Isolement et Excision de murin Aorte; Une technique polyvalente dans l'étude des maladies cardiovasculaires

Résumé

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Résumé

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Introduction

L'aorte joue un rôle pivot dans la fonction cardiovasculaire fournissant le corps avec le sang oxygéné et d'autres parties semblables à de l'organisme, est sensible à la maladie. Maladies aortiques communs incluent l'athérosclérose et anévrisme, qui sont les résultats de facteurs génétiques et environnementaux, y compris l'alimentation, le tabagisme et la sédentarité ^1. L'athérosclérose est le dépôt de calcium et une plaque à base de lipides sur la paroi aortique typiquement trouvés chez des patients atteints d'hyperlipidémie chronique ^2. Les anévrismes sont caractérisés par une dégradation des composants structuraux de l'aorte et l'amincissement de la paroi du vaisseau, suivie d'une augmentation de diamètre qui peut finalement conduire à la rupture ^3.

Les modèles animaux sont des outils importants utilisés pour étudier le mécanisme de la maladie et l'efficacité des traitements potentiels. Modèles animaux couramment utilisés en recherche cardiovasculaire, la recherche spécifiquement enquête vasculaires et métaboliquesinclure des souris génétiquement modifiées pour modifier les taux de lipides tels que le knock-out de gène de l'apolipoprotéine E et de lipoprotéines de faible densité des souris knock-out du gène du récepteur ^4. La majorité des méthodes pour évaluer les mécanismes de la maladie et l'efficacité de la thérapie comprendrait l'isolement et l'excision de l'aorte.

Une fois que l'aorte est localisé et isolé, l'analyse morphométrique peut être déterminée, comme la présence de l'anévrisme, généralement définie comme une augmentation supérieure à 50% dans ⁵ diamètre. Après nécessaire analyse in situ est terminée, l'aorte peut être excisé pour une analyse ultérieure. Une aorte excisée peut être surgelé de mener des études moléculaires tels que les protéines et / ou des essais d'expression génique ou fixe en utilisant 4% de paraformaldehyde, puis incorporé, en coupe et colorées pour l'analyse histologique. L'analyse histologique de l'aorte peut démontrer des caractéristiques communes de la maladie aortique tels que la dégradation structurelle, la formation de plaque, et l'infiltration de leucocytes ^{6,7. En outre, une aorte excisée peut être utilisé pour isoler des lignées de cellules primaires y compris des cellules endotheliales et des muscles lisses qui peuvent ensuite être utilisés pour une variété d'études in vitro 7.}

Actuellement, il n'y a pas d'autres méthodes pour fournir cette caractérisation en profondeur de la maladie aortique ainsi que de fournir aux chercheurs des outils d'étudier plus avant les maladies cardiovasculaires. Les modalités d'imagerie telles que l'imagerie par résonance magnétique, la tomodensitométrie et l'échographie sont les plus proches des méthodes pour évaluer morphologiquement l'aorte, mais ce est difficile chez les petits animaux et d'obtenir un dispositif avec la technologie adéquate est cher ^8. Les lignées cellulaires immortalisées peuvent être achetés pour étudier les mécanismes potentiels de la maladie et l'efficacité des thérapies, mais le caractère artificiel de ces cellules limitent à étudier les effets sur le cycle de vie cellulaire et l'apoptose ^neuf.

L'objectif global dece manuscrit est de démontrer l'isolement stérile et l'excision de l'aorte murin dans l'enquête sur les maladies cardiovasculaires.

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Protocole

Toutes les procédures d'animaux ont été effectués avec l'approbation du soin et l'utilisation Commission institutionnelle animale de l'Université de Cincinnati et en conformité avec le Guide de soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health (NIH Publication No. 85-23, révisée en 1996).

1. Préparation de la souris

1. Euthanasier en exposant l'animal à une dose d'anesthésique suprathérapeutique, isoflurane inhalé à effet. Vérifiez l'euthanasie primaire par pincement de l'orteil comme un stimulus nociceptif. Méthode secondaire de l'euthanasie, la coupe de la membrane, se produira dans une étape prochaine. D'autres méthodes peuvent être utilisées euthanasie accordé est obtenu.
2. Sanitizie la surface externe de la souris par pulvérisation de la fourrure le long de la région abdominale, où les réductions initiales seront faites, avec 70% d'éthanol au point d'humidité, de sorte que la fourrure est mouillé avec de l'éthanol et des poils / sec ne entrent pas la région.
3. Placez la souris sur une surgique conseil en décubitus dorsal avec des appendices supérieures et inférieures étendu vers l'extérieur.
4. Appendices sécurisés au conseil l'aide de ruban chirurgical.

2. Isolement du Cœur et de l'aorte

1. Après un bon positionnement de la souris, utiliser une pince pour localiser et isoler la peau abdominale juste inférieure à la pointe du sternum du sternum.
2. Créer des tensions en soulevant la peau vers le haut et utiliser des ciseaux pour enlever la peau superficielle, exposant la partie supérieure du péritoine et de la partie inférieure de la cavité thoracique.
3. Entrez la cavité péritonéale en soulevant le processus de xiphoïde et faire des incisions latérales juste inférieurs au processus le long des marges sous-costale.
4. Disséquer dans la cavité thoracique, en passant par le diaphragme, en étant sûr de ne pas déchirer le coeur ou des gros vaisseaux sanguins.
5. Étendre les incisions latérales faites à l'étape 2.3 crânienne pour enlever la partie antérieure de la cage thoracique. Sinécessaire, libérer le cœur de la paroi thoracique antérieure utilisant dissection.
6. Nettoyez la cavité thoracique de sang étrangère et fluide en utilisant la gaze stérile pour absorber la matière. Une fois que la zone est plus visible, retirez les poumons afin de mieux exposer le coeur et l'aorte.

3. perfusion du cœur et de l'aorte

NOTE: Pour obtenir le sang par ponction cardiaque, le faire juste avant cette étape.

1. Remplir une seringue de 10 cc avec 10 ml de solution de tampon de phosphate de glace stérile 1x froid (PBS), et fixer une aiguille de calibre 25 à la seringue.
2. Insérez délicatement l'aiguille dans le ventricule gauche du cœur.
3. Couper l'oreillette droite pour atténuer l'accumulation de la pression de perfusion. Perfuser le contenu de la seringue dans la souris sur 2-3 min.
4. Utilisation de la gaze stérile à l'ouverture dans l'oreillette droite à absorber le fluide de perfusion.

4. Isolement et Excision de l'aorte

1. À la fin de perfusion, utiliser une compresse stérile pour absorber tout liquide restant brouiller le champ de vision dans la cavité thoracique.
2. Exposer le contenu gastro-intestinaux en coupant caudalement travers la paroi abdominale, étendant l'incision à la zone sus-pubienne. Elargir l'incision de plus vers les membres inférieurs bilatérale pour créer lambeaux de peau qui peut être maintenu au sol ou excisées.
3. Retirez les lobes du foie, du pancréas, de l'estomac, la rate, les intestins et de mieux visualiser l'aorte. Faites attention lorsque vous disséquer près de la région péri-rénale, que l'aorte est superficielle aux branches des artères rénales.
   REMARQUE: Effectuez cette étape dans un précis et immatriculer manière que le tractus gastro-intestinal est riche avec des bactéries qui augmente la propension à la contamination.
4. Rincer la zone avec PBS 1x et enlever tout le liquide par absorption avec une gaze stérile.
5. Utilisation microciseaux et microforceps stériles, séparer l'aorte de la face dorsale de la colonne vertébrale et l'œsophage ventrale.Il est préférable d'utiliser dissection et en utilisant un microscope de dissection pour cela.
   NOTE: En isolant l'aorte, commencer caudale à la bifurcation iliaque et déplacer crânialement nettoyage et la séparation de l'aorte de la surface dorsale de la cavité crânienne ou commencer à les carotides et les artères de brachiocéphaliques dissection caudale. Chaque méthode est appropriée et à la chercheurs confort.
6. Retirez le tissu adipeux périvasculaire utilisant microciseaux fines en étant sûr de ne pas enlever une partie de la paroi aortique. Cela est essentiel pour minimiser le risque de contamination lors de la mise en culture de fibroblastes de cellules musculaires lisses aortiques.

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Résultats

Après achèvement de la procédure, il y aura une aorte intacte provenant du cœur, diminuant dans les cavités thoracique et abdominale avec les artères rénales encore attachées (figure 1A). De là, l'aorte peut être imagé in situ pour quantifier les changements morphométriques qui sont diagnostic dans l'étude des anévrismes aortiques abdominaux (Figure 1B et 1C). Par la suite, l'aorte peut être retiré, fixées et colorées d'examine...

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Discussion

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical tape	3M	1527-1
Sterile gauze	Dukal Corporations	1312
25 gauge needle	BD	305122
10 ml syringe	BD	309604