Generazione efficiente delle cellule iPS da Blood Utilizzando episomi e HDAC inibitori

Riepilogo

Qui si descrive un protocollo per la generazione di cellule staminali umane pluripotenti indotte dal sangue periferico mediante una strategia di riprogrammazione episoma based e inibitori delle istone deacetilasi.

Abstract

Questo manoscritto illustra un protocollo per la creazione efficiente umani indotti cellule senza integrazione staminali pluripotenti (iPSCs) da sangue periferico mediante plasmidi episomiale e istone deacetilasi (HDAC). I vantaggi di questo approccio includono: (1) l'uso di una quantità minima di sangue periferico come materiale di base; (2) nonintegrating vettori di riprogrammazione; (3) un metodo conveniente per la generazione di vettori iPSCs liberi; (4) un singolo trasfezione; e (5) l'uso di piccole molecole per facilitare riprogrammazione epigenetica. In breve, le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) sono isolati da campioni salasso di routine e poi coltivate in fattori di crescita definiti per produrre una popolazione di cellule progenitrici degli eritrociti altamente proliferativo che è notevolmente suscettibile di riprogrammazione. Nonintegrating, plasmidi episomiale nontransmissible esprimono OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, LIN28A, e un p53 breve tornante (sh) RNA sono Introdced negli eritroblasti ottenuti tramite un singolo nucleofection. Cotrasfezione di un episoma che esprime migliorato proteina fluorescente verde (eGFP) permette una facile identificazione delle cellule trasfettate. Un plasmide replica carenti separata esprimono Epstein-Barr antigene nucleare 1 (EBNA1) viene anche aggiunto alla miscela di reazione per l'aumentata espressione di proteine ​​episomiale. Le cellule trasfettate sono poi piastrate su uno strato di fibroblasti embrionali di topo irradiati (iMEFs) per continuare la riprogrammazione. Appena colonie IPSC-simili vengono ordinate circa dodici giorni dopo nucleofection, inibitori HDAC vengono aggiunti al mezzo per facilitare rimodellamento epigenetica. Abbiamo trovato che l'inclusione di inibitori HDAC aumenta regolarmente la generazione di colonie IPSC completamente riprogrammato per 2 volte. Una volta che le colonie IPSC presentano tipico di cellule staminali embrionali umane (hESC) morfologia, sono gentilmente trasferiti in piastre di coltura singoli Imef-rivestite di tessuto per la continua crescita ed espansione.

Introduzione

iPSCs sono derivati ​​da tessuti somatici attraverso l'espressione ectopica di un insieme minimo di geni pluripotenza. Questa tecnica è stata inizialmente dimostrata dalla trasduzione retrovirale di fibroblasti umani con OCT4, SOX2, Klf4, e cMyc, che sono altamente espressi nello stato pluripotenti ^1. Questi transitoriamente espressi "fattori di riprogrammazione epigenetica" alterano il paesaggio e profilo di espressione genica della cellula bersaglio analogo alle cellule staminali embrionali umane ^2. Una volta creato, iPSCs potenzialmente può essere differenziato in qualsiasi tipo di tessuto per ulteriori indagini. Così, essi promettenti per l'uso in medicina rigenerativa, modelli di malattia, e applicazioni di terapia genica. Tuttavia, interrompendo il genoma di virus che integrano ha il potenziale per alterare l'espressione del gene endogeno, influenza fenotipo cellulare, e in ultima analisi polarizzare risultati scientifici. Inoltre, integrazioni virali casuali possono portare a deleterio cellulare eFFETTI, compresa la possibilità di trasformazione maligna ³ o ri-espressione dei transgeni oncogeni ^4. Applicazioni cliniche future richiederanno-integrazione non generazione IPSC.

Episomi, che sono cromosomiche circolare in più molecole di DNA, offrono una strategia per generare efficaci, iPSCs senza integrazione dei costi ^5. La combinazione di vettori episomiale di cui alla tabella 1 esprime la riprogrammazione fattori OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, e LIN28A. Il plasmide pCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F contiene anche un p53 shRNA per la soppressione temporanea di TP53 per migliorare la riprogrammazione cellulare ^6. La replica carente pCXWB-EBNA1 vettore promuove l'amplificazione dei fattori di riprogrammazione e di una maggiore efficienza riprogrammazione, fornendo un aumento transitorio della espressione EBNA1 ^7. Il plasmide pCXLE_EGFP può essere aggiunto alla miscela nucleofection ai fini della determining l'efficienza di trasfezione o per applicazioni di separazione delle cellule. Con l'eccezione di p CXWB-EBNA1, i plasmidi episomiale utilizzati in questo protocollo contengono l'origine virus di Epstein-Barr della replicazione virale e geni EBNA1, che mediano la replicazione e la partizione del episoma durante la divisione della cellula ospite ^8. I episomi sono spontaneamente persi con l'espansione successiva IPSC ^7. Subclonaggio e caratterizzazione di iPSCs con episomiale perdita vettore, che può essere dedotta dalla perdita di espressione eGFP, può portare a completamente di integrazione iPSCs gratuiti per future applicazioni cliniche.

Inerente al processo di generazione IPSC è soppressione di geni specifici lignaggio e la riattivazione di geni pluripotenza associati. Regolazione dell'espressione genica avviene a più livelli all'interno del nucleo, comprese le modifiche al DNA e della cromatina per consentire fattori di trascrizione, elementi di DNA di regolazione, e RNA polimerasi accesso per indirizzaregeni. Rimodellamento del paesaggio epigenetico tramite modificazioni della cromatina a livello mondiale è un componente chiave di ri-espressione del programma genetico pluripotenza. Una modifica della cromatina specifico che è importante nella regolazione dell'espressione genica è l'acetilazione degli istoni in particolare i residui di lisina, che consente l'accesso a bersaglio geni attraverso la diminuzione della tensione della bobina istone-DNA. Gli inibitori HDAC sono piccole molecole che hanno dimostrato di migliorare IPSC riprogrammazione e hESC auto-rinnovamento ^9,10, probabilmente dovuto a sostenere lo stato acetilato ^11. Il protocollo descritto di seguito, tratto da una pubblicazione preventiva utilizzando lentivirus che integrano ^12, fornisce un metodo step-by-step per la generazione IPSC ottimizzata dal sangue periferico mediante episomi e inibitori HDAC. Le concentrazioni di inibitori HDAC utilizzate qui sono la metà di quelli descritti da Ware, et hanno regolarmente portato a un aumento di 2 volte completamente riprogrammati colonie IPSC oltre al normale. ^9, eprotocolli di riprogrammazione episomiale senza inibitori HDAC. Questo livello di riprogrammazione è alla pari con l'efficienza che osserviamo con i metodi lentivirali. Usando questo protocollo, abbiamo generato in modo efficiente IPSC da individui vecchi come 87 anni di età.

Protocollo

Scritto consenso informato, come approvato dai Institutional Review Boards del Fred Hutchinson Cancer Research Center e il Children "s Hospital di Filadelfia, è stato ottenuto da pazienti prima di raccogliere campioni di sangue periferico. Sono state rispettate tutte le linee guida istituzionali. Tutti gli esperimenti sugli animali, tra cui la generazione MEF e formazione di teratoma è stato approvato dal Comitato di cura e l'uso degli animali istituzionale.

1. Ficoll Separazione dei PBMC ed espansione degli eritroblasti - Giorno 0

1. Diluire sangue periferico 1: 1 con Dulbecco Phosphate Buffered Saline (DPBS). In un tubo da 15 ml in polistirolo a fondo rotondo, strato attentamente 7 ml di sangue diluito su 3 ml di temperatura ambiente Ficoll-Hypaque.
2. Centrifugare il campione a 400 xg per 30 min.
3. Le PBMC si sono insediati all'interfaccia tra il plasma e il Ficoll-Hypaque, visto come uno strato bianco nuvoloso. Usando una pipetta sterile per il trasferimento, raccogliere il PBMC in un tubo da 15 ml. Portare il volume a 10 ml con DPBS.
4. Utilizzando un emocitometro, contare le PBMC.
5. Pipettare 2 × 10 ⁶ PBMC in un tubo da 15 ml separata e centrifugare a 300 xg per 5 min. Centrifugare le restanti cellule e congelare ad una concentrazione di 2 x 10 ⁶ PBMC / ml nel siero fetale bovino al 90% (FBS) / 10% di dimetilsolfossido (DMSO).
6. Preparare media espansione: terreno privo QBSF-60 nel siero (protegge dalla luce) + penicillina / streptomicina (1%) + acido ascorbico (50 ng / ml) + fattore della cellula staminale (SCF, 50 ng / ml) + interleuchina 3 (IL- 3, 10 ng / ml) + eritropoietina (EPO, 2 U / ml) + insulin-like growth factor 1 (IGF-1, 40 ng / ml) + desametasone (1 mM; riparo dalla luce, scongelare una nuova aliquota ciascun supporto cambiare).
7. Risospendere 2 × 10 ⁶ PBMC in 2 ml di appena fatto medio di espansione e riporre in un pozzetto di una piastra di coltura 12 tessuti bene e incubare a 37 ° C incubatore umidificato con un clima di 5% O _2, 5% di CO _2, e 90% N _2.
8. Il giorno 3 e il giorno 6, sostituire il supporto.
   1. Raccogliere le cellule e lavare il bene con 2 ml di QBSF-60 per raccogliere tutte le cellule rimanenti.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante.
   3. Risospendere le cellule in 2 ml di nuovi media espansione e ritornare allo stesso 12 pozzetti.

2. riprogrammazione delle cellule di Nucleofection - Day 9

1. Pipettare i plasmidi riprogrammazione in una sterile 1,5 ml provetta Eppendorf (Tabella 1).
2. Mescolare la soluzione nucleofection con supplemento (fornita dal produttore) e trasferirli in una provetta sterile da 1,5 ml provetta Eppendorf.
3. Pipettare 2 ml di espansione medio in un pozzetto di una piastra ben 12 e posto in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O _2, 5% di CO _2, e 90% N ₂₎ di equilibramento prima di aggiungere le cellule.
4. Raccogliere ilcellule in coltura e lavare il bene con 2 ml di QBSF-60 per raccogliere le cellule rimanenti.
5. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante.
6. Lavare le cellule da risospendere in 5 ml di DPBS e centrifugazione a 300 xg per 5 min.
7. Aspirare il surnatante.
8. Risospendere il pellet di cellule in 100 ml di soluzione di nucleofection + Supplemento, avendo cura di evitare bolle di generazione.
9. Pipettare la sospensione cellulare nella provetta contenente i plasmidi riprogrammazione, pipettare su e giù una volta, e dispensare il campione nella parte inferiore della cuvetta nucleofection.
10. Posizionare la cuvetta nella macchina nucleofection ed eseguire il programma T-019.
11. Trasferire 100 ml di espansione preriscaldata Media (dalla piastra equilibrante al punto 2.3) nella cuvetta nucleofection.
12. Raccogliere immediatamente l'intero campione e deposito nel pozzetto di pre-riscaldato medio di espansione. Evitare di raccogliere il bianco, detriti cellulari morti galleggianti.
13. Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O _2, 5% di CO _2, e 90% N ₂₎ per la crescita.

3. Placcatura cellule di alimentazione - Giorno 10 o 11

1. Il 10 Giorno, cellule di alimentazione piastra.
   1. Cappotto uno 6 e piastra di coltura tissutale con gelatina.
      1. Pipettare 1 m di 0,1% di gelatina in soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) in ciascun pozzetto della piastra.
      2. Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore per almeno 5 minuti.
      3. Immediatamente prima dell'uso, aspirare la soluzione di gelatina dalla piastra.
   2. Scongelare una fiala di 2 × 10 ⁶ fibroblasti embrionali di topo irradiati a 3.000 cGy in 10 ml di preriscaldata MEF media (Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) + FBS (10%) + di penicillina / streptomicina (1%)).
   3. Centrifugare le cellule a 300 xg per 5 min e aspirare il surnatante. Risospendere le cellule in 12 ml di MEF Media e pipetta 2 ml into ciascun pozzetto della piastra ben 6 gelatina rivestita. Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O _2, 5% di CO _2, e 90% N ₂₎ fino al giorno 12.

