Выделение и Удаление мышиной аорты; Универсальный Техника в исследовании сердечно-сосудистых заболеваний

Резюме

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Аннотация

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Введение

Аорты играет ключевую роль в сердечно-сосудистой функции обеспечения тела кислородом крови и аналогичных других частей тела, является восприимчивым к болезни. Общие аорты заболевания включают в себя атеросклероз и аневризмы, которые являются результатами генетических и экологических факторов, включая питание, курение, малоподвижный образ жизни ^1. Атеросклероз является осаждение кальцием и липидов на основе налета на стенке аорты, как правило, встречается у больных с хронической гиперлипидемии ^2. Аневризмы характеризуются деградации структурных компонентов аорты и истончение стенки сосуда, с последующим увеличением диаметра, которые в конечном счете может привести к разрыву ^3.

Животные модели являются важными инструментами, используемыми для изучения механизма заболевания и эффективности возможных методов лечения. Общие модели животного происхождения, используемые в исследование сердечно-сосудистой, в частности, исследования исследования сосудов и нарушения обмена веществвключают генетически модифицированных мышей с целью изменения уровней липидов, таких как генная аполипопротеина E нокаутом и плотность липопротеина ген рецепторов у мышей с низким ^4. Большинство методов оценки механизмов заболевания и эффективности терапии будет включать в себя выделение и иссечение аорты.

После того, как аорта локализован и изолированы, морфометрический анализ может быть определена, например, наличием аневризмы, как правило, определяется как увеличение диаметра ⁵ больше, чем 50%. После необходимости в анализе месте завершена, аорта может быть вырезан для дальнейшего анализа. Иссеченную аорты может быть мгновенно замораживали для проведения молекулярных исследований, таких как белок и / или экспрессии генов анализов или устранить с помощью 4% параформальдегида, а затем встроен, срезы и окрашивали для гистологического анализа. Гистологический анализ аорты может продемонстрировать общие черты аорты заболеваний, таких как структурный деградации, образованию бляшек, и инфильтрацией лейкоцитов ^{6,7. Кроме того, Иссеченную аорты может быть использован для изоляции клеточных линий, включая основные эндотелиальных и гладкомышечных клеток, которые впоследствии могут быть использованы для различных исследований в пробирке 7.}

В настоящее время нет никаких других способов предоставления Это углубленное характеристику аортального а также обеспечить исследователей инструментами для дальнейшего изучения сердечно-сосудистых заболеваний. Визуализации формы, такие как магнитно-резонансной томографии, компьютерной томографии и УЗИ являются ближайшими методы морфологически оценить аорты, однако это трудно в небольших животных и получение устройства с адекватной технологии является дорогостоящим ^8. Иммортализованные клеточные линии могут быть куплены, чтобы исследовать потенциальные механизмы заболевания и эффективности терапии, однако искусственная природа этих клеток, ограничивающих изучения влияния на жизнь клеточного цикла и апоптоза ^9.

Общая цельЭта рукопись является демонстрация стерильную изоляции и удаление мышиного аорты в расследовании сердечно-сосудистых заболеваний.

протокол

Все процедуры на животных были проведены с одобрения уходу и использованию комитета Институциональная животных из Университета Цинциннати и в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных от Национальных институтов здравоохранения (NIH Publication No. 85-23, Пересмотрен в 1996).

1. Подготовка мыши

1. Эвтаназии, подвергая животное к supratherapeutic дозы анестетика, изофлуран вдыхании эффект. Проверьте первичный эвтаназию через носок щепотку как болевые раздражители. Дополнительный способ эвтаназии, резки диафрагмы, произойдет в следующем шаге. Альтернативные способы могут быть использованы предоставлено эвтаназии получают.
2. Sanitizie внешняя поверхность мыши путем распыления мех вдоль брюшной области, где будут сделаны начальные разрезы, 70% этанолом до точки влаги, так что мех влажной этанолом и любые свободные / сухие волосы не вступают область.
3. Положите мышь из на Сюрческие доска в положении лежа на спине с верхней и нижней конечностей продлен наружу.
4. Безопасные придатки на плату с помощью хирургической лентой.

2. Выделение сердца и аорты

1. После правильного позиционирования мыши, использовать пинцет, чтобы локализовать и изолировать кожи живота просто, ниже мечевидного отростка грудины.
2. Создание напряжение, поднимая кожу вверх и использовать ножницы, чтобы удалить поверхностную оболочку, обнажая превосходную часть брюшины и нижней части грудной полости.
3. Введите в брюшную полость, подняв процесс мечевидного и сделать боковые разрезы только нижестоящие по отношению к процессу вдоль подреберье полей.
4. Проанализируйте вверх в грудную полость, проходит через диафрагму, будучи уверенным, чтобы не покалечить сердце или каких-либо крупных кровеносных сосудов.
5. Продлить боковые разрезы, сделанные в шаге 2,3 краниально, чтобы удалить переднюю часть грудной клетки. Еслинеобходимости следует освободить сердце от передней грудной стенки с использованием тупым.
6. Очистите груди полости постороннего крови и жидкости с помощью стерильную марлю, чтобы поглотить материал. После того, как площадь виднее, удалить легкие, чтобы лучше раскрыть сердце и аорту.

3. Кровоснабжение сердца и аорты

Примечание: Для получения крови с помощью пункции сердца, делать это непосредственно перед этим шагом.

1. Заполните 10 см шприц с 10 мл стерильного охлажденного льдом 1x раствора фосфатного буфера (PBS), и прикрепить иглу 25 в шприц.
2. Осторожно введите иглу в левый желудочек сердца.
3. Разрежьте правое предсердие, чтобы облегчить повышение давления от перфузии. Заливать содержимое шприца в наведении мыши 2 - 3 мин.
4. Использование стерильную марлю в отверстие в правом предсердии, чтобы поглотить перфузионной жидкости.

4. Выделение и Удаление аорты

1. После завершения реrfusion использовать стерильную марлю, чтобы поглотить всю оставшуюся жидкость облачное поле зрения в грудной полости.
2. Защиту желудочно-кишечные содержимое резанием каудально через брюшную стенку, расширяя разрез в надлобковой области. Продлить разрез дальше в сторону нижних конечностей на двусторонней основе, чтобы создать кожных лоскутов, которые могут быть скованы или удалить.
3. Снимите долей печени, поджелудочной железы, желудка, селезенки и кишечника лучше визуализировать аорту. Будьте осторожны при вскрытии рядом с периренальных регионе, а аорта поверхностно на ветвях почечных артерий.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг в точной и зачисляются образом, как желудочно-кишечного тракта богата бактериями, что увеличивает склонность к загрязнению.
4. Промыть области с 1x PBS и удалить всю жидкость за счет поглощения с стерильную марлю.
5. Использование стерильных microscissors и microforceps, отделить аорты от позвоночника спинной и пищевода вентрально.Лучше всего использовать тупым и использования рассечение микроскоп для этого.
   Примечание: В изолировать аорты, каудально начать в подвздошной бифуркации и перемещать краниально очистки и выделения аорты из дорсальной поверхности полости или начать краниально на сонных артерий и брахиоцефальных артерий рассекающих каудально. Любой метод подходит и к комфорту исследователей.
6. Удалить периваскулярной жировой ткани с помощью тонких microscissors будучи уверенным, чтобы не удалить часть стенки аорты. Это очень важно, чтобы минимизировать возможность загрязнения фибробластов при культивировании аортальных гладкомышечных клеток.

Результаты

После завершения процедуры, будет нетронутым аорты, исходящая из сердца, спускаясь в грудной и брюшной полостей с почечных артерий еще прилагается (1А). Отсюда, аорта могут быть отображены на месте, чтобы количественной оценки изменений, которые морфометрические диагност?...

Обсуждение

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical Tape	3M	1527-1
Sterile Gauze	Dukal Corporations	1312
25 Gauge Needle	BD	305122
10ml Syringe	BD	309604