La electroporación de efectores bacterianos funcionales en células de mamífero

Resumen

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Resumen

El estudio de las interacciones proteína en el contexto de las células vivas puede generar información crítica acerca de la localización, la dinámica y socios que interactúan. Esta información es particularmente valioso en el contexto de la interacción huésped-patógeno. Muchas proteínas de patógenos funcionan dentro de células huésped en una variedad de manera tal, que permite la evasión del sistema inmune del huésped y la supervivencia en el entorno intracelular. Para estudiar estas interacciones proteína-patógeno de la célula huésped, varios enfoques se utilizan comúnmente, incluyendo: la infección in vivo con una cepa que expresa una proteína etiquetada o mutante, o la introducción de genes de patógenos a través de la transfección o transducción. Cada uno de estos enfoques tiene ventajas y desventajas. Se buscó un medio para introducir directamente las proteínas exógenas en células. La electroporación se utiliza comúnmente para introducir ácidos nucleicos en células, pero ha sido más raramente aplicado a las proteínas, aunque la base biofísica es exactamente el mismo.A electroporador estándar fue utilizado para introducir efectores bacterianos-etiquetados por afinidad en células de mamífero. Macrófagos epiteliales y ratón Humanos fueron cultivadas por métodos tradicionales, extraído, y se colocaron en 0,4 cm cubetas de electroporación brecha con una proteína exógena bacteriano patógeno de interés (por ejemplo, Salmonella Typhimurium GtgE). Después de la electroporación (0,3 kV) y un corto (4 h) período de recuperación, la proteína intracelular se verificó mediante el etiquetado con fluorescencia la proteína a través de su etiqueta de afinidad y el examen de la distribución espacial y temporal por microscopía confocal. La proteína electroporación también ha demostrado ser funcional dentro de la célula y capaz de tráfico subcelular correcta y la interacción proteína-proteína. Mientras que las proteínas exógenas tendían a acumularse en la superficie de las células, las muestras electroporadas tenían grandes aumentos en la concentración intracelular de efector con respecto a la incubación solo. El protocolo es simple y lo suficientemente rápido para ser hecho en apmoda an paralelo, lo que permite la caracterización de alto rendimiento de las proteínas de patógenos en células huésped incluyendo focalización y la función de las proteínas de virulencia subcelular.

Introducción

Muchas bacterias Gram-negativas emplean sistemas de secreción especializados para inyectar proteínas relacionados con la virulencia (referidos como efectores) directamente en células huésped ^1-5. Estos efectores tienen una amplia gama de funciones biológicas que incluyen: la supresión de la inmunidad del huésped, cambios en el citoesqueleto, la modificación de tráfico y la señalización intracelular, los cambios transcripcionales, y las alteraciones del proteasoma anfitrión ^6-9. Las funciones de algunos efectores son conocidos, sin embargo, los objetivos de acogida y acción bioquímica (s) de muchos otros queda por determinar. Si bien la comparación de tipo salvaje y las infecciones bacterianas recombinantes es un enfoque válido para estudiar los mecanismos de virulencia efector intracelular, a menudo es ventajoso introducir un efector individuo en la célula huésped. Así, los métodos simples para la introducción y la caracterización de proteínas efectoras bacterianas en el contexto de las células huésped es altamente deseable.

Simplificando el análisis wi experimentalº un solo efector es crítica como en otros efectores pueden tener funciones opuestas o redundantes. Para llevar a cabo esta simplificación, los investigadores han introducido previamente macromoléculas en las células mediante muchos métodos diferentes, incluyendo la transducción viral ^10, la microinyección ^11, carga por raspado ^12,13, fusión celular con microinyección químicamente inducido ^14, proteína patentada reactivos "transfección" ^15, precipitaciones de fosfato de calcio ^16, y la electroporación ^17-20. Las moléculas introducidas se extienden a partir de ácidos nucleicos que incluyen las especies de ADN, ARN, y RNAi a las proteínas, tintes impermeables a las células, y los anticuerpos para dianas intracelulares ^21,22. Algunos métodos tienen limitaciones incluyendo el tipo de macromolécula que se puede introducir, y en particular análisis aguas abajo pueden ser limitadas debido a la alta toxicidad celular, los mecanismos dañinos de la acción, baja eficacia o eficiencia de introducción. La transfección, un oftemétodo n-utilizado para expresar genes bacterianos en células de mamíferos, también sufre la limitación de que algunos tipos de células de acogida pertinentes, como los macrófagos y las células primarias, son particularmente resistentes a la transfección. Más allá de esto, es difícil de controlar los niveles de proteína bacteriana producida tras la introducción de ADN extraño.

Mucho trabajo se ha establecido la electroporación de ácidos nucleicos en ambas células bacterianas y de mamíferos como una técnica de laboratorio común; Sin embargo, hay investigaciones en curso en los mejores métodos para la entrega de proteínas en las células en condiciones fisiológicas. Informes sobre la transfección de proteínas son prometedores, pero requieren reactivos y optimización caros. El deseo de introducir efectores bacterianos potencialmente tóxicos en una amplia variedad de objetivos celulares con un coste mínimo nos llevó a considerar la electroporación como un método para el estudio de estas proteínas in vivo.

Proteína electroporación ^23-25 ​​es un conocióhod para introducir las proteínas en las células vivas a través de electropermeabilización, también conocido como electro-transfección o electro-inyección ^26. Esta técnica utiliza pulsos eléctricos de alta intensidad para crear poros en las membranas celulares. Estos poros reversibles permiten macromoléculas que normalmente están excluidos desde el espacio intracelular para entrar en la célula. Tras la eliminación del campo eléctrico externo, la membrana puede volver a cerrar, permitiendo que la célula para retener moléculas que pasan a través de los poros ^27,28.

A electroporador estándar se utilizó en este estudio para introducir constantemente efectores bacterianos en ambos ratón células similares a macrófagos y células epiteliales humanas. El método es rápido, eficiente y de bajo costo, sin disminución apreciable en la viabilidad celular. Las proteínas introducidas se pueden visualizar a través de microscopía de inmunofluorescencia o se utilizan para ensayos funcionales. Esto ha sido demostrado utilizando la proteína fluorescente verde (GFP) como un estándar no tóxico, así comodos proteínas efectoras Salmonella, SspH1 y GtgE. Proponemos electroporación proteína como una herramienta adicional en el repertorio para el estudio de las proteínas de virulencia bacteriana y sus funciones en células huésped eucariotas.

Protocolo

1. Prepárese por adelantado

1. Cálido tampón fosfato salino (PBS) a 37 ° C.
2. Modificación caliente de Dulbecco de medio de Eagle (DMEM) y Medio Esencial Mínimo (MEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 100 IU / ml de penicilina, y 100 mg / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estos representan Crecimiento Normal Media (NGM) para células RAW y HeLa, respectivamente.

2. Preparación de las células

1. Se cultivan las células RAW 264.7 a 70-90% de confluencia en NGM.
   1. Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO ₂ atmósfera húmeda.
2. Se cultivan las células HeLa a 70-90% de confluencia en NGM.
   1. Mantener las células a 37 ° C en un 95% de aire / 5% de CO ₂ atmósfera húmeda.
3. Antes de la recolección, lave monocapa de células una vez con PBS estéril.
4. Recoger las células pre-confluentes en un tubo cónico estéril.
   1. Raspar suavemente las células RAWcon un policía de caucho en PBS, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares.
   2. Separar las células HeLa con solución de tripsina al 0,25% hasta que el examen visual muestra la disociación de la superficie de cultivo. Por ejemplo, utilizar 2 a 3 ml de un matraz T-75. Ajuste el volumen en consecuencia para garantizar solución de tripsina cubre toda la superficie de crecimiento.
      1. Se inactiva la reacción de disociación con NGM que contiene 10% de FBS.
      2. Utilice al menos dos veces el volumen de NGM a la tripsina, con pipeteo repetido para dispersar agregaciones celulares.
5. Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
6. Resuspender en mismo volumen que la solución de tripsina / enfriamiento utilizando PBS estéril.
7. Contar las células utilizando un hemocitómetro o un contador de partículas.
8. Ligeramente sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
9. Resuspender en volumen adecuado de PBS durante 5,5 x 10 ⁶ a 6,0 x 10 ⁶ células / ml. Nota: Por ejemplo, un matraz T-75 producirá aproximadam ente 7,5 x 10 ⁶ células ^29.
10. Mantenga suspensión de células en hielo hasta la electroporación.

