腫瘍増殖を研究するためにマウスの乳房脂肪パッド中に乳癌細胞の同所注入。

要約

癌は、腫瘍の周囲の組織だけでなく、ローカルプロ - および抗炎症性メディエーターによって影響される複雑な疾患である。したがって、むしろ皮下モデルより異方性注入モデルは、方法をより良く模倣するヒト病理における癌の進行を研究するために有用であり得る。

要約

乳癌増殖は、モデルの過多を使用してマウスで研究することができる。乳癌細胞の遺伝子操作は、発癌の進行に関与するタンパク質の機能への洞察を提供するか、または新たな腫瘍抑制因子を発見するのを助けることができる。さらに、異なる遺伝子型を有するマウスに癌細胞を注入する間質区画の重要性のよりよい理解を提供するかもしれない。多くのモデルは、疾患の進行の特定の局面を調査するために有用であり得るが、全体の癌のプロセスを反復しない。対照的に、マウスの乳房脂肪パッドに乳癌細胞の生着が、より適切な間質区画、従ってより良い模倣するヒト癌性疾患の疾患および存在の位置を再現する。この記事では、同所マウスに乳癌細胞を移植し、分析するために、組織を収集する方法を説明する方法を説明します：14px;行の高さ：28px; ">腫瘍環境および転移遠隔臓器にこのモデルを用いて、癌の多くの側面（成長、血管新生、および転移）は、腫瘍細胞が成長するための適切な環境を提供することにより、簡単に調べることができる。

概要

がんは何世紀にもわたってのための研究の対象となっている非常に複雑な疾患である。乳がんは、最も一般的な癌型です。それは女性で主に発生するが、散発的にも、男性²⁷内に発生する可能性があります。この疾患は、主に次に体内の細胞の無限増殖をもたらす細胞分裂を支配する制御機構の損失によって引き起こされる。これらの不具合がいくつかのメカニズムによって引き起こされる可能性がありますまず、正常細胞は、癌細胞が自分自身の成長因子を行うため、より高い増殖率^1を得る成長因子受容体の発現を増加させるのに対して、増殖するために、周囲のセルからの増殖シグナルを必要とする。第二に、癌細胞は、抗増殖シグナル⁸を受けにくい。第三の、また必要とされる体細胞死細胞数のバランスをとる。しかし、癌細胞は、プログラム細胞死から脱出アポトーシス^14と呼ばれる。第四に、細胞は、細胞外マトリックスに付着生き残るために、腫瘍細胞は付着を必要とせずに成長し、アノイキス¹⁹に対する抵抗性を示すことができるために。第五、テロメラーゼの活性化は、テロメアの短縮を回避し、複製老化^21を防ぎます。最後のではなく、少なくとも、変更された遺伝的内容^15,16における有糸分裂の結果、以下のDNAの品質管理のスキップ。この調節解除された増殖に役割を果たす癌遺伝子または腫瘍抑制因子を同定するために、マウスにおける腫瘍増殖実験は重要である。

原発腫瘍の成長は、一般的に死の主な理由ではありません。セカンダリサイトへのプライマリサイトから癌細胞の移動、転移と呼ばれるが、ほとんどの癌患者の死亡の主要な原因で²²です。転移はセカンダリサイトでの腫瘍細胞の浸潤、血管内、循環を通過する、免疫攻撃を回避し、血管外漏出と成長を伴う。間葉移行（EMT）の上皮は、キープロセスである転移および転移性細胞¹²のための前提条件である、より高い運動性と侵襲性で細胞をもたらす遺伝子発現プロファイル、スイッチを伴う。癌処理としては、がん細胞、ストローマ細胞とプロと抗炎症性細胞との間の相互の相互作用を含む様々なアクションの組み合わせの結果として、癌にin vitroでのアプローチは、多くの場合、癌のプロセスに完全な洞察を提供していませんされている。同様に、腫瘍血管系に影響を与える抗癌治療は、しばしば、したがって、インビボでの使用が避けられない近づき、 インビトロで研究することができない。

乳癌の進行を研究するために、異なる実験的方法が開発されている。最も広く使用されるモデルは、マウス⁵に乳癌細胞の皮下注射である。この実験では、研究者は、in vitroで選択した細胞株の変化の広い範囲を導入することができる（ すなわちアップレギュレーション、タンパク質のダウンレギュレーション）と皮膚の下に細胞を注入する。この方法は簡単で、注入プロセスがマウスの手術を実行する必要なしに単純であるが、腫瘍が注入される部位は、ローカル乳腺腫瘍環境を表していないと、この環境の欠如は、乳癌の発達をもたらし得るヒト病態において観察されるものとは異なる。第二に、遺伝子操作されたマウスは、乳癌の進行を研究するためのin vivoでのツールとして頻繁に使用される。このモデルでは、癌遺伝子（ すなわち PyMT、ノイ）の発現は、自発乳癌sの形成をもたらす乳房組織特異的プロモーターによって駆動される。この実験は、時間³における腫瘍の大きさを確認しながら、薬物または抗体を注入することによって、疾患の治療の側面を研究するのに有用である。しかし、欠損またはまたインを与えるかもしれない、目的の遺伝子に変異した他のマウス系統とこれらのマウスの繁殖乳房腫瘍増殖²⁴の異なるタンパク質の役割にights。このモデルの欠点は、腫瘍の大きさおよび数の変動を受けやすいということである。さらに、導入遺伝子発現のレベルは、ゲノム中の組込み部位に依存し、別の⁴一つのマウス株から変更することができる。ヒト疾患において、細胞の亜集団のみが癌遺伝子を発現するかまたは腫瘍抑制レベル^26を下方のに対し、このモデルでは、導入遺伝子の発現は、上皮起源のすべての細胞によって達成することができる。転移を研究するために、乳癌細胞を静脈内注射することができる^25（モデルは、実験的転移と呼ばれる）。しかし、このアプローチは、部分的にしか転移プロセスを再現する。それは、腫瘍細胞が侵入しintravasateするための要件を回避し、腫瘍細胞が容易に循環中に存在するところから始まる。

私たちの研究では、同所注入を使用乳癌進行¹³における目的の遺伝子の関与を研究するためのイオンモデル。本発明者らは、ヒト乳癌細胞においてタンパク質を過剰発現し、NOD / SCIDガンマ（NSG）マウスの乳房脂肪パッドにそれらを注入する。この方法は、多くの点で有利である：それは、注入された細胞株において非常に急速な多様な遺伝的変化を可能にし、それは病理学的に関連する部位に転移する原発性腫瘍成長の乳癌進行のプロセス全体をカバーし、それはまた、良好な実験モデルを提供疾患の初期または後期段階での治療処置の影響を研究するため。また、このモデルを用いたものは、遺伝的に改変されたマウスまたは細胞を用いて疾患の進行中の癌細胞由来のタンパク質対間質の役割を調べることができる。皮下注射は実行が容易であるが、同所性モデルは、より腫瘍形成、より転移性癌細胞集団を生じる。したがって、結果は、皮下注射により得られるSは、偽陰性または腫瘍増殖を研究するための同所モデルの使用を奨励^6,17偽陽性のいずれかである可能性があります。

プロトコル

動物実験は、ライデン大学医療センター（LUMC）の動物福祉委員会によって承認された。

細胞、楽器やマウスの作製

1. 操作前日は、正中線に第四の乳首からNOD / SCIDガンマ（NSG）マウスを剃ると、すべてのマウスがほぼ同程度の重みを持っていることを確認するために、マウスの重量を量る。
2. はさみ、2ピンセットと2ストレートモスキート鉗子（ 図1A）をオートクレーブ。
3. 操作の日に、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で一回注射するヒト乳腺癌（MDA-MB-231）細胞を洗浄し、pH7.4で、細胞をトリプシン処理。細胞の上の10mlの血清含有DMEM培地を添加することによりトリプシンをクエンチする。血清を含まないPBS中またはメディアのいずれかで細胞を再懸濁することによって血清を除去するために、室温で7分間1200 rpmで細胞を遠心します。完全に血清の痕跡を除去するためにそれらを再度遠心します。 PBSに細胞を再懸濁またはメディア。
4. 血球計数器を用いて細胞をカウントし、細胞の量を計算する。しないより150以上μlの500,000細胞/マウスを使用しています。 PBSまたはメディアへのオプション、マトリゲルで細胞を懸濁します。
   注：使用する細胞の種類に応じて、細胞の量を決定します。
5. 滅菌マイクロチューブに細胞を配置し、氷の上に保管してください。
6. 35 PBS pHを7.4 mlの70％エタノールを有する別の50mlの円錐形遠心分離管と、ワン50mlコニカル遠心チューブを埋める。各チューブに綿棒を浸す。

2.同所インジェクション

1. 無菌雰囲気を維持するために、無菌フード内で手術を行う。それぞれの10mg / kgを、100 mg / kg体重の用量でキシラジン/ケタミン混合物を皮下注射することによってマウスを麻酔。加熱パッド上でマウスを修正。つま先のピンチに反応の欠如によって麻酔の成功を確認してください。
   NOTE：一つは外科手術手順に精通していない場合は、手術が長くかかる場合があります。アレンジ麻酔はそれに応じて投与量。
2. 乾燥から目を防ぐために、マウスの眼に眼軟膏を適用します。
3. ステップ1.6で作成エタノールに浸漬綿棒を使って、剃らエリアを清掃してください。離れて計画された切開部位から回転する円形の方法でベタジンとアルコール3回を使用して交互にスクラブを実行する必要があります。また、消毒剤としてイオノフォアを使用しています。
4. はさみで四ニップルと正中線の間に小さな切開を行い、PBSのpHは7.4で湿らせた綿棒を挿入してポケットを作る。
5. 乳腺脂肪体を露出させるためにピンセットを使用してください。その白い色で脂肪パッドを観察します。
6. そのベースから他のピンセットで脂肪パッドを絞る。これを行うことで、完全に簡単に注入を実行するために脂肪パッド（ 図1B）を公開します。
7. ピペッティングにより細胞混合物を均質化する。静かにインスリン注射器に細胞懸濁液50μlを吸引しに注入水平に針を保持することによって乳腺脂肪パッド。脂肪パッドの腫れのためにチェックすることで成功​​した注射を確認します。
8. 優しく脂肪パッドを離します。
9. 針ドライバを使用して切開部を縫合する。 3時計回り、反時計回りおよび時計回りに針ドライバの周りに縫合糸を回すことによりスロー行う。縫合ごとに2つの結び目を使用する必要があります。
   注：ノットが締まっているそうでマウスが縫合糸を開くことができていることを確認してください。
10. 手術後、痛みを緩和するために、0.05〜0.1ミリグラム/ kg体重、皮下にかかるtemgesicとして、鎮痛剤を注入する。
11. 彼らが意識を獲得し、胸骨横臥を維持するまで無人の動物に放置しないでください。彼らは完全に回復するまで、別のケージにすべての動物を置きます。
12. 無菌性を維持するために、オートクレーブケージと水を使用する。清浄な雰囲気を保つために3日ごとにケージを変更します。

