Electroporation للمن المستجيبات البكتيرية وظيفية في خلايا الثدييات

Summary

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Abstract

دراسة التفاعلات البروتين في سياق الخلايا الحية يمكن أن تولد المعلومات الهامة حول توطين والديناميكية وشركاء التفاعل. هذه المعلومات هي قيمة خاصة في سياق التفاعلات المضيف الممرض. العديد من البروتينات الممرض تعمل داخل الخلايا المضيفة في مجموعة متنوعة من طريقة مثل، مما يتيح التهرب من الجهاز المناعي المضيفة والبقاء على قيد الحياة في البيئة داخل الخلايا. لدراسة هذه الممرض البروتين التفاعلات الخلية المضيفة، وتستخدم عدة نهج شيوعا، بما في ذلك: في إصابة الجسم الحي مع سلالة التعبير عن بروتين الموسومة أو متحولة، أو إدخال جينات الممرض عبر ترنسفكأيشن أو تنبيغ. كل من هذه الطرق لها مزايا وعيوب. سعينا وسيلة لإدخال مباشرة البروتينات الخارجية إلى داخل الخلايا. يستخدم Electroporation للعادة لتقديم الأحماض النووية في خلايا، ولكن تم أكثر نادرا ما تطبق على البروتينات على الرغم من أن أساس فيزيائي حيوي هو نفسه تماما.تم استخدام electroporator القياسية لإدخال مؤثرات تقارب الموسومة البكتيرية إلى خلايا الثدييات. كان المثقف خلايا البلاعم الظهارية والفأر الإنسان من خلال الطرق التقليدية، فصل، ووضعها في 0.4 سم cuvettes الفجوة Electroporation للمع البروتين البكتيري الممرض خارجي من الفائدة (على سبيل المثال السالمونيلا التيفية الفأرية GtgE). بعد Electroporation لل(0.3 كيلو فولت) والقصيرة (4 ساعات) فترة نقاهة، تم التحقق من البروتين داخل الخلايا التي وصفها fluorescently البروتين عن طريق بطاقة تقارب ودراسة التوزيع المكاني والزماني بواسطة المجهر متحد البؤر. وقد تبين أن البروتين electroporated أيضا لتكون وظيفية داخل الخلية وقادرة على الاتجار التحت خلوية الصحيح والتفاعل البروتين البروتين. في حين تميل البروتينات الخارجية لتتراكم على سطح الخلايا، فان عينات electroporated زيادات كبيرة في داخل الخلايا تركيز المستجيب نسبة إلى الحضانة وحدها. بروتوكول بسيط وسريع بما فيه الكفاية مما يتعين القيام به في ا ف بالأزياء arallel، والسماح لتوصيف عالية الإنتاجية للبروتينات الممرض في الخلايا المضيفة بما في ذلك استهداف التحت خلوية وظيفة البروتينات الفوعة.

Introduction

العديد من الجراثيم سلبية الغرام تستخدم أنظمة إفراز المتخصصة لحقن البروتينات المرتبطة الفوعة (ويشار إلى المستجيبات) مباشرة في الخلايا المضيفة ^1-5. هذه المؤثرات لديها مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية بما في ذلك: قمع الحصانة المضيف، والتغيرات هيكل الخلية، وتعديل الاتجار داخل الخلايا والإشارات، والتغيرات النسخي، والتعديلات proteasome والمضيف ^6-9. ومن المعروف وظائف بعض المؤثرات، ولكن الأهداف المضيفة وعمل الكيمياء الحيوية (ق) من كثيرين آخرين لا تزال يحدد لاحقا. في حين المقارنة بين النوع البري والالتهابات البكتيرية المؤتلف هو نهج صحيح لدراسة آليات المستجيب الفوعة داخل الخلايا، غالبا ما يكون من المفيد أن استحداث المستجيب الفردي في الخلية المضيفة. وهكذا، طرق بسيطة لإدخال وتميز البروتينات المستجيب البكتيرية في سياق الخلايا المضيفة أمر مرغوب فيه للغاية.

تبسيط التحليل واي تجريبيعشر على المستجيب واحد أمر بالغ الأهمية كما المستجيبات أخرى قد يكون لها وظائف معارضة أو زائدة عن الحاجة. لإنجاز هذا التبسيط، وأدخلت الباحثين سابقا الجزيئات إلى الخلايا عن طريق العديد من الطرق المختلفة، بما في ذلك تنبيغ الفيروسية ^10، حقن مكروي ^11، كشط تحميل ^12،13، والانصهار مع خلية يسببها كيميائيا حقن مكروي ¹⁴ والبروتين الملكية "ترنسفكأيشن" الكواشف ^15، رواسب فوسفات الكالسيوم ^16، و electroporation ^17-20. وتتراوح جزيئات عرض من الأحماض النووية بما في ذلك الأنواع DNA، RNA، ورني للبروتينات، والأصباغ خلايا كتيمة، والأجسام المضادة لأهداف داخل الخلايا ^21،22. بعض الطرائق حدودها بما في ذلك نوع من جزيء التي يمكن إدخالها، ويمكن أن تكون خاصة التحليلات المصب محدودة نظرا لسمية عالية الخلوية، وآليات الضارة للعمل، فعالية منخفضة، أو الكفاءة المقدمة. ترنسفكأيشن، وهو ofteطريقة ن استخدامها للتعبير عن الجينات البكتيرية في خلايا الثدييات، كما يعاني القيد أن بعض أنواع الخلايا المضيفة ذات الصلة، مثل الضامة والخلايا الأولية، هي مقاومة وخاصة تجاه ترنسفكأيشن. أبعد من ذلك، فمن الصعب السيطرة على مستويات البروتين البكتيري تنتج على إدخال DNA الأجانب.

وقد أنشأت الكثير من العمل Electroporation للمن الأحماض النووية في خلايا الثدييات على حد سواء البكتيرية وكأسلوب مختبر مشترك؛ ومع ذلك، هناك أبحاث جارية حول أفضل الطرق لتقديم البروتينات في الخلايا تحت الظروف الفسيولوجية. هي تقارير عن البروتين ترنسفكأيشن واعدة، ولكن تتطلب الكواشف مكلفة والتحسين. الرغبة في إدخال المستجيبات البكتيرية السامة إلى مجموعة واسعة من الأهداف خلية بأقل تكلفة ممكنة أدى بنا إلى النظر في Electroporation للكطريقة لدراسة هذه البروتينات في الجسم الحي.

بروتين ^23-25 ​​Electroporation للهو الوفاءهود لإدخال البروتينات في الخلايا الحية عبر electropermeabilization، المعروف أيضا باسم الكهربائية ترنسفكأيشن أو الكهربائية حقن ^26. وتستخدم هذه التقنية عالية الكثافة النبضات الكهربائية لخلق المسام في أغشية الخلايا. هذه المسام عكسها تسمح الجزيئات التي يتم استبعادها عادة من الفضاء داخل الخلايا لدخول الخلية. على إزالة الحقل الكهربائي الخارجي، لا يمكن للغشاء إعادة الختم، والسماح للخلية للاحتفاظ الجزيئات التي مرت من خلال المسام ^27،28.

تم استخدام electroporator القياسية في هذه الدراسة لتقديم باستمرار المستجيبات البكتيرية في كل من الماوس خلايا تشبه البلاعم والخلايا الظهارية الإنسان. طريقة سريعة وفعالة، وغير مكلفة، مع أي انخفاض ملموس في جدوى الخلوية. يمكن تصور البروتينات أدخلت عن طريق المناعي المجهري أو استخدامها لالمقايسات الفنية. وقد تجلى ذلك باستخدام بروتين الفلورية الخضراء (GFP) كمعيار غير سامة، وكذلكاثنين من السالمونيلا البروتينات المستجيب، SspH1 وGtgE. نقترح البروتين Electroporation للكأداة إضافية في جعبته لدراسة البروتينات الفوعة البكتيرية وظائفهم في الخلايا المضيفة حقيقية النواة.

