Électroporation d'effecteurs bactériens fonctionnels dans des cellules mammifères

Résumé

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Résumé

L'étude des interactions entre protéines dans le contexte de cellules vivantes peut générer des informations essentielles sur la localisation, la dynamique et partenaires d'interaction. Cette information est particulièrement utile dans le contexte des interactions hôte-pathogène. De nombreuses protéines de pathogènes fonctionnent dans des cellules hôtes dans une variété de telle sorte que, ce qui permet l'évasion du système immunitaire de l'hôte et la survie dans l'environnement intracellulaire. Pour étudier ces interactions hôte-pathogène cellulaires protéiques, plusieurs approches sont couramment utilisés, y compris: l'infection in vivo avec une souche exprimant une protéine marquée ou mutant, ou l'introduction de gènes de pathogènes par transfection ou transduction. Chacune de ces approches a ses avantages et ses inconvénients. Nous avons cherché un moyen d'introduire directement des protéines exogènes dans les cellules. L'électroporation est couramment utilisé pour introduire des acides nucléiques dans les cellules, mais a été plus rarement appliquée aux protéines bien que la base biophysique est exactement le même.Une électroporation standard a été utilisée pour introduire des effecteurs bactériens affinité marqué dans des cellules de mammifères. Cellules macrophages épithéliales humaines et de souris ont été cultivées par des méthodes traditionnelles, détachés, et placés dans 0,4 cm cuvettes d'électroporation écart avec une protéine bactérienne pathogène exogène d'intérêt (par exemple Salmonella Typhimurium GtgE). Après l'électroporation (0,3 kV) et une courte période de récupération (4 h), la protéine intracellulaire a été vérifiée par marquage par fluorescence de la protéine par l'intermédiaire de son marqueur d'affinité et en examinant la distribution spatiale et temporelle par microscopie confocale. La protéine a également été montré une électroporation pour être fonctionnel dans la cellule et capable de trafic intracellulaire correct et l'interaction protéine-protéine. Bien que les protéines exogènes ont tendance à se accumuler sur la surface des cellules, les échantillons ont électroporées fortes augmentations de la concentration intracellulaire effecteur par rapport à incubation seul. Le protocole est simple et assez rapide pour être fait dans apParallèle mode, permettant la caractérisation à haut débit de protéines pathogènes dans des cellules hôtes, y compris le ciblage et la fonction des protéines de virulence subcellulaire.

Introduction

De nombreuses bactéries Gram-négatives utilisent des systèmes de sécrétion spécialisés pour injecter des protéines liées à la virulence (appelés effecteurs) directement dans les cellules hôtes ^1-5. Ces effecteurs ont une large gamme de fonctions biologiques, notamment: la suppression de l'immunité de l'hôte, des modifications cytosquelettiques, la modification du trafic intracellulaire et la signalisation, les changements transcriptionnels et des altérations de protéasome hôte ^9.6. Les fonctions d'effecteurs certains sont connus, mais les cibles de l'hôte et de l'action biochimique (s) de nombreux autres restent à déterminer. En comparant de type sauvage et les infections bactériennes recombinantes est une approche valable pour étudier les mécanismes effecteurs de virulence intracellulaires, il est souvent avantageux d'introduire un effecteur individu dans la cellule hôte. Ainsi, des méthodes simples pour l'introduction et la caractérisation de protéines effectrices bactériennes dans le contexte de cellules hôtes est hautement souhaitable.

Simplifier l'analyse expérimentale wie un seul effecteur est essentiel que d'autres effecteurs peuvent avoir des fonctions opposées ou redondantes. Pour réaliser cette simplification, les chercheurs ont déjà présenté des macromolécules dans des cellules par de nombreux procédés différents, y compris la transduction virale ^10, la micro-injection ^11, gratter chargement ^12,13, la fusion cellulaire avec la micro-injection induite chimiquement ^14, protéine de propriété «transfection» réactifs ^15, des précipitations de phosphate de calcium ^{16, 17 à 20} et l'électroporation. Les molécules introduites vont d'acides nucléiques, y compris les espèces de l'ADN, l'ARN, les protéines et d'ARNi, des colorants cellulaires imperméable, et des anticorps pour des cibles intracellulaires ^21,22. Certaines méthodes ont des limites, y compris le type de macromolécule qui peut être introduite, et notamment des analyses en aval peuvent être limitées en raison de la toxicité élevée cellulaire, mécanismes dommageables d'action, faible efficacité, ou l'efficacité d'introduction. Transfection, un ofteProcédé de n-utilisée pour l'expression de gènes bactériens dans les cellules de mammifères, souffre également que la limitation de certains types de cellules hôtes appropriées, telles que les macrophages et les cellules primaires, sont particulièrement résistants à la transfection. Au-delà, il est difficile de contrôler les niveaux de protéine bactérienne produite lors de l'introduction de l'ADN étranger.

