Inyección ortotópico de células de cáncer de mama en el Mamaria Fat Pad de ratones para estudiar el crecimiento del tumor.

Resumen

El cáncer es una enfermedad compleja que se ve influenciada por el tejido que rodea al tumor, así como pro- local y anti-inflamatorias mediadores. Por lo tanto, los modelos de inyección de ortotrópicos, en lugar de los modelos subcutáneos pueden ser útiles para estudiar la progresión del cáncer de una manera que imita mejor la patología humana.

Resumen

El crecimiento del cáncer de mama puede ser estudiado en ratones utilizando una gran cantidad de modelos. La manipulación genética de las células de cáncer de mama puede ayudar a comprender las funciones de las proteínas implicadas en la progresión oncogénica o ayuda a descubrir nuevos supresores tumorales. Además, la inyección de células de cáncer en ratones con diferentes genotipos podría proporcionar una mejor comprensión de la importancia del compartimiento del estroma. Muchos modelos pueden ser útiles para investigar ciertos aspectos de la progresión de la enfermedad, pero no recapitular todo el proceso canceroso. En contraste, las células de cáncer de mama injerto a la almohadilla de grasa mamaria de ratones mejores recapitula la localización de la enfermedad y la presencia del compartimiento del estroma apropiada y por lo tanto mejor imita enfermedad cancerosa humana. En este artículo, describimos cómo implantar las células del cáncer de mama en ratones ortotópicamente y explicar cómo recolectar tejidos para analizar la: 14px; line-height:. 28px; "> medio del tumor y la metástasis a órganos distantes uso de este modelo, muchos aspectos (crecimiento, la angiogénesis y la metástasis) de cáncer pueden ser investigados simplemente proporcionando un ambiente adecuado para las células tumorales crezcan.

Introducción

El cáncer es una enfermedad muy compleja que ha sido objeto de estudios por más siglos. El cáncer de mama es el tipo de cáncer más común; se produce predominantemente en las mujeres, pero puede también ocurrir esporádicamente en los hombres ^27. La enfermedad es causada principalmente por la pérdida de mecanismo de control de la división celular de gobierno que a su vez conduce a un crecimiento infinito de las células en el cuerpo. Estas disfunciones pueden ser causadas por varios mecanismos: primero, las células sanas necesitan señales de crecimiento de las células circundantes con el fin de proliferar mientras que las células de cáncer hacen sus propios factores de crecimiento y aumentan la expresión de los receptores del factor de crecimiento obteniendo así una tasa de proliferación superior ^1; segundo, las células cancerosas son menos susceptibles a las señales anti-proliferativos ^8; tercero, para equilibrar el número de células en también es necesaria la muerte de las células del cuerpo; Sin embargo, las células de cáncer de escape de la muerte celular programada, denominada apoptosis ^14; cuarto, las células se adhieren a matrices extracelularescon el fin de sobrevivir, pero las células tumorales pueden crecer sin la necesidad de unión y muestran resistencia a la anoikis ^19; quinto, la activación de la telomerasa evita el acortamiento de los telómeros y evita que la senescencia replicativa ^21; por último pero no menos importante, la omisión del control de calidad del ADN tras los resultados de la mitosis en el contenido genético alterado ^15,16. Con el fin de identificar los oncogenes o supresores tumorales que juegan un papel en esta proliferación desregulada, experimentos de crecimiento de tumor en ratones son cruciales.

El crecimiento primario del tumor generalmente no es la principal razón de la muerte. La migración de las células cancerosas desde el sitio primario a un sitio secundario, denominado metástasis, es la causa principal de muerte en la mayoría de los pacientes de cáncer ^22. Metástasis implica invasión de células tumorales, intravasación, viajando a través de la circulación, evitando inmune ataque, la extravasación y el crecimiento en el sitio secundario. Epitelial a mesenquimal (EMT) es un proceso clave enmetástasis e implica un cambio en los perfiles de expresión génica produciendo células con mayor movilidad y capacidad de invasión, que son requisitos previos para la célula de metástasis ^12. Como el proceso canceroso es la resultante de una combinación de diversas acciones, incluyendo las interacciones recíprocas entre las células cancerosas, las células del estroma y las células pro- y anti-inflamatorias, un enfoque in vitro de cáncer a menudo no proporciona completa información sobre el proceso canceroso. De manera similar, los tratamientos contra el cáncer que afectan a la vasculatura del tumor a menudo pueden no ser estudiados in vitro, por lo tanto el uso de enfoques in vivo es inevitable.

Para estudiar la progresión del cáncer de mama, se han desarrollado diferentes métodos experimentales. El modelo más ampliamente utilizado es la inyección subcutánea de células de cáncer de mama en ratones ^5. En esta configuración experimental, el investigador puede introducir una amplia gama de alteraciones a una línea celular de elección in vitro (es decir,upregulation, regulación a la baja de las proteínas) e inyectar las células debajo de la piel. Aunque este método es sencillo y el proceso de inyección es simple, sin necesidad de realizar la cirugía en los ratones, el sitio en el que se inyecta el tumor no representa el ambiente del tumor mamario local y la ausencia de este entorno puede resultar en el desarrollo del cáncer de mama que se difiere de la observada en patología humana. En segundo lugar, los ratones genéticamente modificados se utilizan frecuentemente como una herramienta in vivo para estudiar la progresión del cáncer de mama. En este modelo, el oncogén (es decir PYMT, Neu) la expresión es conducida por un promotor específico de tejido mamario que conduce a la formación espontánea de s tumor de mama. Esta configuración experimental es útil para estudiar el aspecto de tratamiento de la enfermedad mediante la inyección de drogas o anticuerpos mientras comprueba el tamaño del tumor en el tiempo ^3. Sin embargo, la cría de estos ratones con otras cepas de ratones deficientes o mutados en un gen de interés también podría dar insERECHOS en el papel de diferentes proteínas en el crecimiento del tumor de mama ^24. La desventaja de este modelo es que es propenso a la variación en el tamaño del tumor y el número. Por otra parte, el nivel de expresión del transgen depende del sitio de integración en el genoma y se puede cambiar de una cepa de ratón a otro ^4. En este modelo, la expresión del transgén se puede lograr por todas las células con origen epitelial mientras que en la enfermedad humana, sólo una subpoblación de células expresan el oncogén o regular a la baja los niveles supresores de tumores ^26. Para estudiar la metástasis, las células del cáncer de mama también se pueden inyectar por vía intravenosa (un modelo denomina metástasis experimental) ^25. Sin embargo, este enfoque sólo recapitula el proceso metastásico parcialmente; elude el requisito de las células tumorales para invadir y intravasate, y se inicia desde el punto en el que las células tumorales son fácilmente presente en la circulación.

En nuestro trabajo, utilizamos una inyección ortotópicoion modelo para estudiar la implicación de los genes de interés en la progresión del cáncer de mama ^13. Nos sobreexpresan la proteína en las células del cáncer de mama humano e inyectarlos en la almohadilla de grasa mamaria de ratones NOD / SCID gamma (NSG) ratones. Este método es ventajoso en muchos aspectos: permite cambios genéticos muy rápidos y diversos en la línea celular inyectada, que abarca todo el proceso de la progresión del cáncer de mama de crecimiento del tumor primario a la metástasis en los sitios patológicamente relevantes, y también proporciona un buen modelo experimental para estudiar el impacto de los tratamientos terapéuticos en etapas tempranas o tardías de la enfermedad. Además, el uso de este modelo se puede investigar el papel de las proteínas del estroma frente derivadas de células de cáncer en progresión de la enfermedad mediante el uso de ratones o células modificadas genéticamente. Aunque las inyecciones subcutáneas son más fáciles de realizar, modelos ortotópicos dan lugar a una población de células de cáncer más tumorigénico y más metastásico. Por lo tanto, los resultados obtenidos por medio de la inyección subcutáneas podría ser falsos negativos o falsos positivos ^6,17 fomentar el uso de modelos ortotópico para estudiar el crecimiento del tumor.

Protocolo

Los experimentos con animales fueron aprobados por el comité de bienestar de los animales, del Centro Médico de la Universidad de Leiden (LUMC).

1. Preparación de células, Instrumentos y Ratones

1. Un día antes de la operación, se afeitan el / gamma SCID (NSG) ratones NOD a partir del cuarto pezón a la línea media y pesan los ratones para comprobar que todos los ratones tienen pesos más o menos comparables.
2. Autoclave una tijera, dos pinzas y dos pinzas de mosquitos rectas (Figura 1A).
3. En el día de la operación, lavar el adenocarcinoma de mama humano (MDA-MB-231) celdas que se inyecta una vez con tampón fosfato salino (PBS), pH 7,4 y trypsinize las células. Se inactiva la tripsina mediante la adición de 10 ml que contiene suero DMEM los medios de comunicación en la parte superior de las células. Centrifugar las células a 1200 rpm durante 7 min a TA para eliminar el suero resuspendiendo las células, ya sea en PBS o en medios sin suero. Centrifugar de nuevo para eliminar trazas de suero completo. Resuspender las células en PBS omedios de comunicación.
4. Contar las células con un hemocitómetro y calcular la cantidad de células. Utilice 500.000 células / ratón en no más de 150 l. Facultativo de PBS o medio, resuspender las células en matrigel.
   NOTA: Determinar la cantidad de células en función del tipo de célula utilizado.
5. Coloque las células en unos tubos de microcentrífuga estériles y mantenerlos en hielo.
6. Llenar tubo de centrífuga cónico uno 50 ml con 35 ml de PBS pH 7,4 y otro tubo de centrífuga cónico de 50 ml con etanol al 70%. Remoje las esponjas de algodón en cada tubo.

2. Inyección ortotópico

1. Realizar la cirugía en una campana estéril para mantener un ambiente estéril. Anestesiar el ratón por inyección subcutánea de la mezcla de xilazina / ketamina a una dosis de 10 mg / kg, 100 mg / kg de peso corporal, respectivamente. Fijar el ratón sobre una almohadilla térmica. Confirme el éxito de la anestesia por la falta de reacción ante pizca dedo del pie.
   NOTA: Si uno no está muy familiarizado con los procedimientos quirúrgicos, la cirugía puede tomar más tiempo. Arreglarlas dosis de anestesia en consecuencia.
2. Aplique un ungüento oftálmico en los ojos de ratones, para evitar que los ojos se sequen.
3. Limpie el área afeitada utilizando el bastoncillo de algodón humedecido en etanol preparado en el paso 1.6. Alternando matorrales utilizando betadine y alcohol tres veces en forma circular que gira lejos del lugar de la incisión planificada debe ser realizada. Alternativamente, utilizar ionóforo como desinfectante.
4. Hacer una pequeña incisión entre el cuarto pezón y la línea media con una tijera y hacer un bolsillo insertando el hisopo de algodón humedecido con PBS pH 7,4.
5. Use una pinza para exponer la almohadilla de grasa mamaria. Observe la almohadilla de grasa por su color blanco.
6. Apriete la almohadilla de grasa con la otra pinza de su base; al hacer esto, exponer completamente la almohadilla de grasa (Figura 1B) para realizar inyecciones fácilmente.
7. Homogeneizar la mezcla de células pipeteando arriba y abajo. Se aspira suavemente 50 l de suspensión celular en una jeringa de insulina y inyectar enla almohadilla de grasa mamaria mediante la celebración de la aguja en posición horizontal. Confirme la inyección correcta comprobando si hay inflamación de la almohadilla de grasa.
8. Suelte la almohadilla de grasa suavemente.
9. Suturar la incisión utilizando un controlador de aguja. Hacer tres tiros girando la sutura alrededor del conductor de la aguja en sentido horario y anti-horario y hacia la derecha. Deben utilizarse dos nudos por sutura.
   NOTA: Asegúrese de que los nudos están apretados de lo contrario los ratones pueden abrir las suturas.
10. Después de la cirugía, se inyecta un analgésico, tal como Temgesic en 0,05-0,1 mg / kg de peso corporal, por vía subcutánea con el fin de aliviar el dolor.
11. No deje a los animales sin vigilancia hasta que adquieran conciencia y mantener decúbito esternal. Coloque todos los animales en diferentes jaulas hasta que estén completamente recuperados.
12. Para mantener la esterilidad, utilizar jaulas autoclave y agua. Cambie las jaulas cada tres días para mantener el ambiente limpio.

3. Recolección de Órganos para el Análisis

1. Aldía de la cosecha, 8 semanas después de la implantación de las células, llenar 15 ml tubos de centrífuga cónicos con 3 ml de solución de Bouin para cada ratón. Además, utilizar dos 15 ml tubos llenos con 5 ml de solución de formalina por ratón.
2. Anestesiar a los animales mediante la inyección de xilazina / ketamina, a una dosis de 10 mg / kg 100 mg / kg de peso corporal por vía subcutánea. Espere hasta que el animal pierde toe retirada pizca reflejo.
3. Fijar el animal con agujas sobre una base. Haga una larga incisión en la línea media vertical con tijeras. Haga dos incisiones horizontales justo debajo de la pata delantera y por encima de la pata trasera. Exponer el tumor fijando la piel a la base. Medir el volumen del tumor usando un calibrador.
4. Disociar el tumor de la piel usando tijeras. Snap congelar una parte del tumor en nitrógeno líquido para el aislamiento de ARN. Coloque la otra parte, en el tubo de centrífuga cónico lleno de formol para realizar inmunohistoquímica tras la inclusión en parafina.
5. Tomar suavemente los pulmones. Coloque elpulmón izquierdo en solución de Bouin. Mantenga el pulmón en solución durante 3 días. Observe focos metastásicos superficial claramente a simple vista. Opcionalmente, coloque el pulmón derecho en formalina para verificar micrometástasis mediante hematoxilina y eosina (H & E) tinción.
   NOTA: Si bien, la metástasis pulmonar observado con frecuencia en el cáncer de mama, también puede ser que desee para recoger los huesos, el hígado, el cerebro y el bazo para analizar la metástasis. Las células en la zona metastásico son más densas y morfológicamente diferente y por lo tanto se pueden distinguir fácilmente de tejido pulmonar.
6. Un día después de la cosecha, aspirar la solución de formalina de tubos de 15 ml y reemplazar con etanol al 70%. Insertar los tejidos en parafina y realizar estudios de inmunohistoquímica.
7. Para el análisis de sangre, abre la cavidad torácica con unas tijeras. Retirar 450 l de sangre por punción cardiaca. Coloque la muestra de sangre en un tubo de microcentrífuga que contiene 50 l de 3,2% de citrato de sodio. Después de recoger la sangre, girar a 2.000 xg durante 10 millasn. Almacenar las muestras de plasma a -20 ° C hasta su uso posterior.
   NOTA: Hay varias otras técnicas de recogida de sangre de uso común en la práctica ²⁰ y la técnica que se debe utilizar depende de la configuración experimental y elección del científico. Si no se requiere muestra de sangre, la eutanasia del animal de acuerdo con el protocolo de animal o de acuerdo con las directrices de la institución.

Resultados

La aplicación exitosa del "modelo ortotópico de cáncer de mama" se basa en la inyección adecuada de las células en la almohadilla de grasa mamaria. Errores experimentales tales como la inoculación de las células imprecisa o fugas pueden conducir a variaciones en el tamaño del tumor o incluso la ausencia de un tumor que conduce a la formación de una estructura similar a la que mira una almohadilla de grasa mamaria inyectado con un tampón de control (Figura 2A). La tasa de crecimiento ...

Discusión

Inyección ortotópico de células de cáncer de mama es un poderoso modelo para estudiar todos los aspectos del crecimiento del cáncer. La implantación de estas células en la almohadilla de grasa mamaria de los ratones se debe realizar cuidadosamente para evitar la variación en el crecimiento del tumor. Lo más importante, la inyección de la misma cantidad de células a cada ratón es crucial. Para ello, se debe trypsinize las células rigurosamente sin afectar la viabilidad de las células. Las células no viable...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9