Epizomlar ve HDAC inhibitörleri kullanarak Blood Verimli iPS Hücre Üretimi

Özet

Burada bir episomuna göre yeniden programlama strateji ve histon deasetilaz inhibitörleri kullanılarak periferal kandan alınan insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesi için bir protokol açıklar.

Özet

Bu yazıda verimli episomal plazmitlerini ve histon deasetilaz (HDAC) inhibitörleri kullanılarak periferik kandan entegrasyonu-özgür insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerini (iPSCs) oluşturmak için bir protokol göstermektedir. Bu yaklaşımın avantajı şunlardır: (1) bir kaynak malzeme olarak periferal kan minimal bir miktarda kullanımı; (2) yeniden programlama vektörleri nonintegrating; (3) vektörü bilgilerini iPSCs üretilmesi için ekonomik bir yöntem; (4) tek bir transfeksiyon; ve (5) küçük moleküllerin kullanımı epigenetik yeniden programlama kolaylaştırmak için. Tekrar programlanması için oldukça müsait bir yüksek proliferatif eritrosit projenitör hücre popülasyonu elde etmek için kısa bir süre, periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC), rutin flebotomi örnekleri izole edilir ve tanımlanmamış başka büyüme faktörleri içinde kültürlenmiştir. Nonintegrating, Oct4, Sox2, Klf4 MYCL, LIN28A ve p53 kısa saç tokası (sh) RNA'yı ifade bulaşıcı olmayan epizomal plasmidleri introdu vardırTek nucleofection ile türetilmiş eritroblast içine ced. Yeşil floresan proteini gelişmiş sentezleyen bir epizom (eGFP) olarak kotransfeksiyon transfekte hücrelerin kolay tanımlama sağlar. Epstein-Barr çekirdek antijeni 1 (EBNA1) ifade eden ayrı bir replikasyon-eksikli Plazmid aynı zamanda epizomal proteinlerin artan ekspresyonu için, reaksiyon karışımına ilave edilir. Transfekte edilmiş hücreler daha sonra, sürekli tekrar programlanması için ışınlanan fare embriyonik fibroblastlar (iMEFs) bir tabaka üzerine kaplanır. En kısa iPSC gibi koloniler nucleofection sonra yaklaşık on iki gün sonra ortaya çıktıkça, HDAC inhibitörleri epigenetik yenileme kolaylaştırmak için ortama ilave edilir. Biz, HDAC inhibitörlerinin dahil rutin olarak 2 kat kadar tam olarak yeniden programlanması iPSC kolonilerin oluşturulmasına arttırdığını bulduk. IPSC koloniler tipik insan embriyonik kök hücre (HESC) morfoloji kez, yavaşça sürekli büyüme ve genişleme için bireysel Imef kaplı doku kültürü plakalarına aktarılır.

Giriş

iPSCs pluripotense genlerin en az sayıda ektopik ekspresyonu ile somatik dokularından elde edilmektedir. Bu teknik, ilk olarak yüksek bir pluripotent durumda ¹ olarak ifade edilmiştir Oct4, Sox2, Klf4 ve c-myc insan fibroblastları, retroviral kalıt ile gösterilmiştir. Bu geçici ifade "yeniden programlama faktörleri" insan embriyonik kök hücreleri ² hedef hücrenin epigenetik peyzaj ve gen ifadesi profili benzer değiştirebilir. Oluşturulan kez, iPSCs potansiyel ileri soruşturma için herhangi bir doku tipinin içine ayırt edilebilir. Böylece, rejeneratif tıpta, hastalık modelleme ve gen terapisi uygulamalarında kullanılmak için umut vermektedir. Ancak, entegre virüs ile genomu bozan endojen gen ifadesinin, etkisi hücresel fenotip değiştirme potansiyeline sahiptir, ve sonuçta bilimsel sonuçlarını taraflı. Ayrıca, rastgele viral entegrasyonlar zararlı hücresel e yol açabilirmalign transformasyon ³ veya onkojenik transgenlerin ⁴ yeniden ifade olasılığı dahil olmak üzere fektleri. Gelecekteki klinik uygulamalar, entegre iPSC nesil gerektirir.