Protocol

1. إعداد مقدما

1. الفوسفات العقيمة الدافئة مخزنة المالحة (PBS) إلى 37 درجة مئوية.
2. تعديل الدافئ Dulbecco ومتوسطة النسر (DMEM) والحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) تستكمل مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين إلى 37 درجة مئوية. ملاحظة: هذه تمثل وسائل الإعلام النمو الطبيعي (NGM) لخلايا RAW وهيلا على التوالي.

2. إعداد الخلايا

1. تنمو الخلايا 264.7 الخام إلى 70-90٪ confluency في NGM.
   1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
2. تنمو خلايا هيلا إلى 70-90٪ confluency في NGM.
   1. الحفاظ على الخلايا عند 37 درجة مئوية في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
3. قبل جمع، وغسل أحادي الطبقة الخلية مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. جمع الخلايا ما قبل متكدسة في أنبوب مخروطي العقيمة.
   1. كشط بلطف خلايا RAWمع شرطي المطاط في برنامج تلفزيوني، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية.
   2. فصل خلايا هيلا مع 0.25٪ محلول التربسين حتى يظهر الفحص البصري التفكك من سطح الثقافة. على سبيل المثال، استخدام 2 إلى 3 مل لT-75 قارورة. ضبط حجم وفقا لذلك لضمان حل التربسين يغطي سطح النمو بأكمله.
      1. إخماد رد فعل التفكك مع NGM تحتوي على 10٪ FBS.
      2. استخدام ما لا يقل عن ضعف حجم NGM إلى التربسين، مع pipetting لالمتكررة لتفريق تجمعات الخلية.
5. بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
6. resuspend في نفس الحجم كما حل التربسين / إخماد باستخدام برنامج تلفزيوني العقيمة.
7. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو الجسيمات المضادة.
8. بيليه طفيفة الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
9. resuspend في حجم كاف من برنامج تلفزيوني لمدة 5.5 × 10 ^6-6،0 × 10 ⁶ خلية / مل. ملاحظة: على سبيل المثال، واحد T-75 قارورة تسفر approxim¢ الأمر 7.5 × 10 ⁶ خلايا ^(29).
10. حافظ على تعليق خلية على الجليد حتى Electroporation لل.

3. إعداد ل electroporation

1. cuvettes قبل البرد Electroporation لل(0.4 سم الفجوة) على الجليد.
2. بدوره على جهاز Electroporation للوتعيين الجهد إلى 0.3 كيلو فولت.
   ملاحظة: كانت السعة والمقاومة لا إعدادات قابلة للتعديل على موقعنا electroporator (وضعت في 10 μF و 600 Ω من قبل الشركة المصنعة).
3. ملء وحات الانتعاش مع NGM وتتوازن في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية.

4. Electroporation لل

1. وضع 400 ميكرولتر من تعليق خلية في كفيت ما قبل المبردة وإضافة 20 ميكروغرام من البروتين المحدد إلى كوفيت (50 ميكروغرام / مل).
2. نفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لخلط دون الإضرار الخلايا. ملاحظة: يمكن أيضا كفيت أن مقلوب عدة مرات لتخلط جيدا، ولكن لا الماصة صعودا وهبوطا أو دوامة لتجنب إتلاف الخلايا.
خارج الجاف كفيت مع منشفة ورقية أو ممسحة أخرى لتجنب الانحناء الكهربائي في electroporator.
3. عينة Electroporate عند 0.3 كيلو فولت ل1،5-1،7 ميللي ثانية. ملاحظة: كان هذا نموذجي لهذه الدراسة.
4. مباشرة بعد Electroporation للنفض الغبار كفيت بلطف ~ 10 مرات لمزيج دقيق.

