Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы в молочной жировой ткани мышей для изучения роста опухоли.

Резюме

Рак является сложным заболеванием, на которое влияют ткани, окружающие опухоль, а также местные про- и противовоспалительных медиаторов. Таким образом, ортотропные модели инъекции, а не подкожной модели могут быть полезны для изучения прогрессирование рака таким образом, чтобы лучше имитирует патологии человека.

Аннотация

Рост рака молочной железы может быть изучена на мышах с использованием множество моделей. Генетические манипуляции раковых клеток молочной железы может дать ответ на функциях белков, участвующих в онкогенного прогрессии или помочь открыть новые супрессоры опухоли. Кроме того, потребители инъекционных раковые клетки мышам с разными генотипами может обеспечить лучшее понимание важности стромы отсека. Многие модели могут быть полезны для исследования некоторых аспектов прогрессирования заболевания, но не воспроизводят весь процесс раковую. В отличие от этого, клетки рака молочной железы приживления в молочной жировой ткани мышей более повторяет расположение заболевания и наличии надлежащего стромы отсека и, следовательно, лучше имитирует раковые заболевания человек. В этой статье мы расскажем, как имплантировать клетки рака молочной железы мышам ортотопически и объяснить, как собрать тканей для анализа: 14px; высота строки:. 28px; "> опухоли среда и метастазы в отдаленные органы Используя эту модель, многие аспекты (рост, ангиогенез, и метастазирование рака) может быть исследована путем простого обеспечения надлежащих условий для опухолевых клеток расти.

Введение

Рак является очень сложное заболевание, стала предметом исследований на протяжении веков. Рак молочной железы является наиболее распространенным типом рака; это происходит в основном у женщин, но могут спорадически возникать у мужчин ^27. Заболевание в основном вызвано потерей механизма управления разделением управляющих клеток, который в свою очередь приводит к бесконечному росту клеток в организме. Эти неисправности могут быть вызваны несколькими механизмами: во-первых, здоровые клетки должны сигналы роста из окружающих клеток для того, чтобы размножаться, тогда как раковые клетки принимать свои собственные факторы роста и увеличение экспрессии рецепторов факторов роста и таким образом получают более высокую скорость пролиферации ^1; Во-вторых, раковые клетки являются менее восприимчивыми к антипролиферативным сигналам ^8; в-третьих, чтобы сбалансировать количество клеток в организме гибели клеток также требуется; Однако раковые клетки уйти от запрограммированной клеточной смерти, называется апоптоз ^14; В-четвертых, клетки придерживаться внеклеточного матриксадля того, чтобы выжить, но опухолевые клетки могут расти без необходимости прикрепления и показывают устойчивость к anoikis ^19; В-пятых, активизация теломеразы обходит укорочение теломер и предотвращает репликативную старение ^21; Последнее, но не менее важное, пропуская контроля качества ДНК следующие результаты митоза в измененной генетической содержания ^15,16. Для того, чтобы определить онкогенов или опухолевых супрессоров, которые играют роль в этом нерегулируемом оружия, эксперименты роста опухоли у мышей имеют решающее значение.

Первичной опухоли, как правило, не главная причина смерти. Миграция раковых клеток из первичного сайта на дополнительном сайте называется метастазирование, является ведущей причиной смерти у большинства пациентов ²² раком. Метастазы влечет за собой вторжение опухолевых клеток, intravasation, путешествуя через циркуляцию, избегая иммунной атаки, кровоизлияние и рост на вторичном узле. Эпителиальные к мезенхимальных перехода (EMT) является ключевым процессом вметастазы и включает в себя переключатель профилей экспрессии генов, дающую клетки с более высокой подвижности и инвазии, которые являются предпосылками для метастазирования клетки ^12. Как раковая процесс результате сочетания различных мероприятий, в том числе взаимных взаимодействий между раковыми клетками, стромальных клеток про- и противовоспалительных клеток, подход в пробирке с раком часто не обеспечивает в полном объеме получить раковой процесса. Аналогично, противораковые процедуры, воздействующие на сосудистую опухоли часто не изучены в пробирке, таким образом, использование в естественных подходов неизбежно.

Для изучения прогрессирования рака молочной железы, различные экспериментальные методы были разработаны. Наиболее широко используется модель подкожной инъекции клеток рака молочной железы мышам ^5. В этой экспериментальной установке, исследователь может ввести широкий спектр изменений в клеточной линии выбора в пробирке (т.е.регуляция, подавление белков) и вводят в клетки под кожу. Хотя этот метод прост и процесс инъекции проста без необходимости выполнять операцию на мышах, веб-сайт, на котором опухоль вводили не представляет местное молочной среды опухоли и отсутствие этой среде может привести к развитию рака молочной железы, который отличается от наблюдаемого в патологии человека. Во-вторых, с помощью генной инженерии мышей часто используются в качестве инструмента в естественных условиях для изучения прогрессирования рака молочной железы. В этой модели, онкоген (т.е. PyMT, Neu) выражение приводится в ткани молочной железы специфического промотора, ведущий к образованию спонтанного опухоли молочной железы с. Это экспериментальная установка полезно изучить лечения аспект заболевания инъекционных наркотиков или антитела при проверке размеров опухоли во времени ^3. Тем не менее, разведение этих мышей с другими штаммами мыши с дефицитом или мутированных в интересующего гена также может дать модулиЗагорается в роли различных белков в рост опухоли молочной железы ^24. Недостатком этой модели является то, что он склонен к изменению размера и числа опухолей. Кроме того, уровень экспрессии трансгена в зависимости от сайта интеграции в геноме, и может изменяться от одного штамма мыши к другому ^4. В этой модели, экспрессию трансгена может быть достигнуто за счет всех клеток эпителиального происхождения с, тогда как в человеческих болезней, только субпопуляции клеток экспрессируют онкоген или подавляют уровни опухолевых супрессоров ^26. Для изучения метастазов, клетки рака молочной железы, также могут быть введены внутривенно (модель называется Экспериментальные метастазы) ^25. Тем не менее, этот подход только повторяет метастатического процесса частично; она обходит потребность в опухолевые клетки к вторжению и intravasate, и начинается от точки, в которой опухолевые клетки легко присутствует в кровотоке.

В нашей работе мы используем ортотопическая инъецироватьИонная модель для изучения участия генов, представляющих интерес в прогрессии рака молочной железы ^13. Мы сверхэкспрессии белка в человеческих клетках рака молочной железы и ввести их в молочной жировой слой NOD / SCID гамма (NSG) мышей. Этот способ является предпочтительным во многих отношениях: это позволяет очень быстрые и разнообразные генетические изменения в впрыскиваемого клеточной линии, она охватывает весь процесс прогрессирования рака молочной железы от первичного опухолевого роста на метастазов в патологически соответствующих сайтов, а также обеспечивает хорошую экспериментальную модель при изучении влияния лечебных процедур на ранних или поздних стадиях заболевания. Кроме того, с помощью этой модели можно исследовать роль стромы по сравнению с клеточными полученных белков рака в прогрессирование болезни с использованием генетически модифицированных мышей или клетки. Хотя подкожные инъекции легче выполнить, ортотопической модели приводят к более онкогенных и более метастатического рака клеточной популяции. Таким образом, результаты, полученные с помощью подкожной инъекциис может быть либо ложно-отрицательный или ложно-положительных ^6,17 поощрения использования ортотопических моделей для изучения роста опухоли.

протокол

Эксперименты на животных были утверждены по животноводству, комитета Медицинского центра Лейденского университета (LUMC).

1. Подготовка клетки, инструменты и мышей

1. День до операции, брить NOD / SCID гамма (NSG) Мышь с четвертого соска к средней линии и весят мышей, чтобы убедиться, что все мыши имеют примерно сопоставимые веса.
2. Автоклав ножницами, два пинцета и два прямых комаров щипцы (рис 1а).
3. В день операции, мыть аденокарциномы молочной железы человека (MDA-MB-231) клеток, которые будут вводили один раз забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), рН 7,4, и Trypsinize клетки. Гасят трипсин, добавив 10 мл сыворотки, содержащей DMEM носитель поверх клеток. Центрифуга клеток при 1200 оборотов в минуту в течение 7 мин при комнатной температуре, чтобы удалить сыворотку путем ресуспендирования клеток либо в PBS, либо в средствах массовой информации без сыворотки. Центрифуга их снова, чтобы удалить следы сыворотки полностью. Ресуспендируют клеток в PBS илиСМИ.
4. Количество клеток с помощью гемоцитометра и рассчитать количество клеток. Использование 500000 клеток / мышь не более чем 150 мкл. Дополнительно к PBS или СМИ, ресуспендирования клеток в матригеле.
   Примечание: Определить количество клеток в зависимости от типа клеток, используемых.
5. Поместите клетки в стерильные микропробирок и держать их на льду.
6. Заполните один 50 мл коническую центрифужную пробирку с 35 мл PBS рН 7,4 и еще 50 мл коническую центрифужную пробирку с 70% -ным этанолом. Замочите ватные тампоны в каждую пробирку.