Ekstra kromozomal dairesel DNA molekülleri epizomları, maliyet etkin, entegrasyon-ücretsiz iPSCs ⁵ üretmek için bir strateji sunar. Tablo 1 'de gösterilen epizomal vektörlerin kombinasyonu yeniden programlama Oct4, Sox2, Klf4 MYCL ve LIN28A faktörleri ifade eder. PCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F Plazmid aynı zamanda hücre yeniden programlama ⁶ geliştirmek için TP53 geçici bastırılması için bir p53 shRNA içerir. Çoğaltma eksik pCXWB-EBNA1 vektör EBNA1 ifade ⁷ geçici bir artışa sağlayarak yeniden programlama faktörleri büyütülmesine ve artan yeniden programlama verimliliğini teşvik. PCXLE_EGFP plazmid deterjanları amacıyla nucleofection karışımına ilave edilebilirhücre tasnif uygulamalar için transfeksiyon verimliliğinin veya rmining. P CXWB-EBNA1 dışında, bu protokolde kullanılan epizomal plasmidleri konakçı hücrenin, ⁸ bölünme sırasında replikasyonu ve epizom bölümü vasıta olan viral replikasyon ve EBNA1 gen, Epstein-Barr virüsü kopyalama kaynağını kullanır. Epizomları kendiliğinden ardışık iPSC genişleme ⁷ ile kaybolur. Alt-klonlama ve EGFP ifade kaybı anlaşılacağı epizomal vektör kaybı ile iPSCs karakterizasyonu, gelecekte yapılacak klinik uygulamalarda tamamen entegrasyon bilgilerini iPSCs yol açabilir.

IPSC nesil işleminden dolayı soyundan bir genin bastırılması ve pluripotense ilişkili genlerin reaktivasyonu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesi hedef transkripsiyon faktörleri için DNA'nın ve kromatin modifikasyon, düzenleyici DNA elemanları, RNA polimeraz erişimi, çekirdek içinde birden fazla seviyede gerçekleşirgenleri yer alır. Küresel kromatin modifikasyonları ile epigenetik manzara Tadilat yeniden ifade için önemli bir bileşeni Pluripotency genetik program olduğunu. Gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli olan bir özel kromatin modifikasyon histon-DNA bobinin azalma gerilim üzerinden hedef genlere erişim sağlar, özellikle lizin kalıntıları ile histonların asetilasyon, bir. HDAC inhibitörleri, bağlı asetillenmiş durumunu ¹¹ desteklenmesi için muhtemelen iPSC yeniden programlama ve HESC kendini yenileme ^9,10 artırmak için gösterilmiştir küçük moleküllerdir. Entegre lentivirüsler ¹² kullanan önceki bir yayında uyarlanan Aşağıda tarif edilen protokol, periferal kan kullanılarak epizomlar ve HDAC inhibitörleri optimize iPSC üretimi için bir adım-adım bir yöntem sağlar. Burada kullanılan adı geçen HDAC inhibitörü konsantrasyonları Ware tarafından tarif edilenler yarısı olan, ve ark., ⁹ ve rutin standart üzerinde tam Yeniden programlanan iPSC kolonideki 2 kat artışa yol açmıştırHDAC inhibitörleri olmadan episomal yeniden programlama protokolleri. Yeniden programlama Bu düzeyde Lentiviral yöntemleri ile dikkat verimliliği ile eşit olduğunu. Bu protokolü kullanarak, verimli yaş 87 yıl gibi eski kişilerden iPSC yarattı.

Protokol

Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Kurumsal Değerlendirme Kurulları ve Çocuklar "ın Philadelphia Hastanesi tarafından onaylanan, yazılı izin, periferik kan örneği alınmadan önce hastalardan elde edilmiştir. Tüm kurumsal düzenlemeler gözlendi. MEF nesil dahil olmak üzere tüm hayvan deneyleri ve teratom oluşumu Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

PBMC'lerin ve eritroblast Genişleme 1. Ficoll Ayırma - Gündüz 0

1. Dulbecco Fosfat Tamponlu Salin (DPBS) ile 1: Çevresel kan 1 seyreltin. Bir 15 ml'lik yuvarlak dipli bir polistiren bir tüpte, dikkatli bir şekilde oda sıcaklığında, Ficoll-Hypaque 3 ml'lik seyreltilmiş kan 7 ml katman.
2. 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
3. PBMC'ler plazma ve bulanık beyaz bir tabaka halinde görülmektedir Ficoll-Hypaque arasındaki arayüz yerleşmiş olacaktır. Steril bir transfer pipet kullanarak, PB toplamakBir 15 ml konik tüp içine MH'si. DPBS kullanarak 10 ml ses getirmek.
4. Hemasitometre, PBMC'Ierde saymak.
5. 5 dakika boyunca 300 xg'de ayrı 15 ml konik tüp ve santrifüj içine Pipet 2 × 10 ⁶ PBMC'leri. % 90 fetal sığır serumu (FBS) /% 10 dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 2 x 10 ⁶ PBMC / ml lik bir konsantrasyonda kalan hücrelerin ve dondurularak aşağı doğru dönerler.
6. Genişletme maddesi hazırlayın: QBSF-60 serum barındırmayan ortam hücre faktörü (ışıktan koruma) + Penisilin / streptomisin (% 1) + askorbik asit (50 ng / ml) + kök (SCF, 50 ng / ml) + interlökin 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoietin (EPO, 2 U / ml) +, insülin benzeri büyüme faktörü 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + deksametazon (1 uM, ışıktan korumak, taze bir kısım çözülme her medya ) değiştirebilirsiniz.
7. Taze genleşme maddesi, 2 ml içinde süspanse 2 x 10 ⁶ PBMC 12 çukurlu bir doku kültür plakasının bir oyuğuna yerleştirmek ve 5 olan bir atmosfere sahip 37 ° C nemlendirilmiş inkübatör% _O2,% 5 _CO2 ve% 90 _N2.
8. Gün 3 ve 6. günde, ortamı değiştirin.
   1. Hücreleri toplamak ve kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın.
   2. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre süspansiyonu santrifüj ve süpernatant aspire.
   3. Yeni Genişleme Orta 2 ml hücreleri tekrar ve aynı 12 plaka onları geri.

Nucleofection tarafından 2. yeniden programlanması Hücreler - Gün 9

1. Steril bir 1.5 mi Eppendorf tüpüne (Tablo 1) yeniden programlama plazmidleri Pipet.
2. Steril 1.5 ml'lik Eppendorf tüpü içine Supplement (imalatçısı tarafından sağlanan) ve pipet ile nucleofection çözelti karıştırın.
3. Pipet 2, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör içinde 12 oyuklu plaka ve yer arasında bir oyuğuna genişletme maddesi (% 5 _O2,% 5 _CO2 ve% 90 _N2) önce hücreler ilave edilmeden dengeleme için mi.
4. Toplamakkültürlenmiş hücreler kalan hücrelerin toplanması için QBSF-60, 2 ml ile iyice yıkayın ve.
5. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire.
6. DPBS 5 ml yeniden süspansiyon haline getirilmesini ve 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile hücreler yıkayın.
7. Süpernatant aspire.
8. Üreten kabarcıkları önlemek için özen, nucleofection solüsyonu + Supplement 100 ul hücre pelletini.
9. Aşağı bir kez yeniden programlama plazmidler, pipet ve içeren tüp içine hücre süspansiyonu pipetle ve nucleofection küvetinin dibine örnek pipetle.
10. Nucleofection makinenin içine küvet ve çalıştırmak Programı T-019 yerleştirin.
11. Nucleofection küvetin içine (Adım 2.3 dengelenmesi plaka) prewarmed Expansion Orta 100 ul aktarın.
12. Hemen önceden ısıtılmış Genişleme Orta kuyuya tüm örnek ve mevduat toplamak. Beyaz, yüzen ölü hücre artıkları toplama kaçının.
13. Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 _O2,% 5 _CO2 ve% 90 _N2) altında levhayı yerleştirin.

3. Kaplama Besleyici Hücreler - Gün 10 ya da 11

1. 10. günde, levha besleyici hücreler.
   1. Jelatin ile kaplayın, bir 6 oyuklu doku kültürü plakası.
      1. Pipet, plakanın her oyuğuna Hank Tamponlu Tuz Çözeltisi (HBSS) içinde 1 M,% 0.1 jelatin.
      2. En az 5 dakika süreyle, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör plaka koyun.
      3. Kullanmadan hemen önce, plakadan jelatin solüsyonu aspire.
   2. Ön ısıtması yapılan MEF Media (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (% 10) + Penisilin / streptomisin (% 1)), 10 ml 3,000 cGy ile ışımaya 2 x 10 ⁶ fare embriyonik fibroblastlar bir şişe çözülme.
   3. 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri Santrifüj ve süpernatant aspire. 12 MEF Medya ml ve pipet 2 ml hücreleri tekrar süspansiyon ijelatin kaplı 6 gözlü bir plakanın her bir oyuğuna nGoogle'a. Ortalama 12 olana kadar, bir nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 _O2,% 5 _CO2 ve% 90 _N2) altında levhayı yerleştirin.

4. Besleyici Hücreleri Hücreler Kaplama ve Orta değiştirme - Gün 12

1. Bir adet 15 ml konik tüp nucleofected hücreleri toplamak ve QBSF-60 kuyu ile 2 ml yıkayarak kalan hücreleri toplamak. 5 dakika boyunca 300 x g'de santrifüjleyin.
2. Hazırlama yeniden programlanması Orta: Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) içinde + FBS (% 10) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + esansiyel olmayan amino asitler (NEAA,% 1) + Penisilin / streptomisin (% 1) + β P-mersaptoetanol (0.1 mM) + temel fibroblast büyüme faktörü + Askorbik asit (bFGF besleme, 10 ng / ml taze ilave edilmiş) (50 ug / ml, besleme taze ilave edildi).
3. Süpernatant aspire ve yeniden programlanması Orta 12 ml hücreleri tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonunun oyuk başına Pipet 2 ml 'si içerisinebesleyici hücreler 6 oyuklu plaka (ve Bölüm 3'te hazırlandı). Oda sıcaklığında 30 dakika için 50 x g'de plaka santrifüjleyin.
4. Büyüme için, nemlendirilmiş 37 ° C inkübatör (% 5 _O2,% 5 _CO2 ve% 90 _N2) altında levhayı yerleştirin. IPSC koloniler (1-2 hafta) görünmeye başlaması kadar yeniden programlanması Medium her gün değiştirin.
5. HESC Orta hazırlayın: DMEM / F12 1: 1 + nakavt Serum Replacement (% 20) + penisilin / streptomisin (% 1) + MEM'dir (% 1) + hayvansal olmayan L-glutamin (1 mM) + sodyum piruvat (1%) + sodyum bikarbonat (% 0.12) + β-mersaptoetanol (0.1 mM) +, bFGF (besleme taze ilave edilmiş 10 ng / ml)
6. HDAC inhibitörleri hazırlayın: (besleme taze eklendi, 100 iM) sodyum bütirat, suberanilohydroxamic asit (SAHA, 200 nM, beslenme taze eklendi). IPSC koloniler görünür kez, her gün değişen orta, HESC Orta + HDAC inhibitörleri ile hücrelerini besleyerek başlar.
   Not: Sodyum butirat plastik borular üzerine adsorbe küçük bir molekül olduğu, t'ninherefore 4 ° C'de bir borosilikat cam tüp içinde saklayın.

5. Yalıtımlı iPSC Klonlar

1. IPSC koloni (20-25 hücre) izole edilmesi için yeterince büyük olan bir kez, bir P20 pipet ile çekme.
2. HDAC inhibitörleri hazırlayın: sodyum butirat (beslenme taze eklendi, 100 M), SAHA (200 nM, beslenme taze eklendi)
3. HESC Orta + HDAC inhibitörleri + Klonlama ve Kurtarma eki içeren bireysel 35 mm yemekleri iMEFs üzerine izole koloniler yerleştirin.
4. Gün koloniler toplandıktan sonra, HESC Orta + HDAC inhibitörleri orta değiştirmek.
5. IPSC koloniler geçiş için hazır olana kadar her gün orta değiştirin.
6. Koloniler pasajda 2-3 stabilize bir kez ortamdan HDAC inhibitörleri çıkarın.

Sonuçlar

Üç gün nucleofection sonra iMEFs üzerine nucleofected hücreleri kaplama önce başarılı nucleofection etkinliği eGFP için floresan mikroskobu ile tahmin edilmelidir. 1 EGFP ifade toplam hücre nüfusunun yaklaşık% 5-10, tipik Nucleofection deneyi göstermektedir.

Yeniden programlanan iPSC koloniler nucleofection yaklaşık iki hafta sonra görünmeye başlayacaktır. Koloniler, iyi tanımlanmış sınırlara sahip, genel olarak dairesel olan ve y?...

Tartışmalar

Bu protokolü kullanarak başarılı iPSC nesil için, dikkat edilmesi gereken birkaç önemli uyarılar vardır. Sapmalar hedef progenitör hücre popülasyonunun verimsiz stimülasyonu ve iPSC nesil daha düşük bir verimliliğe neden olabileceğinden erythroblast genişletme aşamasında, ortam değiştirme programı sıkı, takip edilmelidir. Her ortam değişimi ile taze deksametazon ile yeni genişleme orta yapmak önemlidir; ve QBSF-60 taban ortamı deksametazon ve depolama sırasında ışıktan korunmalıdır....

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4 °C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624