5. التصفيحات من الخلايا

1. متجر كفيت مع خلايا electroporated على الجليد حتى جاهزة لوضع لوحات في الانتعاش.
2. بالنسبة لمعظم التحليلات المصب، وغسل الخلايا 1X مع حرارة ما قبل NGM لإزالة البروتين المستجيب دخيلة.
   1. إزالة الخلايا لتحليل وتعليق في 3-5 مل من NGM.
   2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج لمدة 4 دقائق.
   3. resuspend في حجم كاف من NGM لحجم المطلوب لوحة (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق).
3. إزالة كمية مناسبة من الخلايا لتحليل المصب.
   1. مثال 1: لوحة في أطباق أسفل الزجاج لتحليل المجهري.
   2. مثال 2: لوحة كثافة العملياتس البلاستيك زراعة الخلايا لتحليل البروتين مثل التنقيات التقارب.
4. تسمح للخلايا لاسترداد في لوحات معايرتها في ترطيب الهواء 95٪ / 5٪ CO ₂ في الجو 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 4 ساعة.

6. تحليل المجهر

6.1) التثبيت / تلطيخ المناعي

1. غسل الخلايا 1X مع برنامج تلفزيوني العقيمة بعد فترة نقاهة 4 ساعة.
2. إصلاح الخلايا في الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. استخدام ما يكفي من الميثانول لتغطية تماما الخلايا (على سبيل المثال 2 مل لمدة 35 ملم طبق).
3. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني العقيمة.
4. Permeabilize الخلايا مع 0.4٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم.
   1. ضبط طول permeabilization وقوة تريتون X-100 وفقا لحاتمة والمكان من البروتين الهدف. ملاحظة: سوف تحتاج أفضل النتائج يتم تحديدها تجريبيا لكل هدف، ولكن ينبغي أن تكون الشروط المذكورة أعلاه كافية لمعظم جأهداف ytosolic.
5. منع مع 5٪ مصل بقري الزلال (BSA) في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة على RT. على سبيل المثال، استخدم 1 مل لوحة قطرها 35 ملم.
6. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني.
7. احتضان الأجسام المضادة الأولية في الضد حل ملزم (0.1٪ تريتون X-100 و 1٪ BSA في PBS) بين عشية وضحاها في 4   ° C مع هزاز لطيف. على سبيل المثال، استخدم 0.5 مل لوحة قطرها 35 ملم.
   1. اتبع توصيات الشركة الصانعة للأجسام المضادة التخفيف. ملاحظة: على سبيل المثال، تم استخدام ملزم streptavidin العلامة الببتيد (SBP-علامة) الأجسام المضادة في 1: 1،000 التخفيف، في حين تم استخدام الأجسام المضادة PKN1 في 1: 200 التخفيف.
8. غسل 4X مع برنامج تلفزيوني.
9. احتضان مع الأجسام المضادة المناسبة fluorescently مترافق الثانوية في الضد حل ملزم لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.
   1. على سبيل المثال، استخدم اليكسا 488 أو 647 اليكسا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      1. اتبع توصيات الشركة الصانعة للنملةتخفيف ibody. (على سبيل المثال حوالي 1: 1،000 لهذه الدراسة).
   2. إضافة البقع الأخرى حسب الحاجة، على سبيل المثال، 5 ميكرومتر القمح الجرثومية agglutinnin (WGA) مترافق لاليكسا 647 أو دابي وفقا لتوصية الشركة الصانعة، لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
10. غسل 5X مع برنامج تلفزيوني وتخزينها في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء حتى جاهزة للصورة.

6.2) متحد البؤر المجهري وتحليل الصور

1. عينات الصورة على مجهر متحد البؤر مقلوب باستخدام الهدف الغمر 63X النفط.
   1. صورة قناة الخضراء باستخدام سطر 488nm ليزر الأرجون، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 492-542 نانومتر.
   2. صورة القناة الحمراء باستخدام 633 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 640-718 نانومتر.
   3. صورة القناة الزرقاء باستخدام 405 نانومتر ليزر ديود، مع انبعاث عرض النطاق الترددي بين 407-453 نانومتر.
   4. ضمان القناة متعددة ض مداخن تغطي مجمل حجم الخلوية.
2. صور عملية مع المناسبة برامج معالجة الصور.