4. Placcatura Celle Celle a Feeder e modifica Medium - Giorno 12

1. Raccogliere le cellule nucleofected in un tubo da 15 ml e raccogliere tutte le cellule residue lavando i ben con 2 ml di QBSF-60. Centrifugare il campione a 300 xg per 5 min.
2. Preparare Riprogrammazione Media: Iscove Modified Dulbecco Medium (IMDM) + FBS (10%) + non animale L-glutammina (1 mM) + aminoacidi non essenziali (NEAA, 1%) + di penicillina / streptomicina (1%) + β -mercaptoethanol (0.1 mM) + fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, aggiunte fresca al seno, 10 ng / ml) + acido ascorbico (aggiunte fresca al seno, 50 mg / ml).
3. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 12 ml di riprogrammazione Media. Pipettare 2 ml per pozzetto di sospensione cellulare inla piastra 6 e di cellule di alimentazione (come preparato al punto 3). Centrifugare la piastra a 50 xg per 30 min a temperatura ambiente.
4. Porre la piastra in un umidificata 37 ° C incubatore (5% O _2, 5% di CO _2, e 90% N ₂₎ per la crescita. Cambiare la riprogrammazione medio a giorni alterni fino a quando le colonie IPSC iniziano apparire (1-2 settimane).
5. Preparare hESC Media: DMEM / F12 1: 1 + Knockout siero sostituzione (20%) + di penicillina / streptomicina (1%) + NEAA (1%) + non animale L-glutammina (1 mM) + piruvato di sodio (1%) + bicarbonato di sodio (0,12%) + β-mercaptoetanolo (0,1 mM) + bFGF (aggiunte fresca al seno, 10 ng / ml)
6. Preparare inibitori HDAC: butirrato di sodio (aggiunto a fresco di alimentazione, 100 micron), acido suberanilohydroxamic (SAHA, ha aggiunto fresca al seno, 200 nm). Una volta che appaiono colonie IPSC, iniziare a nutrire le cellule con inibitori HDAC hESC Medium +, cambiando mezzo di tutti i giorni.
   NOTA: butirrato di sodio è una piccola molecola che viene adsorbito in provette di plastica, therefore conservarlo in una provetta di vetro borosilicato a 4 ° C.

5. Cloni isolamento IPSC

1. Una volta colonie IPSC sono abbastanza grandi da essere isolato (20-25 cellule), raccoglierli con una pipetta P20.
2. Preparare inibitori HDAC: butirrato di sodio (aggiunto a fresco di alimentazione, 100 micron), SAHA (aggiunto a fresco di alimentazione, 200 nm)
3. Mettere le colonie isolate su iMEFs nei singoli piatti 35 mm contenenti inibitori HDAC hESC Medium + + Clonazione & Recovery supplemento.
4. Il giorno dopo la raccolta delle colonie, cambiare il medio-inibitori hESC Media + HDAC.
5. Cambiare la media tutti i giorni fino a quando le colonie IPSC sono pronti per passaging.
6. Rimuovere gli inibitori HDAC dal mezzo una volta colonie stabilizzano a passaggio 2-3.

Risultati

Tre giorni dopo nucleofection e prima placcatura cellule nucleofected sul iMEFs, l'efficienza del nucleofection successo dovrebbe essere stimata mediante microscopia a fluorescenza per eGFP. La Figura 1 mostra un tipico esperimento nucleofection con circa il 5-10% della popolazione totale di cellule che esprimono eGFP.

Colonie riprogrammato IPSC cominceranno ad apparire circa due settimane dopo nucleofection. Le colonie sono generalmente circolare con bordi ben definiti ...

Discussione

Per successo generazione IPSC quando si utilizza questo protocollo, ci sono diversi avvertimenti importanti che devono essere considerati. Durante la fase di espansione eritroblasti, il programma di cambiamento dei media deve essere rigorosamente rispettata, come deviazioni possono portare alla stimolazione inefficiente della popolazione di cellule progenitrici bersaglio e una minore efficienza di generazione IPSC. È importante fare nuovo mezzo di espansione con desametasone fresca ad ogni cambio di supporto; e il mezz...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4 °C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624