كفاءة الجذع الجيل خلية من الدم عن طريق Episomes وHDAC المانعون

Summary

نحن هنا وصف بروتوكول لتوليد الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها الإنسان من الدم المحيطي باستخدام استراتيجية إعادة برمجة يصبوغ مقرها ومثبطات deacetylase هيستون.

Abstract

وتوضح هذه المخطوطة بروتوكول لخلق بكفاءة من صنع الإنسان خلايا خالية من التكامل الجذعية المحفزة (iPSCs) من الدم المحيطي باستخدام البلازميدات episomal وdeacetylase هيستون (HDAC) مثبطات. مزايا هذا النهج ما يلي: (1) استخدام كمية ضئيلة من الدم المحيطي كمادة المصدر؛ (2) nonintegrating ناقلات إعادة برمجة. (3) وسيلة فعالة من حيث التكلفة لتوليد iPSCs خالية النواقل؛ (4) وترنسفكأيشن واحد؛ و (5) استخدام جزيئات صغيرة لتسهيل إعادة برمجة جينية. باختصار، يتم عزل الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى (PBMCs) من عينات الفصد الروتينية ومن ثم تربيتها في عوامل نمو محددة لانتاج الكريات الحمر السكان الخلية السلف التكاثري للغاية وقابلة للبرمجة بشكل ملحوظ. Nonintegrating، البلازميدات episomal nontransmissible معربا عن OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، LIN28A، والبروتين p53 دبوس الشعر القصير (SH) RNA هي introduدائرة الهندسة المدنية في الأرومة الحمراء المستمدة عبر nucleofection واحد. Cotransfection من يصبوغ التي تعبر عن تعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) يسمح لسهولة تحديد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. يضاف البلازميد-تكرار نقص منفصل معربا عن ابشتاين بار مستضد النووي (1 EBNA1) أيضا إلى خليط التفاعل لزيادة التعبير عن البروتينات episomal. ثم يتم مطلي الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل على طبقة من الخلايا الليفية الفأر الجنينية المشع (iMEFs) لاستمرار إعادة برمجة. حالما تظهر المستعمرات IPSC تشبه في حوالي اثني عشر يوما بعد nucleofection، يتم إضافة مثبطات HDAC إلى المتوسطة لتسهيل إعادة جينية. وقد وجدنا أن إدراج مثبطات HDAC يزيد بشكل روتيني الجيل المستعمرات IPSC برمجتها بالكامل بنسبة 2 أضعاف. مرة واحدة المستعمرات IPSC المعرض نموذجي الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) التشكل، يتم نقلها برفق لiMEF الفردية المغلفة لوحات زراعة الأنسجة لاستمرار النمو والتوسع.

Introduction

وتستمد iPSCs من الأنسجة الجسمية عن طريق التعبير خارج الرحم من مجموعة صغيرة من جينات تعدد القدرات. وقد تجلى هذا الأسلوب في البداية من قبل تنبيغ فيروسات من الخلايا الليفية الإنسان مع OCT4، SOX2، KLF4، وcMYC، التي يتم التعبير عنها بشكل كبير في الدولة المحفزة ^1. أعرب عابر هذه "عوامل إعادة برمجة" يغير المشهد جينية والجينات الشخصية التعبير الخلية المستهدفة مماثلة للخلايا الجذعية الجنينية البشرية ^2. مرة واحدة تم إنشاؤها، iPSCs يحتمل أن تكون متباينة في أي نوع الأنسجة لمزيد من التحقيق. وبالتالي، فإنها تبشر لاستخدامها في الطب التجديدي، والنمذجة المرض، وتطبيقات العلاج الجيني. ومع ذلك، وتعطيل الجينات مع فيروسات دمج لديه القدرة على تغيير الجينات الذاتية، تأثير النمط الظاهري الخلوية، والتحيز في نهاية المطاف النتائج العلمية. وعلاوة على ذلك، يمكن أن التكامل الفيروسية عشوائية تؤدي إلى البريد الخلوية ضارأثر بعض، بما في ذلك إمكانية التحول الخبيث ³ أو إعادة التعبير عن الجينات المحورة أنكجنيك ^4. سوف التطبيقات السريرية في المستقبل يتطلب دمج الجيل غير IPSC.

Episomes، والتي هي خارج الكروموسومات دائري جزيئات الحمض النووي، وتقدم استراتيجية لتوليد فعالة من حيث التكلفة، وخالية من التكامل iPSCs ^5. مزيج من ناقلات episomal هو مبين في الجدول 1 التعبير عن عوامل إعادة برمجة OCT4، SOX2، KLF4، MYCL، وLIN28A. يحتوي pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F البلازميد أيضا البروتين p53 shRNA لقمع مؤقت من TP53 لتعزيز إعادة برمجة الخلايا ^6. تكرار نقص pCXWB-EBNA1 ناقلات يعزز التضخيم من عوامل إعادة برمجة وإعادة برمجة زيادة الكفاءة من خلال توفير زيادة عابرة في EBNA1 التعبير ^7. ويمكن أن يضاف البلازميد pCXLE_EGFP إلى خليط nucleofection لغرض DETErmining كفاءة ترنسفكأيشن أو لتطبيقات الخلايا الفرز. باستثناء ص CXWB-EBNA1، البلازميدات episomal المستخدمة في هذا البروتوكول تتضمن أصل فيروس ابشتاين بار من تكاثر الفيروس وEBNA1 الجين، الذي توسط التكرار وتقسيم يصبوغ أثناء انقسام الخلية المضيفة ^8. يتم فقدان episomes تلقائيا مع التوسع التوالي IPSC ^7. استنساخ فرعي وتوصيف iPSCs مع episomal فقدان ناقلات، والتي يمكن استنتاجها من فقدان EGFP التعبير، يمكن أن يؤدي إلى التكامل iPSCs خالية تماما للتطبيقات السريرية في المستقبل.

ملازمة لعملية توليد IPSC هو قمع للجينات محددة النسب وتنشيط الجينات المرتبطة تعدد القدرات. تنظيم التعبير الجيني يحدث على مستويات متعددة داخل النواة، بما في ذلك إدخال تعديلات على الحمض النووي والكروماتين للسماح عوامل النسخ، والعناصر التنظيمية DNA، RNA وصول البلمرة لاستهدافالجينات. إعادة تشكيل المشهد جينية عبر تعديلات الكروماتين العالمية عنصرا رئيسيا لإعادة التعبير عن البرنامج الوراثي تعدد القدرات. وهناك تعديل لونين محدد مهم في تنظيم التعبير الجيني هو أستلة من الهستونات خاصة في بقايا يسين، الذي يسمح بالوصول إلى استهداف الجينات من خلال التوتر انخفض لفائف الدنا هيستون. مثبطات HDAC هي عبارة عن جزيئات صغيرة التي ثبت لتعزيز IPSC إعادة برمجة وHESC التجديد الذاتي ^9،10، من المحتمل بسبب دعم الدولة الأسيتيل ^11. البروتوكول هو موضح أدناه، مقتبسة من منشور مسبق باستخدام lentiviruses دمج ^12، يوفر طريقة خطوة بخطوة لتحسين الجيل IPSC من الدم المحيطي باستخدام episomes ومثبطات HDAC. تركيزات مثبط HDAC المستخدمة هنا هي نصف تلك التي وصفها وير، وآخرون. ^9، وأدت بشكل روتيني لزيادة بنسبة 2 أضعاف في المستعمرات IPSC إعادة برمجة بالكامل خلال معيارepisomal البروتوكولات دون إعادة برمجة مثبطات HDAC. هذا المستوى من إعادة البرمجة على قدم المساواة مع كفاءة نلاحظ مع أساليب lentiviral. باستخدام هذا البروتوكول، ونحن قد ولدت بكفاءة IPSC من الأفراد قديم 87 سنة من العمر.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

مكتوبة المستنيرة، كما وافقت عليها مجالس المراجعة المؤسسية لمركز أبحاث السرطان فريد هاتشينسون والأطفال "في مستشفى فيلادلفيا، تم الحصول عليها من المرضى قبل جمع عينات الدم الطرفية. وحظت جميع المبادئ التوجيهية المؤسسية. جميع التجارب على الحيوانات بما في ذلك توليد MEF و وتمت الموافقة على تشكيل مسخي من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.

1. Ficoll فصل PBMCS وتوسيع الأرومة الحمراء - اليوم 0

1. تمييع الدم المحيطي 1: 1 مع Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS). في 15 مل جولة القاع أنبوب البوليسترين، طبقة بعناية 7 مل من الدم المخفف على 3 مل من درجة حرارة الغرفة Ficoll-Hypaque.
2. الطرد المركزي العينة في 400 x ج لمدة 30 دقيقة.
3. وPBMCs سيكون قد استقر على واجهة بين البلازما وFicoll-Hypaque، ينظر إليها على أنها طبقة بيضاء غائم. باستخدام ماصة نقل معقمة، وجمع PBالمعلقون في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل. تبرزي حجم 10 مل باستخدام DPBS.
4. باستخدام عدادة الكريات، عد PBMCs.
5. ماصة 2 × 10 ⁶ PBMCs إلى 15 مل أنبوب مخروطي منفصل وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. تدور أسفل الخلايا المتبقية وتجميد بتركيز 2 × 10 ⁶ PBMCs / مل في 90٪ مصل بقري جنيني (FBS) سلفوكسيد / 10٪ ميثيل (DMSO).
6. يعد التوسع المتوسطة: QBSF-60 مصل المتوسطة مجانا (حماية من الضوء) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + حمض الاسكوربيك (50 نانوغرام / مل) + خلية الجذعية عامل (SCF، 50 نانوغرام / مل) + 3 انترلوكين (ايل 3، 10 نانوغرام / مل) + الإريثروبويتين (EPO، 2 U / مل) + الأنسولين مثل عامل النمو 1 (IGF-1، 40 نانوغرام / مل) + ديكساميثازون (1 ميكرومتر، وحماية من الضوء، ذوبان الجليد قسامة جديدة كل وسائل الاعلام تغيير).
7. في resuspend 2 × 10 ⁶ PBMCs في 2 مل من تقدم طازجة متوسطة التوسع ومكان في بئر واحدة من 12 لوحة الثقافة الأنسجة جيد واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية مرطب مع جو من 5٪ O ₂ و 5٪ CO _2، و 90٪ N _2.
8. في يوم 3 ويوم 6، يحل محل وسائل الإعلام.
   1. جمع الخلايا ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع أي الخلايا المتبقية.
   2. الطرد المركزي تعليق خلية في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
   3. resuspend الخلايا في 2 مل من جديد التوسع المتوسطة وإعادتها إلى نفس 12 لوحة جيدا.

2. إعادة برمجة الخلايا من خلال Nucleofection - اليوم 9

1. ماصة البلازميدات إلى إعادة برمجة العقيمة 1.5 مل أنبوب إيبندورف (الجدول 1).
2. مزيج الحل nucleofection مع الملحق (المزودة من قبل الشركة المصنعة) وماصة في معقم 1.5 مل إيبندورف أنبوب.
3. ماصة 2 مل من متوسطة التوسع في بئر واحدة من 12 لوحة جيدا ومكان في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O ₂ و 5٪ CO _2، و 90٪ N ₂₎ للموازنة قبل إضافة الخلايا.
4. جمعالخلايا المستزرعة ويغسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60 لجمع الخلايا المتبقية.
5. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف.
6. غسل الخلايا عن طريق إعادة التعليق في 5 مل من DPBS والطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
7. نضح طاف.
8. resuspend الكرية الخلية في 100 ميكرولتر من حل nucleofection + الملحق، مع الحرص على تجنب الفقاعات تولد.
9. ماصة تعليق الخلية في أنبوب يحتوي على البلازميدات إعادة برمجة، ماصة صعودا وهبوطا مرة واحدة، وماصة العينة إلى أسفل كفيت nucleofection.
10. وضع كفيت في الجهاز nucleofection وتشغيل برنامج T-019.
11. نقل 100 ميكرولتر من التوسع prewarmed المتوسطة (من لوحة تحقيق التوازن في الخطوة 2.3) في كفيت nucleofection.
12. على الفور جمع العينة كلها وديعة في البئر من قبل تحسنت التوسع المتوسطة. تجنب جمع البيض، وتطفو حطام الخلايا الميتة.
13. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O ₂ و 5٪ CO _2، و 90٪ N ₂₎ للنمو.

3. طلاء الخلايا المغذية - يوم 10 أو 11

1. في يوم 10، وخلايا لوحة المغذية.
   1. طبقة واحدة 6 جيدا وحة زراعة الأنسجة مع الجيلاتين.
      1. ماصة 1 م من 0.1٪ الجيلاتين في مخزنة المالحة الحل هانك (HBSS) في كل بئر من لوحة.
      2. وضع لوحة في ترطيب الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق على الأقل.
      3. مباشرة قبل الاستخدام، نضح الحل الجيلاتين من لوحة.
   2. ذوبان الجليد قارورة واحدة من 2 × 10 ⁶ الخلايا الليفية الماوس الجنينية المشع في 3000 CGY إلى 10 مل من prewarmed MEF الإعلام (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) + FBS (10٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪)).
   3. الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق، ونضح طاف. resuspend الخلايا في 12 مل من MEF الإعلام وماصة 2 مل طn لكل بئر من الجيلاتين المغلفة 6 لوحة جيدا. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O ₂ و 5٪ CO _2، و 90٪ N ₂₎ حتى يوم 12.

4. طلاء الخلايا في الخلايا المغذية وتغيير المتوسطة - اليوم 12

1. جمع الخلايا nucleofected في واحدة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل وجمع أي الخلايا المتبقية قبل غسل جيدا مع 2 مل من QBSF-60. الطرد المركزي العينة في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
2. إعداد إعادة برمجة المتوسطة: Iscove في التعديل متوسطة Dulbecco و(IMDM) + FBS (10٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + غير الاساسيين من الأحماض الأمينية (NEAA، 1٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + β -mercaptoethanol (0.1 مم) + عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF وأضاف العذبة في التغذية، و 10 نانوغرام / مل) + حمض الأسكوربيك (أضاف طازجة في التغذية، 50 ميكروغرام / مل).
3. نضح وطاف resuspend الخلايا في 12 مل من إعادة برمجة متوسطة. ماصة 2 مل لكل بئر من تعليق خلية فيلوحة 6 جيدا من الخلايا المغذية (كما أعدت في القسم 3). أجهزة الطرد المركزي لوحة في 50 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
4. وضع لوحة في ترطيب 37 درجة مئوية الحاضنة (5٪ O ₂ و 5٪ CO _2، و 90٪ N ₂₎ للنمو. تغيير متوسطة إعادة برمجة كل يوم حتى تبدأ المستعمرات IPSC الظهور (1-2 أسابيع).
5. إعداد HESC المتوسطة: DMEM / F12 1: 1 + خروج المغلوب استبدال المصل (20٪) + البنسلين / الستربتومايسين (1٪) + NEAA (1٪) + غير الحيوانية L-الجلوتامين (1 ملم) + البيروفات الصوديوم (1٪) + بيكربونات الصوديوم (0.12٪) + β المركابتويثانول (0.1 مم) + bFGF (أضيف جديدا في التغذية، و 10 نانوغرام / مل)
6. تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، حمض suberanilohydroxamic (SAHA وأضاف العذبة في تغذية، و 200 نيوتن متر). مرة تظهر المستعمرات IPSC، تبدأ تغذية الخلايا مع مثبطات HESC المتوسطة + HDAC، وتغيير المتوسطة كل يوم.
   ملاحظة: الزبدات الصوديوم هو جزيء صغير يتم كثف لأنابيب بلاستيكية، رherefore تخزينه في أنبوب زجاجي البورسليكات في 4 درجات مئوية.

5. النسخ عزل IPSC

1. مرة واحدة المستعمرات IPSC هي كبيرة بما يكفي لتكون معزولة (20-25 الخلايا)، اعتقالهما مع ماصة P20.
2. تعد مثبطات HDAC: الزبدات الصوديوم (مضافة جديدة في التغذية، و 100 ميكرومتر)، SAHA (مضافة جديدة في التغذية، و 200 نانومتر)
3. وضع المستعمرات المعزولة على iMEFs الفردية في 35 ملم الأطباق التي تحتوي على مثبطات HESC المتوسطة + + HDAC الاستنساخ والانتعاش الملحق.
4. اليوم بعد حصوله على المستعمرات، وتغيير وسيلة لمثبطات HESC المتوسطة + HDAC.
5. تغيير متوسطة كل يوم حتى المستعمرات IPSC جاهزة للالركض.
6. إزالة مثبطات HDAC من المتوسط ​​مرة واحدة تستقر في المستعمرات مرور 2-3.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

النتائج

بعد ثلاثة أيام nucleofection وقبل طلاء الخلايا nucleofected على iMEFs، ينبغي تقدير كفاءة nucleofection ناجحة بواسطة المجهر مضان لEGFP الشكل 1 يبين تجربة نموذجية nucleofection مع ما يقرب من 5-10٪ من مجموع السكان خلية معربا عن EGFP.

وسوف تبدأ المستعمرات IPSC ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

لتوليد IPSC الناجح عند استخدام هذا البروتوكول، وهناك العديد من المحاذير المهمة التي ينبغي النظر فيها. خلال مرحلة التوسع أرومة الحمراء، ينبغي اتباع الجدول الزمني للتغيير وسائل الإعلام بدقة، والانحرافات قد يؤدي إلى تحفيز فعال من السكان خلية سلفية الهدف وكفاءة أقل من ج?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4 °C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624