Beaucoup de travail a établi électroporation d'acides nucléiques dans les cellules bactériennes et de mammifères comme une technique de laboratoire commun; Cependant, il ya des recherches en cours sur les meilleures méthodes pour délivrer des protéines dans les cellules dans des conditions physiologiques. Rapports sur les protéines transfection sont prometteurs, mais nécessitent des réactifs coûteux et optimisation. Le désir d'introduire effecteurs bactériens potentiellement toxiques dans une grande variété de cibles cellulaires avec un coût minimal nous a conduit à envisager l'électroporation comme une méthode pour l'étude de ces protéines in vivo.

Protein électroporation ^23-25 ​​est une rencontreHod d'introduire des protéines dans des cellules vivantes par électroperméabilisation, aussi connu comme électro-transfection ou électro-injection ^26. Cette technique utilise des impulsions à haute intensité de courant pour créer des pores dans les membranes cellulaires. Ces pores réversibles permettent macromolécules qui sont normalement exclues de l'espace intracellulaire d'entrer dans la cellule. Lors de l'enlèvement du champ électrique externe, la membrane peut refermer, permettant à la cellule de retenir les molécules qui sont passés à travers les pores ^27,28.

Un électroporateur standard a été utilisé dans cette étude pour introduire systématiquement effecteurs bactériens dans les deux cellules de type macrophage souris et des cellules épithéliales humaines. La méthode est rapide, efficace et peu coûteux, sans diminution sensible de la viabilité cellulaire. Les protéines introduites peuvent être visualisées par microscopie d'immunofluorescence ou utilisés pour des tests fonctionnels. Cela a été démontré en utilisant la protéine fluorescente verte (GFP) en tant que norme non toxique, ainsi quedeux protéines effectrices Salmonella, SspH1 et GtgE. Nous proposons protéines électroporation comme un outil supplémentaire dans le répertoire pour l'étude des protéines de virulence bactérienne et leurs fonctions dans des cellules hôtes eucaryotes.

Protocole

1. Préparez à l'avance

1. Chaud stérile saline tamponnée phosphate (PBS) à 37 ° C.
2. Modification de Dulbecco chaud de milieu de Eagle (DMEM) et le milieu essentiel minimal (MEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), 100 UI / ml de pénicilline et 100 ug / ml de streptomycine à 37 ° C. Remarque: Ils représentent croissance normale Media (NGM) pour les cellules RAW et HeLa respectivement.

2. Préparation des cellules

1. Cultiver les cellules RAW 264.7 à 70-90% de confluence dans NGM.
   1. Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d'air / 5% _de CO2 atmosphère humidifiée.
2. Cultiver les cellules HeLa à 70-90% de confluence dans NGM.
   1. Maintenir les cellules à 37 ° C dans 95% d'air / 5% _de CO2 atmosphère humidifiée.
3. Avant le prélèvement, laver monocouche cellulaire une fois avec PBS stérile.
4. Recueillir des cellules pré-confluentes dans un tube conique stérile.
   1. Grattez délicatement les cellules RAWavec une spatule en caoutchouc dans du PBS, avec pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires.
   2. Détacher les cellules HeLa avec une solution de trypsine à 0,25% jusqu'en examen visuel montre une dissociation de la surface de culture. Par exemple, utiliser 2-3 ml pour un flacon T-75. Réglez le volume en conséquence pour assurer une solution de trypsine couvre toute la surface de croissance.
      1. Étancher réaction de dissociation avec NGM contenant 10% de FBS.
      2. Utiliser au moins deux fois le volume de NGM à la trypsine, avec un pipetage répété pour disperser les agrégations cellulaires.
5. Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
6. Remettre en suspension dans même volume que solution de trypsine / de trempe en utilisant du PBS stérile.
7. Compter les cellules en utilisant un hémocytomètre ou compteur de particules.
8. Légèrement sédimenter les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
9. Remettre en suspension dans un volume adéquat de solution PBS pendant 5,5 x 10 ⁶ à 6,0 x 10 ⁶ cellules / ml. Remarque: Par exemple, un flacon T-75 donnera Approximment 7,5 x 10 ⁶ cellules ^29.
10. Gardez la suspension de cellules sur la glace jusqu'à l'électroporation.

