İzolasyon ve Kemirgen Aort eksizyonu; Kardiyovasküler Hastalığı Çalışmasında Çok Yönlü Tekniği

Özet

Pathology of the aorta can lead to severe morbidity and mortality, therefore research of disease progression and potential therapies is warranted. Here, we present a protocol to isolate and excise the murine aorta to aid researchers in their investigation of cardiovascular disease.

Özet

Cardiovascular disease is a broad term describing disease of the heart and/or blood vessels. The main blood vessel supplying the body with oxygenated blood is the aorta. The aorta may become affected in diseases such as atherosclerosis and aneurysm. Researchers investigating these diseases would benefit from direct observation of the aorta to characterize disease progression as well as to evaluate efficacy of potential therapeutics. The goal of this protocol is to describe proper isolation and excision of the aorta to aid investigators researching cardiovascular disease. Isolation and excision of the aorta allows investigators to look at gross morphometric changes as wells as allowing them to preserve and stain the tissue to look at histologic changes if desired. The aorta may be used for molecular studies to evaluate protein and gene expression to discover targets of interest and mechanisms of action. This technique is superior to imaging modalities as they have inherent limitations in technology and cost. Additionally, primary isolated cells from a freshly isolated and excised aorta can allowing researchers to perform further in situ and in vitro assays. The isolation and excision of the aorta has the limitation of having to sacrifice the animal however, in this case the benefits outweigh the harm as it is the most versatile technique in the study of aortic disease.

Giriş

Aort oksijenli kan ve vücut burada da benzer kısımlar ile vücut temin kardiyovasküler fonksiyon çok önemli bir rol oynar, hastalığa karşı hassastır. Ortak aort hastalıkları diyet, sigara ve sedanter yaşam tarzı ¹ olmak üzere genetik ve çevresel faktörlerin sonuçları ateroskleroz ve anevrizma içerir. Ateroskleroz, tipik olarak kronik hiperlipidemi ² olan hastalarda bulunan aort duvarının bir kalsiyum ve lipit bazlı plak birikmesidir. Anevrizma sonuçta ³ yırtılmasına neden olabilecek bir artış çapı ardından aorta ve damar duvarının incelme yapısal elemanların bozulma ile karakterize edilir.

Hayvan modelleri hastalık ve potansiyel tedavilerin etkinliğinin mekanizmasını incelemek için kullanılan önemli araçlardır. Kardiyovasküler araştırmalarda yaygın olarak kullanılan hayvan modelleri, özellikle vasküler ve metabolik bozuklukların araştırılması aratmakBöyle Apolipoprotein E gen nakavt ve düşük yoğunluklu lipoprotein reseptör gen nakavt fareler ⁴ olarak lipid düzeylerini değiştirmek için genetiği değiştirilmiş fareler vardır. hastalık ve tedavinin etkinliğinin mekanizmasının değerlendirilmesi için yöntemlerin çoğunluğu, aort izole edilmesini ve çıkarılmasını içerir.

Aort lokalize ve izole edildikten sonra, morfometrik analizi, anevrizma varlığında, tipik olarak çap ⁵ daha büyük bir% 50 artış olarak tarif edildiği gibi belirlenebilir. Yerinde analiz gerekli işlemi tamamlandıktan sonra, aort, ileri analiz için çıkartılır. Bir eksize edilen aort örneğin protein ve / veya gen sentezleme tahlilleri ya da moleküler çalışmalar yapmak için dondurulmuş flaş olabilir% 4 paraformaldehid ile sabitlenmiş ve sonra sarılır, bölümlere ayrılır ve histopatolojik analiz için boyanmıştır. Aort histolojik analiz gibi yapısal bozulma, plak oluşumu ve lökositlerin sızması gibi aort hastalığı ortak özellikler göstermektedir ^{6,7. Buna ek olarak, bir eksize edilen orta damar alındı, in vitro çalışmalar 7 çok çeşitli kullanılabilir endotel ve düz kas hücreleri dahil olmak üzere birincil hücre hatları izole etmek için kullanılabilir.}

Şu anda, aort hastalığı bu derinlemesine karakterizasyonu sağlamak yanı sıra kardiyovasküler hastalık çalışma araçları ile araştırmacılara sunmak için başka yöntemler vardır. Manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı tomografi ve ultrasonografi gibi görüntüleme yöntemleri ancak bu küçük hayvanlarda zor ve yeterli teknolojisine sahip bir aygıtı elde ⁸ pahalı, morfolojik aorta değerlendirmek için yakın yöntemlerdir. Ölümsüzleşmiş hücre hatları, ancak bu hücrelerin yapay doğa hücre yaşam döngüsü ve apoptoz ⁹ üzerindeki etkileri araştırmakla sınırlayıcı hastalık ve tedavilerin etkinliğinin potansiyel mekanizmaları, araştırmak için satın alınabilir.

genel amacıBu yazının kardiyovasküler hastalık soruşturma kemirgen aorta steril izolasyon ve eksizyonu göstermektir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, Cincinnati Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi ve Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu uyarınca onay (NIH Yayın No. 85-23 ile yapıldı ) 1996 Revize.

1. Fare Hazırlanması

1. Anestezik bir tedavi üstü doz hayvan teşhir ederek Euthanize, izofluran etkisi inhale. Bir zararlı uyarıcı olarak ayak tutam yoluyla birincil ötenazi doğrulayın. Ötenazi, diyafram kesme İkincil yöntem, yaklaşan adım ortaya çıkar. Alternatif yöntemler kullanılmıştır verilen ötenazi elde edilir edilebilir.
2. Sanitizie nem alanına için% 70 etanol ile, ilk kesim yapılacaktır karın bölgesi boyunca kürk püskürterek fare dış yüzeyi, böylece kürk, etanol ile ıslatılmış ve herhangi bir serbest / kuru tüyleri girmezler bölge.
3. Bir sur üzerinde fare dışarı LayÜst ve alt uzantıları ile yatar pozisyonda rahi kurulu dışa genişletilmiş.
4. Cerrahi bandı kullanarak kuruluna Güvenli uzantıları.

Kalp ve Aort 2. izolasyonu

1. Farenin doğru konumlandırma sonra, bulmak ve sternum kılıç şeklinde sürecine sadece aşağı karın cildi izole etmek forseps kullanabilir.
2. Düz yukarı kaldırarak cilt gerginliği oluşturun ve periton ve göğüs boşluğunun alt kısmının üstün kısmını açığa yüzeysel cilt kaldırmak için makas kullanın.
3. Kılıç şeklinde sürecini kaldırma ve subkostal kenarları boyunca sürecine sadece aşağı yan kesiler yaparak periton boşluğuna girin.
4. Kalp veya herhangi bir büyük kan damarları lacerate emin olmak, diyafram geçiyor, göğüs boşluğuna kadar parçalara ayır.
5. Göğüs kafesi ön kısmını kaldırmak için adım 2.3 cranially yapılan yanal kesiler uzatın. EğerGerekli, künt diseksiyon ile göğüs ön duvarından kalp ücretsiz.
6. Malzeme emmek için steril gazlı bez kullanılarak gereksiz kan ve sıvı göğüs boşluğunu temizleyin. Alan daha görünür sonra, daha iyi kalp ve aorta maruz akciğerleri kaldırmak.

Kalp ve Aort 3. Perfüzyon

NOT: Bu adım çok hemen önce yapmak, kalp delinerek kan elde etmek için.

1. Steril buz soğuk 1x Fosfat tampon çözeltisi (PBS), 10 ml bir 10 cc şırınga doldurun ve şırıngaya bir 25 gauge iğne takılır.
2. Yavaşça kalbin sol ventrikül içine iğne takın.
3. Perfüzyon basınç birikimini hafifletmek için sağ atrium kesin. 3 dakika - 2 üzerinde fare içine şırınga içeriğini serpmek.
4. Perfüzyon sıvıyı emmek için sağ atrium açılışında steril gazlı bez kullanın.

Aort 4. İzolasyon ve eksizyonu

1. PE tamamlanması üzerinerfusion, göğüs boşluğu içinde görüş alanını karıştırdığın kalan sıvıyı emmek için steril gazlı bez kullanın.
2. Suprapubik bölgeye kesi uzanan, karın duvarından kaudal keserek gastrointestinal içeriğini Açığa. Bilateral aşağı tuş veya eksize edilebilir cilt flep oluşturmak için alt ekstremitelerde yönünde daha fazla kesi uzatın.
3. Daha iyi aorta görselleştirmek için karaciğer, pankreas, mide, dalak, bağırsaklar ve lobları çıkarın. Aort renal arterlerin şubelerinde yüzeysel olarak, perirenal bölgesi yakınında diseksiyon dikkatli olun.
   NOT: kesin bu adımı gerçekleştirin ve gastrointestinal sistem kirlenme eğilimi artırır bakteri ile zengin olarak şekilde kaydolur.
4. 1x PBS ile bölgeyi durulayın ve bir steril gazlı bez ile emilim bütün sıvıyı çıkarın.
5. Steril Microscissors ve microforceps kullanarak, omurga dorsal ve ventral yemek borusu gelen aort ayırın.Bu künt diseksiyon ve bunun için bir diseksiyon mikroskobu kullanarak kullanmak en iyisidir.
   NOT: aort izole iliyak bifürkasyonunda kaudal başlayacak ve kaudal diseksiyon karotis ve brakiyosefalik arterlerde cranially cranially temizlik ve kavite dorsal yüzeyinden aort ayıran taşımak veya başlatın. Her iki yöntem uygun ve araştırmacılar konfor kadar.
6. Aort duvarının bir kısmını kaldırmak için emin olmak ince microscissors kullanarak perivasküler yağ dokusu çıkarın. Bu aortik düz kas hücrelerinin kültür sırasında fibroblast ve kirlenme ihtimalini en aza indirmek için önemlidir.

Sonuçlar

Prosedürün tamamlanmasından sonra, hala (Şekil 1A) bağlı renal arter ile göğüs ve karın boşlukları içerisine inen kalp kaynaklı sağlam bir aort, orada olacak. Buradan, aort abdominal aort anevrizması (Şekil 1B ve 1C) çalışmalarında tanısal olan morfometrik değişiklikleri ölçmek için yerinde görüntülü olabilir. Daha sonra, aort, kaldırıldı sabit ve histolojik değişikliklere bakmak lekeli olabilir. Aort genel ve ortak leke hema...

Tartışmalar

Aortic disease can lead to significant systemic pathology and possibly death in severe cases. Treatment options are currently limited therefore continued research in the field is necessary¹⁰. Murine models are ideal to further study disease progression and potentially therapeutic options⁴. Therefore, the successful completion of the method described in this manuscript will provide investigators with the tools to measure disease progression and drug efficacy.

This techniq...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Isoflurane	Med-Vet International	#RXISO-250
70% Ethanol	Fisher	07-678-001
Phosphate buffered saline	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Surgical Tape	3M	1527-1
Sterile Gauze	Dukal Corporations	1312
25 Gauge Needle	BD	305122
10ml Syringe	BD	309604