Isolamento e excisão de Murino Aorta; A técnica versátil no Estudo de Doenças Cardiovasculares

Resumo

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Resumo

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Introdução

A aorta desempenha um papel crucial na função cardiovascular fornecendo o corpo com sangue oxigenado e outros semelhantes para partes do corpo, é susceptível à doença. Doenças da aorta comuns incluem aterosclerose e aneurisma, que são o resultado de fatores genéticos e ambientais, incluindo dieta, tabagismo e sedentarismo ^1. A aterosclerose é a deposição de cálcio e uma placa à base de lípidos para a parede da aorta, tipicamente encontrados em pacientes com hiperlipidemia crónica ^2. Os aneurismas são caracterizadas por degradação de componentes estruturais da aorta e adelgaçamento da parede do vaso, seguido por um aumento do diâmetro que poderia levar à ruptura ^3.

Os modelos animais são importantes instrumentos para estudar o mecanismo da doença e da eficácia de tratamentos potenciais. Modelos animais comuns utilizados na investigação cardiovascular, pesquisar especificamente investigar distúrbios vasculares e metabólicosincluem camundongos geneticamente modificados para alterar os níveis de lipídios, como knockout gene apolipoproteína E e lipoproteína de baixa densidade camundongos knockout gene receptor ^4. A maioria dos métodos para avaliar os mecanismos de doenças e a eficácia da terapia incluem o isolamento e a excisão da aorta.

Uma vez que a aorta é localizado e isolado, a análise morfométrica pode ser determinada, tal como a presença de aneurisma, tipicamente definido como um aumento superior a 50% no diâmetro de ^5. Depois necessário análise in situ é completa, a aorta pode ser excisado para análise posterior. Um aorta pode ser excisado flash congelados para conduzir estudos moleculares, tais como proteínas e / ou ensaios de expressão de gene ou fixo utilizando 4% de paraformaldeído e depois incorporado, seccionados e corados para análise histológica. A análise histológica da aorta pode demonstrar características comuns de doenças da aorta, como a degradação estrutural, a formação de placa, e infiltração de leucócitos ^{6,7. Além disso, uma aorta excisado pode ser utilizado para isolar as linhas de células primárias, incluindo células do músculo liso e endoteliais que podem posteriormente ser utilizados para uma variedade de estudos in vitro 7.}

Atualmente, não existem outros métodos para fornecer essa caracterização aprofundada das doenças da aorta, bem como fornecer aos pesquisadores ferramentas para estudar mais a doença cardiovascular. Modalidades de imagem, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultra-sonografia são os métodos mais próximos para avaliar morfologicamente a aorta, no entanto isso é difícil em pequenos animais e na obtenção de um dispositivo com tecnologia adequada é caro ^8. As linhas celulares imortalizadas pode ser comprado a investigar potenciais mecanismos da doença e da eficácia de terapias, no entanto, a natureza artificial destas células são limitantes no estudo dos efeitos sobre o ciclo de vida celular e apoptose ^9.

O objetivo geral doeste manuscrito é demonstrar a excisão e isolamento estéril da aorta de murino para a investigação de doenças cardiovasculares.

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados com a aprovação do Cuidado e Uso Comitê da Universidade de Cincinnati animal Institucional e de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, revista em 1996).

1. Preparar o mouse

1. Eutanásia por exposição do animal a uma dose supraterapêutica de anestésico, isoflurano inalado para o efeito. Verifique eutanásia principal via toe pitada como um estímulo nocivo. Método secundário da eutanásia, o corte de diafragma, irá ocorrer em uma próxima etapa. Métodos alternativos podem ser concedidos a eutanásia utilizado é obtido.
2. Sanitizie a superfície externa do rato por pulverização da pele ao longo da região abdominal, onde serão feitas as reduções iniciais, com etanol a 70% para o ponto de humidade de modo a que a pele é molhado com etanol e todos os cabelos secos soltas / não entram a região.
3. Coloque o mouse em uma surplaca cirúrgica em decúbito dorsal, com apêndices superiores e inferiores estendidos para fora.
4. Apêndices seguros ao Conselho, utilizando fita cirúrgica.

2. Isolamento do Coração e Aorta

1. Após o posicionamento adequado do mouse, utilize uma pinça para localizar e isolar a pele abdominal inferior apenas ao processo xifóide do esterno.
2. Criar tensão levantando a pele para cima e usar uma tesoura para remover a pele superficial, expondo a porção superior do peritônio e porção inferior da cavidade torácica.
3. Entrar na cavidade peritoneal, levantando o apêndice xifóide e fazer incisões laterais apenas inferior ao processo ao longo das margens subcostal.
4. Dissecar-se para dentro da cavidade torácica, passando pelo diafragma, sendo certo não lacerar o coração ou qualquer um dos principais vasos sanguíneos.
5. Estenda as incisões laterais feitas na etapa 2.3 cranial para remover a porção anterior da caixa torácica. Senecessário, libertar o coração da parede anterior do tórax usando dissecção romba.
6. Limpe a caixa torácica do sangue alheio e fluido, utilizando gaze estéril para absorver material. Uma vez que a área é mais visível, remoção dos pulmões para expor melhor o coração e aorta.

3. Perfusão de Coração e Aorta

NOTA: Para obter o sangue através de punção cardíaca, fazê-lo imediatamente antes desta etapa.

1. Encher uma seringa de 10 cc com 10 ml de gelo estéril solução tampão de fosfato frio 1x (PBS), e anexar uma agulha de calibre 25 para a seringa.
2. Inserir a agulha suavemente para o ventrículo esquerdo do coração.
3. Corte o átrio direito para aliviar o acúmulo de pressão de perfusão. Perfundir os conteúdos da seringa para dentro do rato de 2 - 3 minutos.
4. Use gaze estéril na abertura no átrio direito para absorver líquido de perfusão.

4. Isolamento e Excisão da Aorta

1. Após a conclusão da perfusion, utilizar gaze estéril para absorver qualquer fluido remanescente turvação do campo de visão dentro da cavidade torácica.
2. Expor os conteúdos gastrointestinais caudalmente cortando através da parede abdominal, que se estende da incisão para a região suprapúbica. Estender a incisão mais para os membros inferiores bilateralmente para criar retalhos de pele, que pode ser fixado para baixo ou excisadas.
3. Retire os lobos do fígado, pâncreas, estômago, baço e intestino para visualizar melhor a aorta. Tome cuidado ao dissecar perto da região perirrenal, como a aorta é superficial com os ramos das artérias renais.
   NOTA: Execute esta etapa em um preciso e matricular forma como o trato gastrointestinal é rica em bactérias, o que aumenta a propensão para a contaminação.
4. Lavar a área com 1x PBS e remover todo o fluido por absorção com uma gaze estéril.
5. Usando microtesouras e micropinças estéreis, separe a aorta do dorsal da coluna e do esôfago ventrally.É melhor utilizar a dissecção romba e utilizando um microscópio de dissecção para este.
   NOTA: Ao isolar a aorta, iniciar caudalmente na bifurcação ilíaca e mover-se cranialmente limpeza e separação da aorta a partir da superfície dorsal da cavidade cranial ou iniciar as carótidas e braquiocefálicos dissecação caudalmente. Qualquer método é apropriado e é até o conforto pesquisadores.
6. Remover o tecido adiposo perivascular usando microtesouras finas sendo certo não para remover uma porção da parede da aorta. Isto é essencial para minimizar o potencial de contaminação por fibroblastos quando a cultura de células musculares lisas da aorta.

Resultados

Após a conclusão do processo, haverá uma aorta intacta proveniente do coração, descendo para as cavidades torácica e abdominal, com as artérias renais ainda ligado (Figura 1A). A partir daqui, a aorta pode ser visualizado in situ para quantificar as alterações morfométricas que são de diagnóstico no estudo de aneurismas da aorta abdominal (Figura 1B e 1C). Subsequentemente, a aorta pode ser removidas, fixadas e coradas para olhar para mudanças hist...

Discussão

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical Tape	3M	1527-1
Sterile Gauze	Dukal Corporations	1312
25 Gauge Needle	BD	305122
10ml Syringe	BD	309604