דור יעיל iPS תא מהדם באמצעות Episomes וHDAC המעכבים

Summary

כאן אנו מתארים פרוטוקול להפקת תאי גזע pluripotent אנושי הנגרם מהדם היקפי באמצעות אסטרטגית תכנות מחדש episome מבוסס ומעכבי היסטון deacetylase.

Abstract

כתב יד זה מדגים פרוטוקול ליעילות יצירת תאים ללא אינטגרציה אנושית הנגרם גזע pluripotent (iPSCs) מהדם היקפי באמצעות פלסמידים episomal וdeacetylase היסטון מעכבים (HDAC). היתרונות של גישה זו כוללים: (1) השימוש בכמות מינימאלית של דם היקפי כחומר מקור; (2) nonintegrating וקטורי תכנות מחדש; שיטה חסכונית ליצירת iPSCs החופשי וקטור (3); transfection יחיד (4); ו- (5) השימוש במולקולות קטנות כדי להקל על תכנות מחדש אפיגנטיים. בקצרה, תאים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) מבודדים מדגימות לקיחת דם שגרתיות ולאחר מכן בתרבית גורמי גדילה מוגדרת להניב אוכלוסיית תא אב כדורית אדומה שגשוג מאוד כי להפליא ניתן לתכנות מחדש. Nonintegrating, פלסמידים episomal nontransmissible להביע Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, וסיכת ראש קצרה RNA p53 (SH) הם introduCED לerythroblasts נגזר באמצעות nucleofection יחיד. Cotransfection של episome שמבטא משופר חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP) מאפשר זיהוי קל של תאי transfected. פלסמיד כפול מחסרת נפרד להביע אפשטיין-באר אנטיגן הגרעיני 1 (EBNA1) הוא גם הוסיף לתערובת התגובה לביטוי מוגבר של חלבוני episomal. אז תאי transfected הם מצופים על שכבת פיברובלסטים עכבר המוקרן עובריים (iMEFs) לתכנות מחדש המשיך. ברגע שהמושבות כמו-iPSC מופיעות בכ-עשרה ימים לאחר nucleofection, מעכבי HDAC מתווספים למדיום כדי להקל על שיפוץ אפיגנטיים. מצאנו כי הכללת מעכבי HDAC באופן שגרתי מגבירה את הדור של מושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על ידי 2 קיפול. ברגע שמושבות iPSC להציג מורפולוגיה טיפוסית של תאי גזע עובריים אנושיים (hESC), הם מועברים בעדינות לצלחות אישיות מצופות iMEF רקמת תרבות לצמיחה והתרחבות.

Introduction

iPSCs נגזרים מרקמות סומטיות באמצעות ביטוי חוץ-רחמי של מספר מינימלי של גני pluripotency. טכניקה זו הייתה בתחילה הודגמה על ידי התמרה retroviral של פיברובלסטים אנושיים עם Oct4, Sox2, KLF4, וcMYC, אשר באות לידי ביטוי ביותר במדינת pluripotent ^1. זמנית הביעו "גורמי תכנות מחדש" אלה לשנות את פרופיל הביטוי של תא המטרה אפיגנטיים נוף והגן דומה לתאי גזע עובריים אנושיים ^2. לאחר שנוצר, iPSCs יכול להיות מובחן פוטנציאלי לכל סוג רקמה לחקירה נוספת. כך, יש להם הבטחה לשימוש ברפואת רגנרטיבית, דוגמנות מחלה, ויישומי ריפוי גנטי. עם זאת, לשבש את הגנום עם וירוסי שילוב יש את הפוטנציאל לשנות את ביטוי הגנים אנדוגני, פנוטיפ הסלולר השפעה, וסופו של דבר מטה את תוצאות מדעיות. יתר על כן, אינטגרציה נגיפית אקראית יכולה להוביל לדואר סלולארי מזיקffects, כולל האפשרות לשינוי ממאיר ³ מחדש או ביטוי של הגנים המושתלים שעור ^4. יישומים קליניים בעתיד ידרשו דור iPSC-שילוב שאינו.

Episomes, שהם מולקולות הדנ"א בכרומוזומים מעגליים נוספות, מציע אסטרטגיה ליצירת iPSCs חסכוני, ללא אינטגרציה ^5. השילוב של וקטורי episomal מוצגים בטבלה 1 להביע את תכנות מחדש של גורמי Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, וLIN28A. פלסמיד pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F מכיל גם p53 shRNA לדיכוי זמני של TP53 כדי לשפר את תכנות מחדש של תאי ^6. וקטור pCXWB-EBNA1 חסר השכפול מקדם הגברה של גורמי תכנות מחדש ויעילות תכנות מחדש מוגברת על ידי מתן עלייה זמנית בביטוי EBNA1 ^7. פלסמיד pCXLE_EGFP ניתן להוסיף לתערובת nucleofection לצורך Determining יעילות transfection או ליישומי מיון תא. למעט CXWB-EBNA1 p, פלסמידים episomal שימוש בפרוטוקול זה מכילים את מקור נגיף אפשטיין-באר בשכפול נגיף וגן EBNA1, אשר מתווך שכפול וחלוקת episome במהלך חלוקת התא המארח ^8. Episomes באופן ספונטני לאיבוד עם התרחבות iPSC רצוף ^7. Subcloning ואפיון של iPSCs עם אובדן וקטור episomal, שניתן להסיק מאובדן של ביטוי eGFP, יכולים להוביל ללחלוטין iPSCs החופשי אינטגרציה ליישומים קליניים בעתיד.

טבוע בתהליך של דור iPSC הוא דיכוי של גנים ספציפיים שושלת והפעלה מחדש של גנים הקשורים pluripotency. רגולציה של ביטוי גנים מתרחשת במספר הרמות בתוך הגרעין, ובכלל זה שינויים ב- DNA והכרומטין כדי לאפשר גורמי שעתוק, רצפי דנ"א רגולציה, וגישה RNA פולימראז למקדגנים. עיצוב מחדש של הנוף ההתווצרותי באמצעות שינויי הכרומטין הגלובליים הוא מרכיב מרכזי מחדש ביטוי של התכנית הגנטית pluripotency. שינוי הכרומטין ספציפי שהוא חשוב בויסות של ביטוי גנים הוא acetylation של ההיסטונים בשאריות ליזין מסוימים, המאפשר גישה ליעד גנים באמצעות מתח נמוך יותר של סליל היסטון-DNA. מעכבי HDAC הם מולקולות קטנות אשר הוכחו כדי לשפר את תכנות מחדש iPSC וhESC התחדשות עצמית ^9,10, ככל הנראה בשל תמיכה מדינת acetylated ^11. הפרוטוקול המתואר להלן, שהותאם מפרסום קודם באמצעות lentiviruses שילוב ^12, מספק שיטת צעד-אחר-צעד לדור iPSC מותאם מepisomes באמצעות דם היקפי ומעכבי HDAC. ריכוזי מעכב HDAC משמשים כאן הם חצי מאלה המתוארים על ידי ור, et al ^9., והובלתי באופן שגרתי לעלייה של 2 לקפל במושבות iPSC לתכנות מחדש באופן מלא על תקןפרוטוקולי תכנות מחדש episomal ללא מעכבי HDAC. רמה זו של תכנות מחדש היא באחידות עם היעילות שאנו רואים עם שיטות lentiviral. שימוש בפרוטוקול זה, יש לנו ביעילות שנוצר iPSC מאנשים זקנים כמו 87 שנים של גיל.

Protocol

כתב הסכמה מדעת, כפי שאושר על ידי ועדות הביקורת המוסדית של המרכז לחקר סרטן פרד האצ'ינסון והילדים "בית החולים של פילדלפיה של, התקבל מחולים לפני איסוף דגימות דם היקפיים. כל ההנחיות מוסדיות נצפו. כל הניסויים בבעלי החיים, כולל דור MEF ו היווצרות תפלצת אושרה על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים המוסדיים.

1. הפרדת Ficoll של PBMCs והרחבת Erythroblasts - יום 0

1. לדלל דם היקפי 1: 1 עם בופר פוספט של Dulbecco (DPBS). בתוך צינור קלקר מסביב לתחתית 15 מיליליטר, שכבה בזהירות 7 מיליליטר של דם מדולל על 3 מיליליטר של בטמפרטורת חדר Ficoll-Hypaque.
2. צנטריפוגה המדגם ב 400 XG למשך 30 דקות.
3. PBMCs תהיה התיישבו לממשק בין הפלזמה וFicoll-Hypaque, נתפס כשכבת לבנה מעונן. בעזרת פיפטה העברת סטרילי, לאסוף את PBמנחים לתוך צינור חרוטי אחד 15 מיליליטר. תביא את הנפח ל 10 מיליליטר באמצעות DPBS.
4. באמצעות hemacytometer, לספור את PBMCs.
5. פיפטה 2 × 10 ⁶ PBMCs לתוך צינור נפרד 15 מיליליטר חרוטי ו צנטריפוגות ב XG 300 במשך 5 דקות. ספין למטה תאים וההקפאה נותרו בריכוז של 2 × 10 ⁶ מיליליטר / PBMCs ב -90% בסרום שור העובר (FBS) sulfoxide דימתיל / 10% (DMSO).
6. הכן הרחבה בינונית: מדיום חופשי QBSF-60 בסרום (להגן מפני אור) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + חומצה אסקורבית (50 ng / ml) + גזע גורם תא (SCF, 50 ng / ml) + interleukin 3 (אִי- גורם 3, 10 ng / ml) + אריתרופויאטין (EPO, 2 U / ml) + אינסולין כמו צמיחה 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + דקסמתזון (1 מיקרומטר; להגן מפני אור; להפשיר aliquot טרי בכל אמצעי תקשורת לשנות).
7. Resuspend 2 × 10 ⁶ PBMCs 2 מיליליטר של הרחבה בינונית טריה ומקום לתוך אחד היטב צלחת תרבות 12 רקמות היטב דגירה בחממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% O _2, 5% CO _2, ו -90% N _2.
8. ביום 3 ויום 6, להחליף תקשורת.
   1. לאסוף את התאים ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 כדי לאסוף את כל תאים שנותרו.
   2. צנטריפוגה ההשעיה תא XG ב 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
   3. Resuspend התאים 2 מיליליטר של מדיום הרחבה החדש ולהחזיר אותם לאותה הצלחת גם 12.

2. תאי תכנות מחדש על ידי nucleofection - יום 9

1. פיפטה פלסמידים תכנות מחדש לתוך צינור סטרילי 1.5 מיליליטר אפנדורף (טבלת 1).
2. מערבבים את פתרון nucleofection עם תוספת (שסופק על ידי יצרן) וטפטפתי לתוך צינור אפנדורף 1.5 מיליליטר סטרילי.
3. פיפטה 2 מיליליטר של הרחבה בינונית ולאחת מצלחת גם 12 ומקום בחממה 37 מעלות צלזיוס humidified (5% O _2, 5% CO _2, ו -90% N ₂₎ לאיזון לפני הוספת תאים.
4. אסוףתאים בתרבית ולשטוף היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60 לאיסוף תאים שנותרו.
5. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant.
6. לשטוף את התאים על ידי resuspending ב 5 מיליליטר של DPBS וצנטריפוגה XG ב 300 במשך 5 דקות.
7. לשאוב supernatant.
8. Resuspend התא גלולה בפתרון nucleofection + תוספת 100 μl, לטפל כדי למנוע בועות יצירה.
9. פיפטה ההשעיה התא לתוך הצינור המכיל פלסמידים תכנות מחדש, פיפטה למעלה ולמטה פעם אחת, ופיפטה המדגם לתוך החלק התחתון של קובט nucleofection.
10. הנח את קובט לתוך מכשיר nucleofection ולהפעיל תכנית T-019.
11. העברת הרחבת prewarmed בינונית (מצלחת equilibrating בשלב 2.3) 100 μl לקובט nucleofection.
12. מייד לאסוף את כל מדגם והפקדה לתוך הבאר של הרחבה בינונית מחוממת מראש. הימנע מאיסוף הפסולת הלבנה, צף המתה התא.
13. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O _2, 5% CO _2, ו -90% N ₂₎ לצמיחה.

3. תאי מזין ציפוי - יום 10 או 11

1. ביום 10, תאים מזינים צלחת.
   1. צלחת מעיל אחד 6 גם תרבית רקמה עם ג'לטין.
      1. פיפטה 1 ג'לטין מ 'של 0.1% בנאגרו מלוח הפתרון של האנק (HBSS) לבאר כל הצלחת.
      2. מניחים את הצלחת 37 מעלות צלזיוס חממת humidified במשך לפחות 5 דקות.
      3. מייד לפני השימוש, לשאוב את פתרון ג'לטין מהצלחת.
   2. להפשיר בקבוקון אחד של 2 fibroblasts העוברי × 10 ⁶ עכבר מוקרן ב3,000 cGy ל -10 מיליליטר של MEF מדיה prewarmed (הנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) + FBS (10%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%)).
   3. צנטריפוגה התאים ב XG 300 במשך 5 דקות ולשאוב supernatant. Resuspend התאים 12 מיליליטר של MEF מדיה ופיפטה 2 מיליליטר in כדי היטב בכל 6 הצלחת גם ג'לטין מצופה. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O _2, 5% CO _2, ו -90% N ₂₎ עד ליום 12.

4. תאי ציפוי בתאים מזין ושינוי בינוני - יום 12

1. לאסוף את תאי nucleofected לאחת צינור חרוטי 15 מ"ל ולאסוף את כל תאים שנותרו על ידי שטיפה היטב עם 2 מיליליטר של QBSF-60. צנטריפוגה המדגם XG ב 300 במשך 5 דקות.
2. הכן תכנות מחדש בינוני: של Iscove השתנה בינוני של Dulbecco (IMDM) + FBS (10%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + שאינו חיוני חומצות אמינו (NEAA, 1%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF, הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml) + חומצה אסקורבית (הוסיף טרי בהאכלה, 50 מיקרוגרם / מיליליטר).
3. לשאוב supernatant וresuspend התאים 12 מיליליטר של תכנות מחדש בינוני. פיפטה 2 מיליליטר לכל טוב של ההשעיה התא לתוךצלחת 6 היטב של תאים מזינים (כפי שהוכן בסעיף 3). צנטריפוגה את הצלחת ב 50 XG למשך 30 דקות בטמפרטורת חדר.
4. מניחים את הצלחת בחממה humidified 37 ° C (5% O _2, 5% CO _2, ו -90% N ₂₎ לצמיחה. לשנות את תכנות מחדש בינוני בכל יום אחר עד מושבות iPSC מתחילות להופיע (1-2 שבועות).
5. הכן hESC בינוני: DMEM / F12 1: 1 + החלפת נוק סרום (20%) + פניצילין / סטרפטומיצין (1%) + NEAA (1%) + L-גלוטמין שאינם בעלי חיים (1 מ"מ) + פירובט נתרן (1%) + סודיום ביקרבונט (0.12%) + β-mercaptoethanol (0.1 מ"מ) + bFGF (הוסיף טרי בהאכלה, 10 ng / ml)
6. הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), חומצת suberanilohydroxamic (סח"ה, הוסיפה טרי בהאכלה, 200 ננומטר). ברגע שמושבות iPSC מופיעות, להתחיל להאכיל את התאים עם מעכבי hESC בינוני + HDAC, שינוי בינוני בכל יום.
   הערה: בוטיראט נתרן הוא מולקולה קטנה שנספחה לצינורות פלסטיק, therefore לאחסן אותו בצינור זכוכית בורוסיליקט על 4 מעלות צלזיוס.

5. משובט בידוד iPSC

1. ברגע שמושבות iPSC הם גדולות מספיק כדי להיות מבודדים (20-25 תאים), לאסוף אותם עם טפטפת P20.
2. הכן מעכבי HDAC: וטיראט נתרן (הוסיף טרי בהאכלה, 100 מיקרומטר), סח"ה (הוסיף טרי בהאכלה, 200 ננומטר)
3. הנח את המושבות מבודדות על iMEFs ב -35 מנות מ"מ בודדות המכילות מעכבי hESC בינוני + HDAC + תוספת שיבוט ושחזור.
4. היום לאחר קטיף המושבות, לשנות את המדיום למעכבי hESC בינוני + HDAC.
5. לשנות את המדיום כל יום עד מושבות iPSC מוכנות לpassaging.
6. הסר מעכבי HDAC מהמדיום פעם אחת מושבות יתייצבו במעבר 2-3.

תוצאות

שלושה ימים לאחר nucleofection ולפני ציפוי תאי nucleofected על iMEFs, את היעילות של nucleofection המוצלח צריכה להיות מוערכת על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי לeGFP. איור 1 מציג ניסוי nucleofection טיפוסי עם כ 5-10% מאוכלוסיית התא הכוללת להביע eGFP.

מושבות iPSC תכ?...

Discussion

עבור דור iPSC מוצלח בעת שימוש בפרוטוקול זה, יש כמה אזהרות חשובות שיש לקחת בחשבון. בשלב התרחבות erythroblast, לוח הזמנים של שינוי התקשורת צריך להיות רק אחריו, כסטיות עלולות להוביל לגירוי לא יעיל של אוכלוסיית תא אב היעד ויעילות נמוכה יותר של דור iPSC. זה חשוב לעשות בינוני הרחבה חד?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4 °C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624