3. Preparación para la electroporación

1. Cubetas Pre protección contra el frío de electroporación (brecha de 0,4 cm) en el hielo.
2. Encienda el aparato de electroporación y ajustar la tensión de 0,3 kV.
   NOTA: La capacitancia y la resistencia no eran configuraciones ajustables en nuestro electroporador (fijado en 10 mF y 600 Ω por el fabricante).
3. Llenar placas de recuperación con NGM y equilibrar en humidificado 95% de aire / 5% de CO ₂ atmósfera a 37 ° C.

4. La electroporación

1. Coloque 400 l de suspensión celular en la cubeta previamente enfriada y añadir 20 g de proteína seleccionada para la cubeta (50 mg / ml).
2. Cubeta Flick suavemente ~ 10 veces para mezclar sin dañar las células. Nota: La cubeta también puede invertirse varias veces para mezclar bien, pero no pipetear hacia arriba y hacia abajo o vortex para evitar daños en las células.
3. fuera seco de cubeta con una toalla de papel u otro limpiador para evitar la formación de arco eléctrico en el electroporador.
4. Muestra electroporar a 0,3 kV para 1.5 a 1.7 ms. Nota: Esto era típico para este estudio.
5. Inmediatamente después de la electroporación película cubeta suavemente ~ 10 veces para mezclar a fondo.

5. Chapado de células

1. Cubeta tienda con células electroporadas en hielo hasta que esté listo para colocar en placas de recuperación.
2. Para la mayoría de los análisis posteriores, se lavan las células 1x con pre-calentado NGM para eliminar la proteína efectora extraña.
   1. Eliminar las células para su análisis y suspender en 3-5 ml de NGM.
   2. Sedimentar las células por centrifugación a 900 xg durante 4 min.
   3. Volver a suspender en un volumen adecuado de NGM por tamaño de la placa deseada (por ejemplo, 2 ml de 35 mm plato).
3. Retire cantidad adecuada de células para el análisis de aguas abajo.
   1. Ejemplo 1: placa en placas de fondo de cristal para el análisis de microscopía.
   2. Ejemplo 2: Placa de into de plástico de cultivo celular para el análisis de proteínas tales como purificaciones de afinidad.
4. Permitir que las células se recuperen en placas equilibrada en humidificado 95% de aire / 5% de CO ₂ atmósfera a 37 ° C durante al menos 4 h.

6. Análisis de Microscopía

6.1) Fijación / inmunofluorescencia tinción

1. Lavar las células con PBS 1x estéril después de un período de recuperación de 4 horas.
2. Fijar las células en 100% de metanol durante 2 min a temperatura ambiente. Use suficiente metanol para cubrir completamente las células (por ejemplo, 2 ml por placa de 35 mm).
3. Lavar 3 veces con PBS estéril.
4. Permeabilizar las células con 0,4% Triton X-100 en PBS durante 15 min. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro.
   1. Ajuste la longitud de permeabilización y la fuerza de Triton X-100 de acuerdo con epítopo y la ubicación de proteína diana. Nota: se necesitan mejores resultados debe determinarse empíricamente para cada objetivo, sin embargo las condiciones anteriores deben ser adecuados para la mayoría cobjetivos ytosolic.
5. Bloque con 5% albúmina de suero bovino (BSA) en PBS durante 1 hora a RT. Por ejemplo, utilizar 1 ml de una placa de 35 mm de diámetro.
6. Lavar 3 veces con PBS.
7. Incubar anticuerpo primario en solución de unión del anticuerpo (0,1% Triton X-100 y 1% de BSA en PBS) durante la noche a 4   ° C con agitación suave. Por ejemplo, use 0.5 ml para una placa de 35 mm de diámetro.
   1. Siga las recomendaciones del fabricante para la dilución de anticuerpos. Nota: Por ejemplo, se utilizó el anticuerpo etiqueta de péptido de unión a estreptavidina-(SBP-tag) a 1: 1000 dilución, mientras que el anticuerpo PKN1 se utilizó a 1: 200 dilución.
8. Lave 4 veces con PBS.
9. Incubar con el anticuerpo secundario conjugado fluorescente apropiada en solución de unión del anticuerpo durante 1 hora a temperatura ambiente, protegido de la luz.
   1. Por ejemplo, utilice Alexa 488 o Alexa 647 durante 1 hora a temperatura ambiente.
      1. Siga las recomendaciones del fabricante para la hormigadilución ibody. (Por ejemplo aproximadamente 1: 1000 para este estudio).
   2. Añadir otras manchas según sea necesario, por ejemplo, 5 mM de germen de trigo agglutinnin (WGA) conjugado con Alexa 647 o DAPI según la recomendación del fabricante, durante 1 hora a temperatura ambiente.
10. Lave 5x con PBS y se almacena a 4 ° C, protegido de la luz hasta el momento de la imagen.

6.2) Microscopía Confocal y Análisis de Imágenes

1. Muestras de imagen en un microscopio confocal invertido utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 63x.
   1. Imagen canal verde utilizando la línea de 488 nm de un láser de argón, con emisión de ancho de banda entre 492 a 542 nm.
   2. Imagen canal rojo usando un láser de diodo de 633 nm, con emisión de ancho de banda entre 640 a 718 nm.
   3. Imagen azul canal utilizando un láser de diodo de 405 nm, con emisión de ancho de banda entre 407 a 453 nm.
   4. Asegúrese de que el canal múltiple z-pilas cubren la totalidad del volumen celular.
2. Procesar imágenes con software de procesamiento de imagen correspondiente.

Purificación 7. Affinity

1. Lavar las células electroporadas dos veces con PBS 4 ° C después de un período de recuperación de 4 hr.
2. Lisan con ~ 1,0 ml de tampón de lisis (1% Triton X-100 con cóctel inhibidor de la proteasa e inhibidor de la fosfatasa en PBS) en hielo. Utilice inhibidores de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Nota: Por ejemplo, tanto los inhibidores de la fosfatasa y de la proteasa utilizados en este estudio fueron suministrados a 100X, pero otras formulaciones deben funcionar igualmente bien.
3. Inmediatamente raspar las células con goma de policía y recoger en tubos cónicos.
4. Lisan mediante agitación vigorosa y sonicación. Nota: Otros métodos de lisis pueden funcionar igual de bien, pero necesitarán la eficiencia por determinar empíricamente acerca de la adecuación de los requisitos de ensayo.
   1. Sonicar 3 x 30 segundos con agitación con vórtex intermitente.
5. Centrifugar a 10000 xg durante 10 min a 4 ° C para recogerrestos celulares y agregados insolubles; guardar el sobrenadante.
6. Combinar volúmenes iguales (~ 1,0 ml) de lisado de células a electroporación con 50 l de estreptavidina suspensión de resina de agarosa a 4 ° C durante la noche con rotación de extremo a extremo. Nota: Esta resina captura la proteína de electroporación (y complejos asociados) a través de su péptido etiqueta de afinidad de unión a estreptavidina.
7. Centrifugar a 2500 xg durante 2 min y desechar el sobrenadante.
8. Lavar dos veces con 40 volúmenes de lecho (~ 1 ml) PBS.
9. Añadir 30 l de 4x LDS tampón de carga (141 mM de base Tris, 2% LDS, 10% de glicerol, EDTA 0,51 mM, 0,22 mM SERVA azul G, fenol 0,175 mM rojo, pH 8,5), 20 l DIH ₂ O y 1 l de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), lo que permite algo de volumen permanezca en perlas.
10. Se calienta a 95 ° C durante 10 min y enfriar en hielo.
11. Girar> 10.000 xg a 4 ° C durante 5 min.
12. Recoger el sobrenadante.
13. Realizar una transferencia Western utilizando anticuerpos apropiados Nota: Élre, se utiliza anti-PKN1 anticuerpo primario.

Resultados

Como prueba inicial de concepto, proteína fluorescente verde purificado se introdujo con éxito en células de mamífero utilizando electroporación. GFP, un aproximado de 27 kD una proteína de peso molecular se introduce comúnmente en células de mamífero (normalmente expresadas a partir de ADN del plásmido) como una herramienta de biología molecular sin toxicidad celular significativa. Las células HeLa se incubaron (Figura 1A) o electroporación (Figura 1B) con 25 g GFP / ml, s...

Discusión

Efectores secreta a partir de bacterias patógenas han evolucionado para funcionar en el entorno de la célula huésped y por lo tanto es útil para estudiar in situ dentro del huésped. Introducción de efectores específicos de interés en las células huésped permite las interacciones patógeno-hospedador relevantes para ser estudiados en forma aislada, sin interferencia de otras proteínas bacterianas. El objetivo era explorar la electroporación como un medio para introducir proteínas efectoras bacterian...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic