عزل واستئصال الفئران الأبهر. تقنية متعددة الاستخدامات في دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية

Summary

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Abstract

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Introduction

الشريان الأورطي يلعب دورا محوريا في وظيفة القلب والأوعية الدموية التي تغذي الجسم مع الدم المؤكسج وأجزاء مشابهة للآخرين من الجسم، غير عرضة للإصابة بالأمراض. وتشمل الأمراض الشائعة الأبهر تصلب الشرايين وتمدد الأوعية الدموية، والتي هي نتائج العوامل الوراثية والبيئية بما في ذلك النظام الغذائي والتدخين ونمط الحياة المستقرة ^1. تصلب الشرايين هو ترسب من الكالسيوم والبلاك القائم على الدهون على جدار الأبهر التي توجد عادة في المرضى الذين يعانون من فرط شحميات الدم المزمن ^2. وتتميز تمدد الأوعية الدموية التي كتبها تدهور المكونات الهيكلية من الشريان الأورطي وترقق جدار الوعاء الدموي، تليها قطر زاد الأمر الذي قد يؤدي في نهاية المطاف إلى تمزق ^3.

النماذج الحيوانية هي أدوات هامة تستخدم لدراسة آلية المرض وفعالية من العلاجات المحتملة. النماذج الحيوانية المشتركة المستخدمة في البحوث القلب والأوعية الدموية، والبحث على وجه التحديد التحقيق اضطرابات الأوعية الدموية والتمثيل الغذائيتشمل الفئران المعدلة وراثيا لتغيير مستويات الدهون مثل خروج المغلوب ئي E الجينات والبروتينات الدهنية منخفضة الكثافة الفئران بالضربة القاضية جين مستقبلات ^4. ان غالبية الطرق لتقييم آليات المرض وفعالية العلاج تشمل العزلة واستئصال الشريان الأورطي.

مرة واحدة يتم ترجمة الشريان الأورطي ومعزولة، يمكن تحديد تحليل المورفولوجية، مثل وجود تمدد الأوعية الدموية، الذي يعرف عادة باسم زيادة أكبر من 50٪ في قطر ^5. بعد ذلك ضروريا التحليل في الموقع هو الكامل، ويمكن رفعه الشريان الأورطي لمزيد من التحليل. والشريان الأورطي المستأصل يمكن فلاش المجمدة لإجراء الدراسات الجزيئية مثل البروتين و / أو المقايسات التعبير الجيني أو الثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ وجزءا لا يتجزأ في وقت لاحق، مقطوع وملطخة للتحليل النسيجي. التحليل النسيجي من الشريان الأورطي يمكن أن تظهر ملامح مشتركة من مرض الأبهر مثل تدهور الهيكلي، وتشكيل لوحة، وتسلل من الكريات البيض <سوب> 6،7. بالإضافة إلى ذلك، الشريان الأورطي المستأصل يمكن استخدامها لعزل خطوط الخلايا الأولية بما في ذلك خلايا العضلات الملساء البطانية والتي يمكن بعد ذلك أن تستخدم لمجموعة متنوعة من الدراسات في المختبر ^7.

حاليا، لا توجد طرق أخرى لتوفير هذا التوصيف متعمق لمرض الأبهر وكذلك توفير الباحثين بالأدوات اللازمة لمواصلة دراسة أمراض القلب والأوعية الدموية. طرائق التصوير مثل التصوير بالرنين المغناطيسي، والتصوير المقطعي والتصوير بالموجات فوق الصوتية هي أقرب الطرق لتقييم شكليا الشريان الأورطي، ولكن هذا أمر صعب في الحيوانات الصغيرة والحصول على الجهاز مع التكنولوجيا الملائمة مكلفة ^8. خطوط الخلايا خلد يمكن شراؤها للتحقيق في الآليات المحتملة من المرض وفعالية من العلاجات، ولكن طبيعة اصطناعية من هذه الخلايا تحد في دراسة الآثار المترتبة على دورة حياة الخلية وموت الخلايا المبرمج ^9.

ويتمثل الهدف العام منهذه المخطوطة هي للتدليل على العزلة العقيمة واستئصال الشريان الأورطي الفئران في التحقيق في أمراض القلب والأوعية الدموية.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية بموافقة لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي من جامعة سينسيناتي وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة (NIH المنشور رقم 85-23، منقحة 1996).

1. إعداد ماوس

1. الموت ببطء من خلال تعريض الحيوان لجرعة من مخدر supratherapeutic، استنشاق الأيزوفلورين إلى تأثير. تحقق القتل الرحيم الأساسي عن طريق قرصة أخمص قدميه كحافز الضارة. طريقة الثانوي القتل الرحيم، قطع الحجاب الحاجز، وسيحدث في خطوة المقبلة. قد يتم الحصول على استخدامها القتل الرحيم منح طرق بديلة.
2. Sanitizie السطح الخارجي من الفأرة عن طريق الرش الفراء على طول منطقة البطن، حيث سيتم إجراء التخفيضات الأولية، مع 70٪ من الإيثانول إلى درجة الرطوبة بحيث الفراء هو الرطب مع الإيثانول وأي / الشعر الجاف فضفاضة لا تدخل المنطقة.
3. وضع الماوس من على سورgical مجلس في موقف ضعيف مع الزوائد العليا والسفلى تمديد الخارج.
4. الزوائد آمنة إلى لوحة باستخدام الشريط الجراحية.

2. عزل من القلب والشريان الأبهر

1. بعد تحديد المواقع المناسبة من الفأرة، واستخدام ملقط لتحديد وعزل الجلد في منطقة البطن فقط أقل شأنا من عملية الخنجري من القص.
2. خلق التوتر من خلال رفع الجلد بشكل مستقيم واستخدام المقص لإزالة الجلد السطحي، ويعرض الجزء العلوي من الصفاق وجزء السفلي للتجويف الصدري.
3. أدخل التجويف البريتوني من خلال رفع عملية الخنجري، وجعل الشقوق الجانبية فقط أقل شأنا من عملية على طول هوامش تحت الضلع.
4. تشريح يصل الى التجويف الصدري، والذهاب من خلال الحجاب الحاجز، ويجري التأكد من عدم ممزق القلب أو أي الأوعية الدموية الرئيسية.
5. توسيع الشقوق الجانبية في الخطوة 2.3 cranially لإزالة الجزء الأمامي من القفص الصدري. إذالزم الأمر، تحرير القلب من جدار الصدر الأمامي باستخدام تشريح حادة.
6. تنظيف تجويف الصدر من الدم دخيلة والسوائل باستخدام شاش معقم لاستيعاب المواد. مرة واحدة في المنطقة هي أكثر وضوحا، وإزالة الرئتين لفضح أفضل القلب والشريان الأورطي.

3. الإرواء من القلب والشريان الأبهر

ملاحظة: للحصول على الدم عبر ثقب في القلب، تفعل ذلك فقط قبل هذه الخطوة.

1. ملء حقنة 10 سم مع 10 مل من الجليد الباردة العقيمة 1X عازلة الفوسفات الحل (PBS)، ونعلق إبرة قياس 25 إلى الحقنة.
2. إدراج بلطف الإبرة في البطين الأيسر من القلب.
3. قطع الأذين الأيمن لتخفيف الضغط تراكم من نضح. يروي محتويات الحقنة في الماوس فوق 2-3 دقيقة.
4. استخدام الشاش المعقم في افتتاح في الأذين الأيمن لامتصاص السائل نضح.

4. عزل واستئصال الأبهر

1. عند الانتهاء من المؤسسة العامةrfusion، استخدم الشاش المعقم لامتصاص أي السائل المتبقية يعكر مجال الرؤية داخل التجويف الصدري.
2. كشف محتويات الجهاز الهضمي عن طريق خفض نحو caudally من خلال جدار البطن، وتمتد من شق إلى منطقة فوق العانة. تمديد شق أكثر نحو الأطراف السفلية بشكل ثنائي لخلق اللوحات الجلد والتي يمكن تمركزها أو رفعه.
3. إزالة فصوص الكبد والبنكرياس والمعدة والطحال، والأمعاء لتصور أفضل الشريان الأورطي. أخذ الحيطة والحذر عند تشريح بالقرب من منطقة بالكلوة، والشريان الأورطي هو سطحي في فروع الشرايين الكلوية.
   ملاحظة: إجراء هذه الخطوة في دقيقة وتسجيل للجامعة الطريقة مثل الجهاز الهضمي غني مع البكتيريا مما يزيد من الميل للتلوث.
4. شطف المنطقة مع برنامج تلفزيوني 1X وإزالة جميع السوائل عن طريق امتصاص مع شاش معقم.
5. باستخدام microscissors معقمة وmicroforceps، فصل الشريان الأورطي من ظهريا العمود الفقري والمريء البطني.فمن الأفضل لاستخدام تشريح حادة واستخدام المجهر تشريح لهذا الغرض.
   ملاحظة: في عزل الشريان الأبهر، وتبدأ نحو caudally في التشعب الحرقفي والتحرك تنظيف cranially وفصل الشريان الأورطي من السطح الظهري للتجويف أو اضافة cranially في السباتية وشرايين عضدي رأسي تشريح نحو caudally. إما الطريقة المناسبة ومتروك للراحة الباحثين.
6. إزالة الأنسجة الدهنية المحيطة بالأوعية باستخدام microscissors بخير يجري التأكد من عدم إزالة جزء من جدار الشريان الأورطي. وهذا أمر ضروري لتقليل احتمال تلوث الخلايا الليفية عند زراعة خلايا العضلات الملساء الأبهر.

النتائج

وعند الانتهاء من هذا الإجراء، سيكون هناك الشريان الأورطي سليمة النابعة من القلب، وتنازلي في تجاويف الصدر والبطن مع الشرايين الكلوية لا تزال تعلق (الشكل 1A). من هنا، الشريان الأورطي يمكن تصويرها في الموقع لقياس التغيرات المورفولوجية التي هي التشخيص في د?...

Discussion

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical Tape	3M	1527-1
Sterile Gauze	Dukal Corporations	1312
25 Gauge Needle	BD	305122
10ml Syringe	BD	309604