بعد الجراحة، وحقن مسكن، مثل temgesic في ،05-،1 ملغم / كغم من وزن الجسم، تحت الجلد من أجل تخفيف الألم.
11. لا تترك الحيوانات غير المراقب حتى الحصول على وعيه والحفاظ على رقود القصية. وضع كل الحيوانات في أقفاص مختلفة حتى يتم استردادها بالكامل.
12. للحفاظ على العقم، واستخدام أقفاص تعقيمها والمياه. تغيير أقفاص كل ثلاثة أيام للحفاظ على أجواء نظيفة.

3. حصاد أجهزة لتحليل

1. فييوم الحصاد، وبعد 8 أسابيع من زرع الخلايا، وملء 15 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية مع 3 مل من محلول بوان لكل الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، استخدام اثنين من 15 مل أنابيب مليئة 5 مل من محلول الفورمالين في الماوس.
2. تخدير الحيوانات عن طريق حقن Xylazin / الكيتامين، بجرعة 10 ملغ / كغ 100 ملغ / كغ من وزن الجسم تحت الجلد. الانتظار حتى يفقد الحيوان قرصة أخمص قدميه الانسحاب لا ارادي.
3. إصلاح الحيوان مع الإبر على قاعدة. جعل طويلة، الرأسي شق خط الوسط مع مقص. جعل اثنين من الشقوق الأفقية الحق دون الساق الأمامية وفوق الساق الخلفية. كشف الورم عن طريق تعلق الجلد إلى القاعدة. قياس حجم الورم باستخدام الفرجار.
4. فصل الورم من الجلد باستخدام المقص. التقط تجميد جزء من الورم في النيتروجين السائل لعزل الحمض النووي الريبي. وضع الجزء الآخر، في أنبوب الطرد المركزي المخروطية مليئة الفورمالين لأداء المناعية التالية تضمين البارافين.
5. بلطف اخراج الرئتين. ضعغادر الرئة إلى حل بوان. الحفاظ على الرئة في حل لمدة 3 أيام. مراقبة بؤر المنتشر سطحيا بشكل واضح للعين المجردة. اختياريا، ضع الرئة اليمنى في الفورمالين للتحقق من نقيلة مجهرية باستخدام haematoxylin ويوزين (H & E) تلطيخ.
   ملاحظة: على الرغم من ورم خبيث في الرئة لوحظ في كثير من الأحيان في سرطان الثدي، واحد قد ترغب أيضا في جمع العظام والكبد والدماغ والطحال لتحليل ورم خبيث. الخلايا في منطقة النقيلي هي أكثر كثافة ومختلفة شكليا، وبالتالي يمكن تمييزها بسهولة من أنسجة الرئة.
6. وبعد يوم الحصاد، ونضح الحل الفورمالين من 15 مل أنابيب واستبدال مع 70٪ من الإيثانول. تضمين الأنسجة في البارافين وإجراء الدراسات المناعية.
7. لتحليل الدم، وفتح تجويف الصدر مع مقص. سحب الدم 450 ميكرولتر من خلال ثقب في القلب. ضع عينة من الدم في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 50 ميكرولتر من 3.2٪ سيترات الصوديوم. بعد جمع الدم، وتدور عليه في 2،000 x ج لمدة 10 ميلن. تخزين عينات البلازما في -20 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
   ملاحظة: هناك عدة تقنيات جمع الدم الأخرى التي تستخدم عادة في الممارسة ²⁰ والتقنية التي تحتاج لاستخدامها يعتمد على الإعداد التجريبية واختيار العلماء. إذا لم يكن مطلوبا عينة من الدم، والموت ببطء الحيوان وفقا لبروتوكول الحيوان أو وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسة.

النتائج

ويستند التطبيق الناجح ل"نموذج سرطان الثدي مثلي" على حقن السليم من الخلايا في لوحة الدهون الثديية. أخطاء التجريبية مثل التلقيح غير دقيق من الخلايا أو تسرب قد يؤدي إلى اختلافات في حجم الورم أو حتى عدم وجود الورم الذي يؤدي إلى تشكيل هيكل أبحث مشابهة لمنصة الدهون ال?...

Discussion

حقن مثلي من خلايا سرطان الثدي هو نموذج قوي لدراسة جميع جوانب نمو السرطان. زرع هذه الخلايا في لوحة الدهون الثديية من الفئران يجب أن يتم تنفيذ بعناية من أجل منع التباين في نمو الورم. الأهم من ذلك، حقن نفس الكمية من الخلايا لكل فأر أمر بالغ الأهمية. للقيام بذلك، ينبغي للم?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9