2. Ортотопическая впрыска

1. Выполните операцию в стерильных капот, чтобы поддерживать стерильную атмосферу. Обезболить мыши, подкожно инъекционных Xylazin / кетамин смеси в дозе 10 мг / кг, 100 мг / кг массы тела соответственно. Закрепите мыши на грелку. Подтвердите успех анестезии из-за отсутствия реакции до пят крайнем случае.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если кто-то не очень знакомы с хирургическими процедурами, операция может занять больше времени. УстраиватьАнестезия дозы соответственно.
2. Применить глазной мази на глазах у мышей, чтобы предотвратить сухость глаз.
3. Очистите выбритый участок с помощью ватным тампоном, смоченным в этаноле, полученного на стадии 1.6. Переменный скрабы, используя BETADINE и алкоголь три раза по кругу вращающейся от запланированного разреза должны быть выполнены. Кроме того, использование ионофор в качестве дезинфицирующего средства.
4. Сделайте небольшой надрез между четвертым соска и средней линии с ножницами и сделать карман, вставив ватный тампон, смоченный PBS рН 7,4.
5. Используйте пинцет, чтобы разоблачить молочной жировой ткани. Соблюдайте жировой ткани по его белым цветом.
6. Сожмите жировой ткани с другой пинцет от его основания; Делая это, полностью раскрыть жировой ткани (рис 1B) для выполнения инъекций легко.
7. Перемешать смесь клеток с помощью пипетки вверх и вниз. Осторожно аспирации 50 мкл клеточной суспензии в инсулиновый шприц и впрыснуть вмолочной жировой ткани, держа иголку горизонтально. Подтверждение успешного инъекции путем проверки набухания жировой ткани.
8. Отпустите жировой ткани нежно.
9. Шовный разрез с помощью драйвера иглы. Сделайте три броска, поворачивая шов вокруг водителя иглы по часовой стрелке, против часовой стрелки и по часовой стрелке. Два узла в шва должны быть использованы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что узлы плотно в противном случае мыши могут открыть швы.
10. После операции вводят обезболивающее, такие как temgesic на 0,05-0,1 мг / кг массы тела, подкожно того, чтобы облегчить боль.
11. Не оставляйте животных без присмотра, пока они не получают сознание и поддерживать грудины отдохновение. Поместите все животные в разных клетках, пока они не будут полностью восстановлены.
12. Для поддержания стерильности, используйте автоклавированна клетки и воду. Измените клетки каждые три дня, чтобы сохранить атмосферу в чистоте.

3. извлечения органов для анализа

1. Вдень сбора, через 8 недель после имплантации клеток, заполнения 15 мл конические центрифужные пробирки с 3 мл раствора Буэна для каждой мыши. Кроме того, использование двух 15 мл пробирок, заполненных 5 мл раствора формалина на мышь.
2. Обезболить животных путем введения Xylazin / кетамин в дозе 10 мг / кг 100 мг / кг массы тела подкожно. Подождите, пока животное не теряет ног щепотку снятие рефлекс.
3. Fix животное с иглами на базу. Сделайте длинное, вертикальное срединный разрез с ножницами. Сделайте два горизонтальных разрезов прямо под передней ноге и над задней ноге. Expose опухоль, закрепив кожу к основанию. Измерение объема опухоли с помощью измерителя.
4. Отделить опухоль от кожи с помощью ножниц. Привязка заморозить часть опухоли в жидком азоте для выделения РНК. Поместите другой стороны, в коническую центрифужную пробирку, наполненную формалином для выполнения иммуногистохимии следующие парафин.
5. Аккуратно вынуть легкие. ПоместитеЛевое легкое в раствор Буэна. Держите легких в растворе в течение 3 дней. Соблюдайте поверхностное метастатических очагов четко невооруженным глазом. Дополнительно, место правого легкого в формалине, чтобы проверить микрометастазов с помощью гематоксилином и эозином (H & E) окрашиванием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя, легких метастазы наблюдаются часто при раке молочной железы, можно также хотите собрать кости, печень, мозг и селезенку проанализировать метастазы. Клетки в метастатической области плотнее и морфологически различны и, следовательно, может быть легко отличить от легочной ткани.
6. День после сбора урожая, аспирация раствора формалина из 15 мл пробирки и заменить 70% этанола. Код для вставки на ткани в парафин и выполнять иммуногистохимии исследований.
7. Для анализа крови, открывают грудную полость с помощью ножниц. Вывод 450 мкл крови с помощью пункции сердца. Поместите образец крови в микроцентрифужных пробирку, содержащую 50 мкл 3,2% цитрата натрия. После кровь собирают, вращать его в 2000 мкг в течение 10 мип. Хранить образцы плазмы при температуре от -20 ° С до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько другие методы сбора крови, обычно используемые в практике ²⁰ и метод, который необходимо использовать, зависит от экспериментальной установки и выбора ученого. Если образец крови не требуется, эвтаназии животных в соответствии с протоколом животного или согласно принципов учреждение.

Результаты

Успешное применение "модели ортотопическая рака груди» основана на правильной инъекции клеток в молочной жировой ткани. Экспериментальные ошибки, такие как неточной инокуляции клеток или утечки может привести к изменению размера опухоли или даже отсутствие опухоли, что приводит к...

Обсуждение

Ортотопическая инъекции клеток рака молочной железы является мощная модель для изучения всех аспектов роста рака. Имплантация этих клеток в жировой ткани молочной мышей должны быть тщательно выполнены для того, чтобы предотвратить изменение роста опухоли. Самое главное, инъекционны?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9