7. الانجذاب تنقية

1. غسل الخلايا electroporated مرتين مع 4 ° C PBS بعد فترة نقاهة 4 ساعة.
2. ليز مع ~ 1.0 مل من تحلل العازلة (1٪ تريتون X-100 مع كوكتيل مثبط البروتياز والفوسفاتيز المانع في PBS) على الجليد. استخدام مثبطات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. ملاحظة: على سبيل المثال، سواء تم تزويد الفوسفاتيز ومثبطات الأنزيم البروتيني المستخدمة في هذه الدراسة في 100X، ولكن ينبغي الصيغ الأخرى تعمل بشكل جيد على قدم المساواة.
3. كشط فورا الخلايا مع شرطي المطاط وجمع في أنابيب مخروطية.
4. ليز من قبل vortexing قوية وصوتنة. ملاحظة: طرق تحلل أخرى يمكن أن تعمل بنفس القدر أيضا، ولكن سوف تحتاج الكفاءة يتم تحديدها تجريبيا لمدى ملاءمة متطلبات الفحص.
   1. يصوتن 3 × 30 ثانية مع vortexing لفترات متقطعة.
5. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لجمعالحطام الخلوي والمجاميع غير قابلة للذوبان. حفظ طاف.
6. الجمع بين أحجام متساوية (~ 1.0 مل) من electroporated المحللة زنزانة مع 50 ميكرولتر من Streptavidin الراتنج تعليق الاغاروز في 4 درجات مئوية خلال الليل مع نهاية الإفراط في نهاية التناوب. ملاحظة: هذا الراتنج يلتقط البروتين electroporated (والمجمعات المرتبطة بها) عبر ملزم streptavidin الببتيد العلامة تقارب لها.
7. أجهزة الطرد المركزي في 2،500 x ج لمدة 2 دقيقة وتجاهل طاف.
8. غسل مرتين مع 40 مجلدا السرير (~ 1 مل) PBS.
9. إضافة 30 ميكرولتر 4X LDS العازلة تحميل (141 ملي تريس قاعدة، 2٪ LDS، و 10٪ الجلسرين، 0.51 ملي EDTA، 0.22 ملي SERVA الأزرق G، 0.175 ملي الفينول الأحمر، ودرجة الحموضة 8.5)، و 20 ميكرولتر diH ₂ O، و 1 ميكرولتر من 0.5 M تريس (2-carboxyethyl) الفوسفين (TCEP)، والسماح لبعض وحدات التخزين بالبقاء في الخرز.
10. الحرارة على 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة وباردة على الجليد.
11. تدور> 10،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
12. جمع طاف.
13. إجراء طخة غربية باستخدام الأجسام المضادة المناسبة ملاحظة: وإعادة، يتم استخدام المضادة للPKN1 الأجسام المضادة الأولية.

النتائج

كما دليلا الأولي للمفهوم، وقدم النقى البروتين الفلوري الأخضر بنجاح في خلايا الثدييات باستخدام Electroporation لل. هو عرض GFP، تقريبي 27 دينار كويتي بروتين الوزن الجزيئي عادة في خلايا الثدييات (معبرا عادة من DNA البلازميد) كأداة البيولوجيا الجزيئية الخلوية دون سمية كبيرة. وحضنت...

Discussion

وقد تطورت المستجيبات يفرز من البكتيريا المسببة للأمراض على العمل ضمن بيئة الخلية المضيفة، وبالتالي فإنه من المفيد لدراستها في الموقع الطبيعي داخل المضيف. إدخال مؤثرات محددة من الفائدة في الخلايا المضيفة تسمح للتفاعلات الممرض في استضافة ذات الصلة لدراستها في ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic