Эффективное плюрипотентных клеток поколения от крови Использование эписом и HDAC ингибиторов

Резюме

Здесь мы опишем протокол для создания человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из периферической крови с использованием стратегии перепрограммирования эписомы основе и ингибиторы гистондеацетилазы.

Аннотация

Эта рукопись иллюстрирует протокол для эффективного создания интеграционных свободной человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из периферической крови с помощью эписомные плазмиды и гистондеацетилазы ингибиторы (HDAC). Преимущества этого подхода включают: (1) использование минимального количества периферической крови в качестве исходного материала; (2) nonintegrating перепрограммирования векторы; (3) экономически эффективным способом для создания векторных бесплатно ИПСК; (4) единый трансфекции; и (5) использование малых молекул, чтобы облегчить эпигенетическую перепрограммирование. Вкратце, мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) изолированы от рутинных проб флеботомии и затем культивировали в определенных факторов роста с получением высокой пролиферативной население эритроцитов клеток-предшественников, которые заметно поддаются перепрограммированию. Nonintegrating, nontransmissible эписомные плазмиды, выражающие OCT4, SOX2, Klf4, MYCL, LIN28A, и p53 короткие шпильки (SH) РНК являются ВведеCED в производные эритробластов с помощью одного nucleofection. Котрансфекции эписомы что выражает повышенной зеленый белок флуоресцентный (EGFP) позволяет легко идентифицировать трансфицированных клеток. Отдельный-дефицитных репликации плазмиды, экспрессирующей Эпштейна-Барр ядерный антиген (1 EBNA1) также добавляют к реакционной смеси в течение повышенной экспрессией белков эписомальные. Трансфицированные клетки затем высевали на слой облученного мышиных эмбриональных фибробластов (iMEFs) для дальнейшего перепрограммирования. Как только IPSC-как колонии появляются примерно в двенадцать дней после nucleofection, ингибиторы ГДАЦ добавляются в среду, чтобы облегчить эпигенетическую ремоделирования. Мы обнаружили, что включение ингибиторов HDAC обычно увеличивает поколение полностью перепрограммировать колоний ИПСК по 2 раза. После IPSC колонии демонстрируют типичную человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) морфологию, они аккуратно перечисляемых на индивидуальные КПКО покрытием тканевых культур пластин для дальнейшего роста и расширения.

Введение

иПСК получены из соматических тканей с помощью эктопической экспрессии минимальным набором генов плюрипотентности. Этот метод был первоначально продемонстрировано ретровирусной трансдукции фибробластов человека с OCT4, Sox2, Klf4 и CMYC, которые с высоким уровнем экспрессии в плюрипотентное состояние ^1. Эти временно выраженные "перепрограммирования факторы" изменить эпигенетические пейзаж и ген профиль экспрессии целевого ячейки аналогично человеческих эмбриональных стволовых клеток ^2. После создания иПСК потенциально могут быть дифференцированы в любой тип ткани для дальнейшего расследования. Таким образом, они перспективны для использования в регенеративной медицине, моделирования заболевания, и генной терапии. Однако, нарушая геном с интегрирующих вирусов имеет потенциал, чтобы изменить эндогенной экспрессии генов, клеточного фенотипа влияние, и в конечном итоге предвзятость научные результаты. Кроме того, случайные вирусные интеграция может привести к вредным сотовой еffects, включая возможность злокачественной трансформации ³ или повторного выражения онкогенных трансгенов ^4. Будущие клинические приложения потребует неинтегрирующих IPSC поколения.

Эписом, которые лишних хромосом круговой молекулы ДНК, предложить стратегию для создания экономически эффективных, интеграции, свободной ИПСК ^5. Сочетание эписомные векторы, показанные в таблице 1, выражают перепрограммирование факторы OCT4, Sox2, Klf4, MYCL и LIN28A. PCXLE_hOCT3 / 4-shp53-F плазмиды также содержит р53 shRNA для временного подавления TP53 повышения клеточного перепрограммирования ^6. Репликации вектор с дефицитом pCXWB-EBNA1 способствует усиление факторов перепрограммирования и повышенную эффективность перепрограммирования путем предоставления кратковременное повышение экспрессии EBNA1 ^7. PCXLE_EGFP плазмида может быть добавлено к смеси nucleofection с целью DETErmining эффективность трансфекции или для приложений сортировки клеток. За исключением р-CXWB EBNA1, что эписомные плазмиды, используемые в этом протоколе содержать вирус происхождение Эпштейна-Барр вирусной репликации и ген EBNA1, которые опосредуют репликацию и разбиение эписома во время деления клетки-хозяина ^8. В эписомы спонтанно потерял с расширением последовательных IPSC ^7. Субклонирование и характеристика ИПСК с потерей вектора эписомального, которые могут быть выведены из потере экспрессии EGFP, может привести к совершенно интеграции свободных ИПСК для будущих клинических применений.

Присущее процессе генерации IPSC является подавление родословной специфических генов и реактивация плюрипотентности генов, ассоциированных с. Регуляция экспрессии генов происходит на нескольких уровнях внутри ядра, в том числе изменений в ДНК и хроматина в позволяют транскрипционные факторы, регуляторных элементов ДНК и РНК доступа полимеразы для ориентациигены. Ремоделирование эпигенетической пейзажа через глобальные изменения хроматина является ключевым компонентом для повторного выражения генетической программы плюрипотентности. Конкретный хроматина модификации, что играет важную роль в регуляции экспрессии генов является ацетилирование гистонов в конкретных остатков лизина, которые предоставляет доступ ко генов-мишеней за счет сокращения натяжения катушки гистона-ДНК. Ингибиторы ГДАЦ небольшие молекулы, которые были показаны, чтобы добавлять IPSC перепрограммирование и чЭСК самообновление ^9,10, скорее всего, из-за поддержки ацетилированный состояние ^11. Протокол, описанный ниже, взяты из предварительного публикации с использованием интегрирующих лентивирусы ^12, обеспечивает шаг за шагом метод для оптимизации поколения IPSC из периферической крови с использованием эписом и ингибиторов HDAC. Концентрации ингибиторов HDAC, используемые здесь, половина из тех, описывается Ware, и др. ^9, и обычно приводит к увеличению в 2 раза в полностью перепрограммировать колоний ИПСК более стандартуПротоколы перепрограммирования эписомные без ингибиторов HDAC. Этот уровень перепрограммирования находится на одном уровне с эффективностью мы наблюдаем лентивирусными методов. Используя этот протокол, мы эффективно генерируется IPSC от физических лиц в качестве старых как 87 лет.

протокол

Письменное информированное согласие, которые были одобрены этическими советами онкологического научного центра Фреда Хатчинсона и детей "S больницы Филадельфии, была получена из пациентов перед сбором периферической крови. Наблюдались Все организационные принципы. Все эксперименты на животных, включая MEF поколения и формирование тератомы были утверждены Комитетом по уходу и использованию Институциональная животных по.

1. фиколл Разделение МНПК и расширения эритробластов - день 0

1. Развести периферической крови 1: 1 с Дульбекко фосфатно-солевом буфере (DPBS). В 15 мл с круглым дном полистирола трубки, тщательно слой 7 мл разведенной крови на 3 мл комнатной температуры Ficoll-Hypaque.
2. Центрифуга образца при 400 х г в течение 30 мин.
3. РВМС будет осели на поверхности раздела между плазмой и Ficoll-Hypaque, если смотреть в виде мутного белого слоя. Использование стерильной пипетки, собирать PBМС в один 15 мл коническую трубку. Довести объем до 10 мл, используя DPBS.
4. Использование гемацитометра, сосчитать МНПК.
5. Пипеток 2 × 10 ⁶ МНПК в отдельный 15 мл коническую трубку и центрифуги при 300 мкг в течение 5 мин. Спин вниз оставшиеся клетки и заморозить при концентрации 2 × 10 ⁶ / мл РВМС в 90% фетальной бычьей сыворотки (FBS) / 10% диметилсульфоксида (ДМСО).
6. Подготовьте расширения среда: среда свободна КПРФ-60 в сыворотке (защиты от света) + пенициллин / стрептомицин (1%) + аскорбиновая кислота (50 нг / мл) + стволовых клеток фактор (SCF, 50 нг / мл) + интерлейкина 3 (IL- 3, 10 нг / мл) + эритропоэтин (ЕРО, 2 Ед / мл) + инсулин-подобный фактор роста 1 (IGF-1, 40 нг / мл) + дексаметазон (1 мкМ; защиты от света; оттаивать свежий аликвоту каждый носитель информации изменить).
7. Ресуспендируйте 2 × 10 ⁶ МНПК в 2 мл свежеприготовленного расширения среднего и поместить в одну лунку 12-луночного планшета для культуры в и инкубировать в 37 ° C увлажненном инкубаторе с атмосферой 5% O _2, 5% СО ₂ и 90% N _2.
8. На 3-й день и 6-й день, заменить средства массовой информации.
   1. Сбор клеток и мыть хорошо с 2 мл КПРФ-60, чтобы собрать все оставшиеся клетки.
   2. Центрифуга клеточной суспензии при 300 х г в течение 5 мин и надосадочную жидкость аспирации.
   3. Ресуспендируют клеток в 2 мл нового расширения среднего и вернуть их в то же 12-луночного планшета.

2. перепрограммировать клетки по Nucleofection - День 9

1. Пипетки перепрограммирования плазмид в стерильный 1,5 мл пробирку Эппендорфа (Таблица 1).
2. Смешайте nucleofection решение с дополнения (поставляемого производителем) и пипеткой в ​​стерильную 1,5 мл пробирку Эппендорф.
3. Пипетка 2 мл расширения среды в одну лунку луночного планшета и место 12 в увлажненной 37 ° C инкубаторе (5% O _2, 5% СО ₂ и 90% N ₂₎ для уравновешивания перед добавлением клеток.
4. Сборкультивируемые клетки и мыть хорошо с 2 мл КПРФ-60 для сбора оставшихся клеток.
5. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и надосадочную жидкость аспирации.
6. Промывают клетки путем ресуспендирования в 5 мл DPBS и центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин.
7. Аспирируйте супернатант.
8. Ресуспендируют клеточный осадок в 100 мкл раствора nucleofection + дополнения, заботясь, чтобы избежать образования пузырьков.
9. Внесите суспензии клеток в пробирку, содержащую перепрограммирования плазмиды, пипетки вверх и вниз один раз, и пипеткой пробу в нижней части nucleofection кювете.
10. Поместите кювету в nucleofection машины и запустить программы T-019.
11. Перевести 100 мкл предварительно нагретой расширения среднего (от равновесной пластины в шаге 2.3) в nucleofection кювете.
12. Сразу собрать весь образец и депозит в колодец подогретого расширения Medium. Избегайте сбора белый, плавающий остатки мертвых клеток.
13. Место пластины в увлажненной 37 ° C инкубаторе (5% O _2, 5% СО ₂ и 90% N ₂₎ для роста.

3. Покрытие питающих клеток - День 10 или 11

1. На 10 день пластина фидерных клеток.
   1. Пальто один 6 луночного культурального планшета с желатином.
      1. Пипетка 1 м на 0,1% желатина в Хенкса буфером физиологический раствор (HBSS) в каждую лунку планшета.
      2. Место пластины в увлажненной 37 ° C инкубаторе в течение по крайней мере 5 мин.
      3. Непосредственно перед использованием аспирации раствора желатина от пластины.
   2. Оттепель один флакон 2 × 10 ⁶ мышиных эмбриональных фибробластов, облученных при 3000 сГр в 10 мл предварительно нагретой MEF Media (Игла в модификации Дульбекко (DMEM) + FBS (10%) + пенициллин / стрептомицин (1%)).
   3. Центрифуга клетки при 300 мкг в течение 5 мин и надосадочную жидкость аспирации. Ресуспендируют клеток в 12 мл MEF медиа и пипеткой 2 мл INto каждую лунку покрытых желатином 6-луночного планшета. Место пластины в увлажненной 37 ° C инкубаторе (5% O _2, 5% СО ₂ и 90% N ₂₎ до дня 12.

4. Покрытие ячеек на питающих клеток и изменение Medium - 12 день

1. Соберите nucleofected клетки в один 15 мл коническую трубку и собрать все оставшиеся клетки промыванием хорошо с 2 мл КПРФ-60. Центрифуга образца при 300 х г в течение 5 мин.
2. Подготовьте Перепрограммирование Среда: Искова модифицированной среде Дульбекко (IMDM) + FBS (10%) + неживотного L-глутамина (1 мМ) + несущественные аминокислоты (NEAA, 1%) + пенициллин / стрептомицин (1%) + β -mercaptoethanol (0,1 мМ) + основной фактор роста фибробластов (bFGF, добавлен свежий при кормлении, 10 нг / мл) + аскорбиновая кислота (добавлен свежий при кормлении, 50 мкг / мл).
3. Аспирата супернатант и клетки вновь суспендируют в 12 мл среды перепрограммирования. Пипеток 2 мл на лунку клеточной суспензии в6-луночный планшет из питающих клеток (полученного в разделе 3). Центрифуга пластину при 50 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре.
4. Место пластины в увлажненной 37 ° C инкубаторе (5% O _2, 5% СО ₂ и 90% N ₂₎ для роста. Изменение перепрограммирования среды через день, пока IPSC колонии не начнут появляться (1-2 недели).
5. Подготовьте чЭСК среда: DMEM / F12 1: 1 + Нокаут Сыворотка Замена (20%) + пенициллин / стрептомицин (1%) + NEAA (1%) + неживотного L-глутамина (1 мМ) + пируват натрия (1%) + бикарбонат натрия (0,12%) + β-меркаптоэтанол (0,1 мМ) + bFGF (добавлен свежий при кормлении, 10 нг / мл)
6. Подготовка ингибиторы HDAC: бутират натрия (добавляется свежая при кормлении, 100 мкмоль), suberanilohydroxamic кислота (САХА, добавляют свежую при кормлении, 200 нМ). После того, как появляются IPSC колонии, начинают кормить клетки с ингибиторами чЭСК Средний + ГДАЦ, изменяя среду каждый день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: натрия бутират является небольшой молекулы, что адсорбируется на пластиковых трубах, тherefore храните его в боросиликатного стекла трубки при 4 ° С.

5. Изоляция IPSC Клоны

1. После того, как колонии Ipsc достаточно велики, чтобы быть изолированы (20-25 клеток), забрать их с P20 пипетки.
2. Подготовка ингибиторы HDAC: бутират натрия (добавлены свежие при кормлении, 100 мкм), САХА (добавлены свежие при кормлении, 200 нМ)
3. Поместите изолированных колоний на iMEFs в отдельных 35-мм блюд, содержащих ингибиторы чЭСК Средний + HDAC + Клонирование и восстановление дополнения.
4. На следующий день после получения колоний, изменить среду к ингибиторам чЭСК Средний + ГДАЦ.
5. Изменение среды каждый день, пока IPSC колонии не готовы к пассажей.
6. Удалить ингибиторы HDAC из среды однажды колонии стабилизации при прохождении 2-3.

Результаты

Через три дня после nucleofection и до посева клеток на nucleofected iMEFs, эффективность успешной nucleofection должна быть оценена с помощью флуоресцентной микроскопии для EGFP. На рисунке 1 показана типичная nucleofection эксперимент с примерно 5-10% от общего количества клеток, экспрессирующих EGFP.

Обсуждение

Для успешного поколения IPSC при использовании этого протокола, есть несколько важных оговорок, которые следует учитывать. Во время стадии расширения эритробласт, график изменения массовой информации должны быть строго соблюдены, а отклонения могут привести к неэффективному стимуляци...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Store at 4 °C. Warm to room temperature before use.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Store at 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Store at 4 °C.
fetal bovine serum (FBS)	Life Technologies	10437028	Store at -20 °C until needed. Thaw, aliquot, store at 4 °C.
dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	154938	Store at room temperature.
QBSF-60 serum-free medium	Fisher Scientific	50-983-234	Store at 4 °C.
penicillin/streptomycin	Life Technologies	15140122	Store at 4 °C.
Cell Line Nucleofector Kit V	Lonza	VCA-1003	Store at 4 °C.
2% gelatin solution	Sigma-Aldrich	G1393	Store at 4 °C, liquify in 37 °C water bath before use.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Store at 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-glutamine, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Aliquot, freeze at -20 °C.
non-essential amino acids (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Store at 4 °C, away from light.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Store at 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Aliquot, freeze at -20 °C.
sodium pyruvate, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Store at 4 °C.
sodium bicarbonate, 7.5%	Life Technologies	25080094	Store at 4 °C.
basic fibroblast growth factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Make 10 mg/ml stock in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
sodium butyrate	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Make 2000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
hES Cell Cloning & Recovery Supplement	Stemgent	01-0014-500	Store at -20 °C until needed. Once thawed, store at 4 °C.
ESC-qualified BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	Thaw overnight on ice at 4 °C, aliquot into pre-chilled tubes using pre-chilled pipette tips. Store at -20 °C until needed. Thaw at 4 °C, use immediately.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Aliquot, freeze at -20 °C.
ascorbic acid, powdered	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Make 5 mg/ml stock in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
recombinant human stem cell factor (SCF)	R & D Systems	255-SC-010	Make 100 μg/m stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human interleukin 3 (IL-3)	R & D Systems	203-IL-010	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
erythropoietin (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Make 1000 U/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
recombinant human insulin-like growth factor 1 (IGF-1)	R & D Systems	291-G1-200	Make 100 μg/ml stock in SFEM, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M7522	Make 1000x stock (100 mM) in DPBS.
dexamethasone	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Make 50x stock (50 μM) in DPBS, sterile filter, store at 4 °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Make 2,000x stock (400 mM) in DPBS, aliquot, freeze at -20 °C. Once thawed, store at 4 °C.
12 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-29
15 ml conical tube	Sarstedt	62553002
1.5 ml Eppendorf tube	Fisher Scientific	05-408-129
6 well tissue culture plate	Fisher Scientific	08-772-1B
35 mm tisue culture plates	BD Biosciences	353001
10 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml disposable serological pipettes	Fisher Scientific	13-675-17
20 μl pipette tips, barrier tips	Genessee	24-404
glass Pasteur pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
pipette aid	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624