Injection Orthotopique des cellules du cancer du sein dans le Fat Pad mammaire de souris pour étudier la croissance de la tumeur.

Résumé

Le cancer est une maladie complexe qui est influencé par les tissus entourant la tumeur ainsi que locale pro- et anti-inflammatoires des médiateurs. Par conséquent, les modèles d'injection orthotropes, plutôt que sous-cutanées modèles peuvent être utiles pour étudier la progression du cancer d'une manière qui imite mieux de pathologie humaine.

Résumé

la croissance du cancer du sein peut être étudiée chez la souris en utilisant une grande variété de modèles. La manipulation génétique des cellules de cancer du sein peut fournir des indications sur les fonctions des protéines oncogènes impliqués dans la progression ou de l'aide à découvrir de nouveaux gènes suppresseurs de tumeur. En outre, l'injection des cellules cancéreuses dans des souris avec différents génotypes peut fournir une meilleure compréhension de l'importance du compartiment stromal. De nombreux modèles peuvent être utiles pour enquêter sur certains aspects de la progression de la maladie, mais ne ont pas récapituler l'ensemble du processus cancéreux. En revanche, les cellules de cancer du sein pour la prise de greffe du coussinet adipeux mammaire de souris meilleures récapitule l'emplacement de la maladie et la présence du compartiment stromal approprié et donc de meilleurs imite maladie cancéreuse humaine. Dans cet article, nous décrivons comment implanter des cellules de cancer du sein chez des souris orthotopique et expliquer comment collecter les tissus pour analyser la: 14px; line-height:. 28px; "> milieu de la tumeur et des métastases aux organes distants utilisant ce modèle, de nombreux aspects (la croissance, l'angiogenèse et les métastases de cancer) peuvent être étudiés tout simplement en fournissant un environnement approprié pour les cellules tumorales de croître.

Introduction

Le cancer est une maladie très complexe qui a fait l'objet d'études pour les cours des siècles. Le cancer du sein est le type de cancer le plus fréquent; il se produit principalement chez les femmes, mais peut également se produire sporadiquement chez les hommes ^27. La maladie est principalement causée par la perte de mécanisme de contrôle de la division cellulaire de direction qui à son tour conduit à une croissance infinie de cellules dans le corps. Ces dysfonctionnements peuvent être causés par plusieurs mécanismes: d'abord, les cellules saines ont besoin de signaux provenant des cellules voisines de croissance afin de proliférer tandis que les cellules cancéreuses de faire leurs propres facteurs de croissance et d'augmenter l'expression de récepteurs de facteurs de croissance permet d'obtenir un taux de prolifération plus élevé ^1; d'autre part, les cellules cancéreuses sont moins sensibles à des signaux anti-prolifératifs ^8; troisièmement, pour équilibrer le nombre de cellules dans la mort des cellules du corps est également nécessaire; cependant, les cellules cancéreuses se échappent de la mort cellulaire programmée, appelées apoptose ^14; quatrième, cellules adhèrent à des matrices extracellulairespour survivre, mais les cellules tumorales peuvent se développer sans la nécessité de l'attachement et de montrer une résistance à anoïkis ^19; cinquième, l'activation de la télomérase contourne le raccourcissement des telomeres et empêche la sénescence réplicative ^21; last but not least, en sautant du contrôle de la qualité de l'ADN suite aux résultats de la mitose dans le contenu génétique altérée ^15,16. Afin d'identifier les oncogènes ou suppresseurs de tumeurs qui jouent un rôle dans cette prolifération dérégulée, des expériences de croissance tumorale chez la souris sont cruciales.

La croissance de la tumeur primaire ne est généralement pas la principale cause de décès. La migration des cellules cancéreuses à partir du site primaire à un site secondaire, appelé métastase, est la principale cause de décès dans la plupart des ²² patients atteints de cancer. Metastasis implique invasion des cellules tumorales, intravasation, transitant par la circulation, en évitant une attaque immunitaire, extravasation et la croissance au niveau du site secondaire. À la transition épithéliale mésenchymateuses (EMT) est un processus clé dansmétastases et implique un interrupteur dans les profils d'expression génique des cellules produisant de la motilité supérieur et envahissant, qui sont des pré-requis pour la cellule de métastases ^12. Comme le processus cancéreux est la résultante d'une combinaison de différentes actions, y compris les interactions réciproques entre les cellules cancéreuses, les cellules stromales et les cellules pro- et anti-inflammatoires, une approche in vitro pour le cancer souvent ne fournit pas un aperçu complet dans le processus cancéreux. De même, les traitements anticancéreux impact de la vascularisation de la tumeur ne peuvent souvent pas être étudiés in vitro, ainsi l'utilisation de in vivo approche est inévitable.

Pour étudier la progression du cancer du sein, différentes méthodes expérimentales ont été développées. Le modèle le plus largement utilisé est l'injection sous-cutanée de cellules de cancer du sein chez des souris ^5. Dans ce dispositif expérimental, le chercheur peut présenter une large gamme de modifications à une lignée cellulaire de choix in vitro (à savoirla régulation positive, la régulation négative des protéines) et injecter les cellules sous la peau. Bien que ce procédé est simple et le procédé d'injection est simple sans qu'il soit nécessaire d'effectuer une chirurgie sur la souris, le site où la tumeur est injecté ne représente pas l'environnement de la tumeur mammaire locale et l'absence de cet environnement peuvent entraîner le développement du cancer du sein qui diffère de celle observée en pathologie humaine. En second lieu, des souris génétiquement modifiées sont fréquemment utilisés comme un outil pour étudier in vivo la progression du cancer du sein. Dans ce modèle, l'oncogène (par exemple PyMT, Neu) expression est entraînée par un promoteur spécifique de tissu mammaire conduisant à la formation de l'art de la tumeur mammaire spontané. Ce dispositif expérimental est utile d'étudier l'aspect de traitement de la maladie par l'injection de drogues ou d'anticorps tout en vérifiant la taille de la tumeur dans le temps ^3. Toutefois, la reproduction de ces souris avec d'autres souches de souris déficientes ou mutés dans un gène d'intérêt pourrait aussi donner insroits sur le rôle des protéines différentes de la croissance de tumeur du sein ^24. L'inconvénient de ce modèle est qu'il est sujet à des variations dans la taille de la tumeur et le nombre. En outre, le niveau d'expression du transgène dépend du site d'intégration dans le génome et peut changer d'une souche de souris à l'autre ^4. Dans ce modèle, l'expression du transgène peut être réalisée par toutes les cellules à l'origine épithéliale alors que dans les maladies humaines, seule une sous-population de cellules expriment l'oncogène ou réguler à la baisse des niveaux de ²⁶ suppresseurs de tumeurs. Pour étudier la métastase des cellules de cancer du sein peuvent également être injectés par voie intraveineuse (appelé métastase un modèle expérimental) ^25. Cependant, cette approche ne récapitule le processus métastatique partiellement; il contourne la nécessité pour les cellules tumorales à envahir et intravasate, et commence à partir du moment où les cellules tumorales sont facilement présents dans la circulation.

Dans notre travail, nous utilisons une injection orthotopiqueion modèle pour étudier l'implication de gènes d'intérêt dans la progression du cancer du sein ^13. Nous surexpriment la protéine dans les cellules cancéreuses du sein humain et de les injecter dans le coussinet adipeux mammaire de souris NOD / SCID gamma (NSG) souris. Ce procédé est avantageux à bien des égards: il permet des modifications génétiques très rapides et diversifiés dans la lignée cellulaire injecté, il couvre l'ensemble du processus de la progression du cancer du sein de la croissance de la tumeur primaire à des métastases dans les sites pathologiquement pertinentes, et il fournit également un bon modèle expérimental pour étudier l'impact des traitements thérapeutiques à des stades précoces ou avancés de la maladie. En outre, l'utilisation de ce modèle ne peut étudier le rôle de stroma par rapport à des protéines dérivées de cellules cancéreuses dans la progression de la maladie en utilisant des souris ou des cellules génétiquement modifiées. Bien que les injections sous-cutanées sont plus faciles à réaliser, des modèles orthotopiques donnent naissance à une population de cellules cancéreuses plus tumorigène et métastatique plus. Ainsi, les résultats obtenus au moyen de l'injection sous-cutanées pourrait être soit de faux négatifs ou de faux positifs ^6,17 encourager l'utilisation de modèles orthotopiques pour étudier la croissance de la tumeur.

Protocole

Les expérimentations animales ont été approuvés par le comité de protection des animaux du Centre médical universitaire de Leiden (LUMC).

1. Préparation de cellules, Instruments et souris

1. Un jour avant l'opération, le raser / SCID gamma (NSG) souris NOD à partir du quatrième mamelon de la ligne médiane et peser les souris pour vérifier que toutes les souris ont un poids à peu près comparables.
2. Autoclave une paire de ciseaux, deux pinces et deux pinces de moustiques droites (figure 1A).
3. Le jour de l'opération, laver le adénocarcinome de sein humain (MDA-MB-231) des cellules qui sera injecté une fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), pH 7,4 et les cellules trypsiniser. Stopper la trypsine par addition de 10 ml de DMEM contenant du sérum support au-dessus des cellules. Centrifuger les cellules à 1200 rpm pendant 7 min à température ambiante pour éliminer le sérum en remettant en suspension les cellules dans du PBS ou l'autre ou dans des milieux sans sérum. Centrifuger à nouveau pour enlever les traces de sérum complètement. Remettre en suspension les cellules dans du PBS oumédias.
4. Compter les cellules avec un hémocytomètre et calculer la quantité de cellules. Utilisez 500 000 cellules / souris dans pas plus de 150 pi. Facultatif à PBS ou médias, remettre en suspension les cellules dans matrigel.
   NOTE: Déterminer la quantité de cellules en fonction du type de cellule utilisée.
5. Placez cellules dans un microtubes stériles et de les garder sur la glace.
6. Remplir une 50 ml tube à centrifuger conique de 35 ml de PBS pH 7,4 et un autre tube à centrifuger conique de 50 ml avec 70% d'éthanol. Faire tremper des cotons-tiges dans chaque tube.

2. injection orthotopique

1. Effectuer l'opération dans une hotte stérile à maintenir une atmosphère stérile. Anesthésier la souris par voie sous-cutanée injection xylazine / kétamine mélange à une dose de 10 mg / kg, 100 mg / kg de poids corporel, respectivement. Fixer la souris sur un coussin chauffant. Confirmer le succès de l'anesthésie par le manque de réaction à pincement de l'orteil.
   REMARQUE: Si on ne est pas très familier avec les procédures chirurgicales, la chirurgie peut prendre plus de temps. Organiserles anesthésie dose en conséquence.
2. Appliquer une pommade ophtalmique sur les yeux de souris, pour éviter les yeux de sécher.
3. Nettoyez la zone rasée en utilisant le coton-tige trempé dans l'éthanol préparé à l'étape 1.6. Alternant les produits avec de la bétadine et de l'alcool trois fois de façon circulaire tournante loin du site d'incision prévue devrait être effectuée. Vous pouvez également utiliser ionophore comme désinfectant.
4. Faire une petite incision entre le quatrième mamelon et la ligne médiane avec une paire de ciseaux et un fourreau en insérant le coton-tige humidifié avec du PBS pH 7,4.
5. Utilisez une pince pour exposer le coussinet adipeux mammaire. Observez le coussinet adipeux par sa couleur blanche.
6. Pressez le coussinet adipeux avec l'autre pince de sa base; ce faisant, d'exposer pleinement le coussinet adipeux (Figure 1B) pour effectuer facilement des injections.
7. Homogénéiser le mélange de cellules par pipetage de haut en bas. Aspirer doucement 50 pi de suspension cellulaire dans une seringue à insuline et les injecter danscoussinet adipeux mammaire en maintenant l'aiguille horizontalement. Confirmez injection réussie en vérifiant gonflement du coussinet adipeux.
8. Relâchez le coussinet adipeux doucement.
9. Suturer l'incision en utilisant un pilote de l'aiguille. Faire trois jets en tournant la suture autour du conducteur d'aiguille dans le sens horaire, dans le sens horaire et anti-sens horaire. Deux noeuds par suture doivent être utilisés.
   NOTE: Assurez-vous que les nœuds sont serrés contraire souris peuvent ouvrir les sutures.
10. Après la chirurgie, injecter un analgésique, comme Temgesic à 0,05-0,1 mg / kg de poids corporel, voie sous-cutanée afin de soulager la douleur.
11. Ne pas laisser les animaux sans surveillance jusqu'à ce qu'ils aient conscience et maintiennent décubitus sternale. Placez tous les animaux dans différentes cages jusqu'à ce qu'ils soient complètement rétablis.
12. Pour maintenir la stérilité, utiliser des cages autoclaves et de l'eau. Modifiez les cages tous les trois jours pour garder l'atmosphère propre.

3. prélèvements d'organes pour l'analyse

1. A lajour de la récolte, 8 semaines après l'implantation des cellules, 15 ml de remplir des tubes à centrifuger coniques avec 3 ml de solution de Bouin pour chaque souris. En outre, utiliser deux 15 ml tubes remplis de 5 ml de solution de formol par souris.
2. Anesthésier les animaux par injection de xylazine / kétamine, à une dose de 10 mg / kg 100 mg / kg par voie sous cutanée de poids corporel. Attendez jusqu'à ce que l'animal perd pied retrait de pincement réflexe.
3. Fixer l'animal avec des aiguilles sur une base. Faire une longue incision verticale de la ligne médiane avec des ciseaux. Faire deux incisions horizontales juste en dessous de la jambe avant et au-dessus la jambe arrière. Exposer la tumeur en épinglant la peau à la base. Mesurer le volume de la tumeur en utilisant un pied à coulisse.
4. Dissocier la tumeur de la peau avec des ciseaux. Aligner congeler une partie de la tumeur dans de l'azote liquide pour l'isolement d'ARN. Placez l'autre partie, dans le tube de centrifugeuse conique rempli avec du formol pour effectuer immunohistochimie suivant la paraffine.
5. Doucement prendre les poumons. Placez lepoumon gauche dans la solution de Bouin. Conserver le poumon en solution pendant 3 jours. Observez foyers métastatiques superficielle clairement à l'oeil nu. En option, placez le poumon droit dans le formol de vérifier micrométastase utilisant l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) coloration.
   REMARQUE: Bien, métastases pulmonaires fréquemment observé dans le cancer du sein, on peut aussi vouloir recueillir des os, le foie, le cerveau et la rate d'analyser les métastases. Les cellules à la surface métastatique sont plus denses et morphologiquement différentes et peuvent donc être facilement distinguées de tissu pulmonaire.
6. Un jour après la récolte, aspirer la solution de formaline à partir de tubes de 15 ml et le remplacer par 70% d'éthanol. Incluez les tissus en paraffine et effectuer des études d'immunohistochimie.
7. Pour l'analyse de sang, ouvrir la cavité de la poitrine avec des ciseaux. Retirer 450 ul de sang par ponction cardiaque. Placer l'échantillon de sang dans un tube de microcentrifugation contenant 50 ul de citrate de sodium à 3,2%. Après le sang est collecté, le tourner à 2000 g pendant 10 kmn. Stocker les échantillons de plasma à -20 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
   NOTE: Il existe plusieurs autres techniques de collecte de sang couramment utilisés dans la pratique ²⁰ et la technique qui doit être utilisé dépend de la configuration expérimentale et le choix de scientifique. Si l'échantillon de sang ne est pas nécessaire, euthanasier l'animal selon le protocole animale ou selon les directives de l'institution.

Résultats

L'application réussie du «modèle de cancer du sein orthotopique" est basé sur une bonne injection de cellules dans le coussinet de graisse mammaire. Erreurs expérimentales telles que inoculation imprécis de cellules ou de fuite peuvent conduire à des variations de la taille tumorale, ou même l'absence d'une tumeur qui conduit à la formation d'une structure en regardant semblable à un coussinet adipeux mammaire injecté avec un tampon de contrôle (figure 2A). Le taux de cr...

Discussion

Injection orthotopique de cellules de cancer du sein est un excellent modèle pour l'étude de tous les aspects de la croissance du cancer. L'implantation de ces cellules dans le coussinet adipeux mammaire de la souris doit être réalisé avec soin afin d'éviter une variation dans la croissance tumorale. Plus important encore, l'injection de la même quantité de cellules de chaque souris est cruciale. Pour ce faire, il faut trypsiniser les cellules rigoureusement sans affecter la viabilité des cellul...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9