分析のための3.収穫臓器

1. アット収穫の日は、8週間の細胞の移植後、各マウスのための3ミリリットルブアン液で15ミリリットルコニカル遠心管を埋める。また、マウス当たり5ミリリットルホルマリン溶液で充填された2つの15ミリリットルチューブを使用。
2. 10ミリグラムの用量で、キシラジン/ケタミンを注射することによって動物を麻酔/ 100 mg / kg体重の皮下キロ。動物が足指ピンチ引っ込め反射を失うまで待ってください。
3. ベース上の針を動物に固定してください。はさみとの長い、垂直正中切開を行います。右の前脚の下と後脚の上に二つの水平切開を行います。ベースに皮膚を固定することによって腫瘍を公開します。キャリパーを用いて腫瘍体積を測定する。
4. ハサミを用いて皮膚からの腫瘍を解離。スナップは、RNA単離のために液体窒素中での腫瘍の一部を凍結する。パラフィン包埋以下の免疫組織化学を実行するためにホルマリンで満たされたコニカル遠心チューブに、他の部分を配置します。
5. ゆっくりと肺を取り出します。置きブアン溶液中に肺を残した。 3日間溶液中の肺にしてください。肉眼ではっきりと表面的な転移巣を観察します。必要に応じて、ヘマトキシリン​​およびエオシン（H＆E）染色を使用して微小転移を確認するためにホルマリンに右肺を置く。
   注：肺転移が乳癌で頻繁に見られ、が、1にも転移を分析するために骨、肝臓、脳および脾臓を収集する場合があります。転移領域における細胞はより高密度と形態学的に異なっており、したがって、肺組織から容易に区別することができる。
6. 日は収穫後、15ミリリットル管からのホルマリン溶液を吸引し、70％エタノールで交換してください。パラフィンで組織を埋め込み、免疫組織化学研究を行う。
7. 血液分析のために、はさみで胸腔を開く。心臓穿刺を介して450μlの血液を撤回。 3.2％クエン酸ナトリウムを50μl含むマイクロ遠心チューブに血液試料を置く。血液が収集された後、10マイルのために2000×gで、それをスピンN。さらに使用するまで-20℃で血漿サンプルを保管してください。
   注：一般的慣行²⁰と実験科学者の選択に依存して使用する必要がある技術で使用されるいくつかの他の血液採取技術がある。血液サンプルを必要としない場合は、動物プロトコルや機関のガイドラインに従って応じて動物を安楽死させる。

結果

「同所乳癌モデル」の成功したアプリケーションは、乳房脂肪パッドへの細胞の適切な注入に基づいています。このような細胞または漏れの不正確接種の実験誤差は、腫瘍の大きさまたは対照緩衝液（ 図2A）を注射した乳房脂肪パッドに似て見て構造が形成される腫瘍であっても非存在下でのばらつきにつながるかもしれない。腫瘍の増殖速度は、注入された細胞株の性質に依?...

ディスカッション

乳癌細胞の同所注射は、癌の成長のすべての側面を研究するための強力なモデルである。マウスの乳腺脂肪体におけるこれらの細胞の注入は、慎重に腫瘍成長の変化を防止するために行われるべきである。最も重要なことは、各マウスへの細胞の同量を注入することは重要である。これを行うためには、細胞の生存に影響を与えることなく、厳密に細胞をトリプシン処理すべきである。非生?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bouin's solution	Sigma-Aldrich	HT10132	Used for investigating the metastasis on lungs
Formalin solution	Sigma-Aldrich	HT501128	Used to fix the tissues
Matrigel, growth factor reduced	Corning	356230	Cells can be resuspended in matrigel for injection
Mosquito forceps	Fine Science Tools	13008-12	Used for stiching
Angled forceps	Electron microscopy sciences	72991-4c	These make the exposure of mammary fat pad easier
Scissors	B Braun Medicals	BC056R	Used to cut open the mice
Straight forceps	B Braun Medicals	BD025R	This is used to open up the skin to expose mammary fat pad
NOD scid gamma mice	Charles River	005557	Experimental animal used for experiment
MDA-MB-231	Sigma-Aldrich	92020424	Experimental cells used for injections
Oculentum simplex	Teva Pharmachemie		Opthalmic ointment used to prevent drying out of eyes
Betadine	Fischer Scientific	19-898-859	Ionophore, used to disinfect the surgical area
Xylazin/Ketamine	Sigma-Aldrich	X1251, K2753	Use injected anesthesia as 10mg/kg and 100mg/kg body weight respectively
Temgesic	Schering-Plough		Use the painkiller as 0.05-0.1 mg/kg body weight
DMEM	Life sciences	11995	For trypsin neutralization,use media with serum(FBS:media 1:10 volume); for injection, use media with no serum
Buffered sodium citrate	Aniara	A12-8480-10	Use the volume ratio as citrate:blood; 1:9