3. Préparation à électroporation

1. Cuvettes pré-refroidissement électroporation (0,4 cm d'écart) sur la glace.
2. Allumez appareil d'électroporation et de régler la tension à 0,3 kV.
   REMARQUE: La capacité et la résistance ne étaient pas les paramètres réglables sur notre électroporateur (fixé à 10 pF et 600 Ω par le fabricant).
3. Remplissez plaques de recouvrement avec NGM et équilibrer dans l'air humidifié / 5% de CO ₂ atmosphère de 95% à 37 ° C

4. électroporation

1. Placer 400 ul de suspension de cellules dans la cuve de pré-réfrigérés et ajouter 20 pg de protéine sélectionnée à cuvette (50 ug / ml).
2. Flick cuvette doucement à environ 10 fois pour mélanger sans endommager les cellules. Remarque: La cuvette peut aussi être inversé plusieurs fois pour bien mélanger, mais Ne pas pipeter de haut en bas ou vortex pour éviter d'endommager les cellules.
3. l'extérieur sec de cuvette avec une serviette en papier ou autre glace pour éviter un arc électrique dans la électroporateur.
4. Échantillon électroporation à 0,3 kV pour 1.5 à 1.7 ms. Remarque: Ce était typique pour cette étude.
5. Immédiatement après l'électroporation film cuvette doucement ~ 10 fois pour bien mélanger.

5. Placage des cellules

1. cuvette de magasin avec des cellules électroporées sur la glace jusqu'au moment de placer dans des plaques de recouvrement.
2. Pour la plupart des analyses en aval, laver les cellules avec 1x préchauffé NGM pour éliminer les protéines effectrices étrangère.
   1. Éliminer les cellules d'analyse et de suspendre 3-5 ml de NGM.
   2. Pellet les cellules par centrifugation à 900 g pendant 4 min.
   3. Remettre en suspension dans un volume adéquat de NGM pour la taille de la plaque désirée (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm).
3. Retirer quantité appropriée de cellules pour l'analyse en aval.
   1. Exemple 1: plaque dans des boîtes à fond de verre pour analyse au microscope.
   2. Exemple 2: Plaque into plastique de culture de cellules pour l'analyse des protéines telles que des purifications par affinité.
4. Laisser les cellules de récupérer en plaques équilibrée dans humidifié 95% d'air / 5% de CO ₂ atmosphère à 37 ° C pendant au moins 4 heures.

6. Microscopie Analyse

6.1) La fixation / coloration par immunofluorescence

1. Laver les cellules avec du PBS 1x stérile après la période de récupération de 4 heures.
2. Fixer les cellules de methanol à 100% pendant 2 min à la température ambiante. Utiliser suffisamment de méthanol pour couvrir complètement cellules (par exemple 2 ml pour boîte de 35 mm).
3. Laver 3x avec PBS stérile.
4. Perméabiliser les cellules avec 0,4% de Triton X-100 dans du PBS pendant 15 min. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
   1. Ajuster la longueur de perméabilisation et la force de Triton X-100 selon l'épitope et la localisation de la protéine cible. Remarque: Les meilleurs résultats devront être déterminé de manière empirique pour chaque cible, mais les conditions ci-dessus doivent être adéquates pour la plupart cytosolic cibles.
5. Bloquer avec 5% de sérum-albumine bovine (BSA) dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante. Par exemple, en utilisant 1 ml pour une plaque de 35 mm de diamètre.
6. Laver 3x avec PBS.
7. Incuber anticorps primaire dans la solution de liaison d'anticorps (0,1% de Triton X-100 et 1% de BSA dans du PBS) pendant une nuit à 4   ° C avec doux balancement. Par exemple, utiliser 0,5 ml pour une boîte de 35 mm de diamètre.
   1. Suivez les recommandations du fabricant pour l'anticorps dilution. Remarque: Par exemple, l'anticorps marqueur peptidique de liaison à la streptavidine (SBP-tag) a été utilisé à 1: 1000 dilution, tandis que l'anticorps a été utilisé à PKN1 dilution 1: 200.
8. Laver 4x avec PBS.
9. Incuber avec l'anticorps approprié fluorescence conjugué secondaire en solution de liaison d'anticorps pendant 1 heure à température ambiante, à l'abri de la lumière.
   1. Par exemple, utiliser Alexa 488 ou Alexa 647 pendant 1 heure à température ambiante.
      1. Suivez les recommandations du fabricant pour antibody dilution. (Par exemple environ 1: 1000 pour la présente étude).
   2. Ajouter d'autres taches, au besoin, par exemple, 5 uM germe de blé agglutinnin (WGA) conjugué à Alexa 647 ou DAPI selon les recommandations du fabricant, pendant 1 heure à température ambiante.
10. Laver 5x avec du PBS et conserver à 4 ° C, à l'abri de la lumière jusqu'au moment de l'image.

6.2) microscopie confocale et analyse d'images

1. échantillons de l'image sur un microscope confocal inversé en utilisant un objectif à immersion 63x d'huile.
   1. canal vert d'image en utilisant la ligne de 488 nm d'un laser à l'argon, avec une bande passante de 492 à 542 nm émission entre.
   2. Image canal rouge utilisant une diode laser de 633 nm, avec une bande passante de 640 à 718 nm émission entre.
   3. canal bleu de l'image en utilisant une diode laser à 405 nm, avec une bande passante de 407 à 453 nm émission entre.
   4. Assurer le canal multiples z piles couvrent l'intégralité du volume cellulaire.
2. Traiter les images avec un logiciel de traitement d'image approprié.

7. Affinity Purification

1. Laver les cellules électroporées deux fois avec 4 ° C PBS après la période de récupération de 4 heures.
2. Lyse à ~ 1,0 ml de tampon de lyse (1% de Triton X-100 avec un cocktail inhibiteur de protease et l'inhibiteur de la phosphatase dans du PBS) sur de la glace. Utilisez inhibiteurs selon les instructions du fabricant. Remarque: Par exemple, à la fois les inhibiteurs de la protéase et la phosphatase utilisées dans cette étude ont été fournis à 100x, mais d'autres formulations devraient fonctionner aussi bien.
3. Rapidement gratter cellules avec spatule en caoutchouc et de recueillir dans des tubes coniques.
4. Lyse par vortex vigoureux et sonication. Note: D'autres méthodes de lyse peuvent travailler tout aussi bien, mais l'efficacité devront être déterminée empiriquement quant à la pertinence des exigences de dosage.
   1. Sonication 3 x 30 s avec un vortex intermittent.
5. Centrifuger à 10 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour recueillirdes débris cellulaires et des agrégats insolubles; sauver le surnageant.
6. Moissonneuse volumes égaux (~ 1,0 ml) de lysat de cellules à une électroporation avec 50 ul de streptavidine agarose suspension de résine à 4 ° C pendant une nuit avec rotation par rapport à l'extrémité extrémité. Note: Cette résine capture la protéine électroporation (et complexes associés) par l'intermédiaire de son peptide marqueur d'affinité de liaison à la streptavidine.
7. Centrifuger à 2500 g pendant 2 min et éliminer le surnageant.
8. Laver deux fois avec 40 volumes de lit (~ 1 ml) PBS.
9. Ajouter 30 ul 4x LDS tampon de charge (141 mM de base Tris, 2% SI, 10% de glycerol, EDTA 0,51, 0,22 mM SERVA Bleu G, 0,175 mM de rouge de phénol, à pH 8,5), 20 ul diH ₂ O, et 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxyéthyl) phosphine (TCEP), ce qui permet un certain volume pour rester en perles.
10. Chauffer à 95 ° C pendant 10 min et laisser refroidir sur glace.
11. Spin> 10 000 xg à 4 ° C pendant 5 min.
12. Recueillir surnageant.
13. Effectuer un western blot utilisant des anticorps appropriés Remarque: Ilre, anticorps primaire anti-PKN1 est utilisé.

Résultats

Comme une preuve initiale de concept, la protéine fluorescente verte purifié a été introduit avec succès dans des cellules de mammifères en utilisant l'électroporation. GFP, environ un 27 kD d'une protéine de poids moléculaire sont couramment introduits dans des cellules de mammifères (normalement exprimées à partir d'ADN de plasmide) comme un outil de biologie moléculaire sans toxicité cellulaire significative. Des cellules HeLa ont été incubées (figure 1A) ou par électrop...

Discussion

Effecteurs sécrétée par les bactéries pathogènes ont évolué pour fonctionner dans l'environnement de la cellule hôte et il est donc utile de les étudier in situ dans l'hôte. Introduction d'effecteurs spécifiques d'intérêt dans des cellules hôtes permet les interactions pathogène-hôte pertinentes à étudier dans l'isolement, sans interférence avec d'autres protéines bactériennes. Le but était d'explorer électroporation comme un moyen d'introduire des protéin...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic